单向双向免疫琼脂扩散
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实验方法
打孔:将琼脂板置于模板上,在同一直线上用打孔器打孔5个,孔距10mm。 用PBS缓冲液稀释不同浓度的标准参考蛋白。(牛免疫球蛋白IgG,应根据制品
说明进行稀释) 加样:将已稀释的不同浓度的标准参考蛋白依次用微量加样器每孔加入10ul。
(注意:每一稀释度均应更换塑料吸头)。
实验方法
将加样的琼脂板放湿盒中,置37℃温箱,24小时后观察结果。 用尺子测量并记录沉淀环直径,然后以沉淀环直径为纵座标,以标准参考蛋白
来自百度文库意事项
加样时,吸取每份标本均应更换塑料吸头; 实际检测过程中,标准曲线必须与样品测定同时制备; 孵育时间应控制在24~48h,时间太短可能产生不了沉淀线,时间太长会造成沉
淀线的扩散。
双向免疫琼脂扩散
实验原理
可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散,彼此相遇后形成一定类型的特异 性沉淀线。
量(单位/ml)为横座标,绘制成标准曲线。
实验结果
用尺子测量并记录沉淀环直径,然后以沉淀环直径为纵座标,以标准参考蛋白量 (单位/ml)为横座标,绘制成标准曲线。
实验结果
注意事项
制备抗体琼脂板时,琼脂温度必须严格控制,温度太低琼脂会凝固,太高则会影 响抗体的活性;
加样孔内的琼脂应挑干净,切不可损坏孔的边缘,确保每孔的液面基本一致; 加样量一定要精确,并且不能逸出孔外,否则结果不好观察;
沉淀环直径的大小与抗原含量成正比,用标准抗原制成标准曲线,从标准曲线上, 可以查出待检样品中抗原的含量。
实验原理
标准品抗原浓度测定 1.测定沉淀环直径 2.在标准曲线上查找相应抗原浓度
不同病人抗原浓度测定
绘制标准曲线
实验方法
(一)标准曲线的制备
制作琼脂板所需要的1%盐水琼脂(4mL)。 首先分装其1/2量的2%盐水琼脂,溶化后置56℃水浴中平衡温度备用。
火箭免疫电泳
单向免疫琼脂扩散
实验原理
将适量的抗体均匀混入琼脂内制成琼脂板,打孔,在孔中加入一定量的待测抗原, 抗原向四周呈辐射状扩散,与抗体相遇,在比例合适时形成白色沉淀环。
实验原理
此方法用已知的抗体测未知的抗原。由于抗体已与凝胶混合,不会再扩散,仅抗 原从小孔向四周扩散,因此称为单向琼脂扩散试验。
检测未知抗原或抗体
ABC DEF
Ag Ab
A: 浓度Ag、Ab及扩散率近似; B:浓度Ag、Ab近似,扩散率Ag>Ab ; C:浓度Ag、Ab近似,扩散率Ag<Ab ; D:浓度Ag>Ab,扩散率近似; E:浓度Ag>Ab,扩散率Ag>Ab ; F:浓度Ag<Ab,扩散率Ag<Ab ;
抗原性质分析
实验原理
沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及相互间比例,而且与其分子 大小及扩散速度相关。
当抗原抗体存在多个系统时,可呈现多条沉淀线乃至交叉反应。 依据沉淀线的形态、清晰度及位置可以了解抗原或者抗体的性质。
双向琼脂扩散试验的应用
检测未知抗原或抗体 抗原性质分析 抗体效价滴定 抗原或抗体纯度鉴定
实验
单向、双向免疫琼脂 扩散
沉淀反应
可溶性抗原(如细菌外毒素、血清蛋白等)与相应抗体特异性结合后,在一定条件 (适量电解质、适宜的pH值及温度)下,经过一定时间,在比例适宜处形成肉眼 可见的沉淀现象。
沉淀反应
环状沉淀反应
沉
淀
反
琼脂扩散试验
应
对流免疫电泳
电
双向扩散
+
单向扩散
泳 技 术
絮状沉淀反应
实验方法
稀释抗体:用pH7.2的PBS稀释标准兔抗牛IgG血清抗体,使最终浓度为抗体效 价的一倍,其分装量应与2%盐水琼脂量相等。
制备琼脂板:将已稀释的标准兔抗牛IgG血清抗体于56℃水浴中预热半分钟,再 倾注于已溶化并维持56℃的2%盐水琼脂中混匀,取4ml即刻倾注于玻片上,待 凝固后即可。
实验方法
加样:于中央孔加入牛IgG,周围1-5孔加入倍比稀释不同浓度的标准兔抗牛IgG 血清抗体,6孔加入生理盐水作对照。每孔各加10μl。
将琼脂板平放于湿盒内,置37℃温箱中,分别于24小时观察结果。
实验结果
观察孔间沉淀线的数目及特征。本试验1至5孔与中央孔之间是否可出现清晰的乳 白色沉淀线。
沉淀线与中央孔的距离随抗原的浓度减小而增大。 6孔是生理盐水,为阴性对照,与中间空间无白色沉淀线。 拍照记录,根据实验现象判断实验结果。
实验报告
根据实验结果,绘制标准蛋白曲线。 绘制两个实验结果图。
谢谢观看
周围6个孔放不同稀释度的相应Ab。 以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为该抗体的效价。 可进行任意稀释。
抗原抗体纯度鉴定
“1” 为单一抗原抗体系统。 “n” 为多个抗原抗体系统。 *可以用混合抗原鉴定抗体纯度。 *可以用混合抗体鉴定抗原纯度。
实验方法
制作琼脂板所需要的1%盐水琼脂(4mL),溶化后置56℃水浴中平衡温度备用。 将载玻片置于水平桌面上,倾注已融化1%盐水琼脂,制作琼脂板。 琼脂凝固后,用打孔器打孔,本实验采用梅花型。
(1) 沉淀线吻合:
待检抗原与标准抗原完全相同。
(2) 沉淀线相切:
待检抗原中含有与标准抗原相同的抗 原,还含有另外的抗原与抗血清相对 应。
实验方法
(3) 沉淀线相交:
待检抗原有与抗血清对应的抗原, 但和标准抗原不同。
(4) 沉淀线部分吻合:
待测抗原和标准抗原性质相同,但 含量较低。
抗体效价滴定