单向双向免疫琼脂扩散
单向琼脂扩散试验.
①抗原特异性与沉淀线形状的关系：在相邻两完全相同的抗原与抗体反应时，则可出现两单沉淀线的融合。反之，如相邻抗原完全不同时，则出现沉淀线之交叉；两种抗原部分相同时，则出现沉淀线的部分融合。见图2。
图2双扩散试验结果示意图
A：已知抗体a、b：阳性对照
c、d、e、f：被检材料
②抗原浓度与沉淀先导形状的关系：两相邻抗原浓度相同，形成对称相融合的沉淀线；如果两抗原浓度不同，则沉淀线不对称，移向低浓度的一边。见图3。
图3抗原特异性与沉淀线形状的关系
a、b：抗体A、A’、B：抗原
A、B完全不同A、A’部分相同
③温度对沉淀线的影响：在一定范围内，温度扩散快。通常反应在0-37℃下进行。在双向扩散时，为了减少沉淀线变形并保持其清晰度，可在37℃下形成沉淀线，然后置于室温或冰箱（4℃）中为佳。
2．待测血清：兔血清
3．阴性对照血清
4．其它：生理盐水、琼脂粉、载玻片、打孔器、微量进样器等。
四、实验方法
1．取一干净培养皿，倾注3.5—4.0毫升加热熔化的1%食盐琼脂制成琼脂板。
2．凝固后，用直径3毫米打孔Fra bibliotek，孔间距为5毫米。孔的排列方式如图1所示。
图1双向琼脂扩散原抗体孔位置示意图
3．用微量进样器于中央孔加抗体，于周围孔加各种抗原。加样时勿使样品外溢或在边缘残存小气泡，以免影响扩散结果。
⑥时间对沉淀线的影响：沉淀线形成一般在1-3天出现，14-21天出现的数目最多。玻片法可在1-2小时出现，一般观察72小时，放量过久可出现沉淀线重合消失。
④琼脂浓度对沉淀线形成速度的影响：一般来说，琼脂浓度越大，沉淀线出现越慢。
⑤参加扩散的抗原与抗体间的距离对沉淀线形成的影响：抗原、抗体相距越远，沉淀线形成的越慢，所以在微量玻片法时，孔间距离以0.25-0.5cm为好，距离远影响反应速度。当然孔距过远，沉淀线的密度过大，容易发生融合，有碍对沉淀线数目的确定。
双向琼脂扩散实验报告
一、实验目的1. 掌握双向琼脂扩散试验的原理。
2. 熟悉双向琼脂扩散试验的操作方法。
3. 学会分析双向琼脂扩散试验的结果。
二、实验原理双向琼脂扩散试验（Double immunodiffusion test）是一种经典的免疫学实验方法，用于检测抗原与抗体之间的特异性结合。
该实验基于抗原与抗体在琼脂凝胶中相互扩散的原理。
当抗原和抗体在琼脂凝胶中相遇时，如果两者浓度比例合适，就会在两者相遇处形成白色沉淀线，称为沉淀反应。
三、实验材料1. 抗原：待检测的样品。
2. 抗体：已知抗体。
3. 琼脂粉：精制琼脂粉。
4. 生理盐水。
5. 载玻片。
6. 打孔器（直径3mm）。
7. 湿盒。
8. 吸管。
四、实验方法1. 制备琼脂板：用生理盐水配制1.0～1.5%琼脂，隔水煮沸使溶化，用吸管吸取3.5ml趁热浇于载玻片上，制成琼脂板。
2. 打孔：待琼脂凝固后，按图所示用打孔器打孔，并用针头挑去孔中琼脂（孔距为5mm）。
3. 加样：在孔中加抗体，在孔的周围加抗原。
加样时勿使样品外溢或在边缘残存小气泡，以免影响扩散结果。
4. 扩散：将加好样品的琼脂板置于湿盒内，于37℃温箱中放置24小时后观察结果。
五、实验结果1. 观察孔间沉淀线的数目与特征。
2. 分析沉淀线的形状、大小、位置等特征，判断抗原与抗体之间的特异性结合。
六、结果分析1. 若凝胶中抗原抗体是特异性的，则形成抗原—抗体复合物，在两孔之间出现一清晰致密白色的沉淀线，为阳性反应。
2. 若在72小时仍未出现沉淀线，则为阴性反应。
3. 结果分析时，需考虑抗原特异性、抗原浓度、沉淀线形状等因素。
七、讨论双向琼脂扩散试验是一种简单、灵敏、特异的方法，可用于检测抗原与抗体之间的特异性结合。
该实验在临床医学、生物学等领域有广泛的应用，如病原体检测、药物过敏检测、肿瘤标志物检测等。
在本实验中，我们成功进行了双向琼脂扩散试验，并观察到了清晰的沉淀线。
这表明抗原与抗体之间存在特异性结合，验证了实验结果的准确性。
双向琼脂扩散试验实验报告
双向琼脂扩散试验实验报告双向琼脂扩散试验实验报告引言：双向琼脂扩散试验是一种常用的生物化学实验方法，用于研究物质在琼脂凝胶中的扩散速率。
本实验旨在通过双向琼脂扩散试验，探究不同条件下物质扩散的规律和影响因素。
实验材料与方法：实验材料包括琼脂凝胶、试剂、显微镜等。
实验方法为双向琼脂扩散试验，将琼脂凝胶切割成一定大小的块状，然后在琼脂凝胶上添加待测物质。
待测物质会通过琼脂凝胶的孔隙扩散，形成扩散圈。
通过观察和测量扩散圈的直径，可以计算出物质在琼脂凝胶中的扩散速率。
实验结果与分析：在实验中，我们选择了两种不同的物质进行双向琼脂扩散试验，分别是葡萄糖和氨基酸。
在相同的实验条件下，观察到葡萄糖的扩散圈直径较大，扩散速率较快；而氨基酸的扩散圈直径较小，扩散速率较慢。
这说明物质的性质对其在琼脂凝胶中的扩散速率有着显著影响。
进一步实验表明，温度对物质在琼脂凝胶中的扩散速率也有一定的影响。
在较高的温度下，扩散圈的直径较大，扩散速率较快；而在较低的温度下，扩散圈的直径较小，扩散速率较慢。
这与分子热运动理论相符，温度越高，分子的热运动越剧烈，扩散速率越快。
此外，我们还发现琼脂凝胶的浓度对物质扩散速率的影响。
在浓度较高的琼脂凝胶中，扩散圈的直径较小，扩散速率较慢；而在浓度较低的琼脂凝胶中，扩散圈的直径较大，扩散速率较快。
这可能是因为高浓度的琼脂凝胶具有更多的孔隙，使物质扩散的路径更加复杂，从而降低了扩散速率。
结论：通过双向琼脂扩散试验，我们发现物质的性质、温度和琼脂凝胶浓度等因素都会对物质在琼脂凝胶中的扩散速率产生影响。
葡萄糖的扩散速率较快，而氨基酸的扩散速率较慢；温度越高，扩散速率越快；琼脂凝胶浓度越低，扩散速率越快。
这些研究结果对于理解物质在生物体内的扩散过程具有重要意义。
在生物学、药学等领域，我们可以利用双向琼脂扩散试验的方法，研究药物在组织中的扩散速率，从而指导药物的使用和疗效评估。
然而，双向琼脂扩散试验也存在一些局限性。
单向双向免疫琼脂扩散
抗原抗体纯度鉴定
“1” 为单一抗原抗体系统。 “n” 为多个抗原抗体系统。 *可以用混合抗原鉴定抗体纯度。 *可以用混合抗体鉴定抗原纯度。
实验方法
制作琼脂板所需要的1%盐水琼脂（4mL），溶化后置56℃水浴中平衡温度备用。 将载玻片置于水平桌面上，倾注已融化1%盐水琼脂，制作琼脂板。 琼脂凝固后，用打孔器打孔，本实验采用梅花型。
实验方法
稀释抗体：用pH7.2的PBS稀释标准兔抗牛IgG血清抗体，使最终浓度为抗体效 价的一倍，其分装量应与2%盐水琼脂量相等。
制备琼脂板：将已稀释的标准兔抗牛IgG血清抗体于56℃水浴中预热半分钟，再 倾注于已溶化并维持56℃的2%盐水琼脂中混匀，取4ml即刻倾注于玻片上，待 凝固后即可。
(1) 沉淀线吻合：
待检抗原与标准抗原完全相同。
(2) 沉淀线相切：
待检抗原中含有与标准抗原相同的抗 原，还含有另外的抗原与抗血清相对 应。
实验方法
(3) 沉淀线相交：
待检抗原有与抗血清对应的抗原， 但和标准抗原不同。
(4) 沉淀线部分吻合：
待测抗原和标准抗原性质相同，但 含量较琼脂扩散
实验原理
将适量的抗体均匀混入琼脂内制成琼脂板，打孔，在孔中加入一定量的待测抗原， 抗原向四周呈辐射状扩散，与抗体相遇，在比例合适时形成白色沉淀环。
实验原理
此方法用已知的抗体测未知的抗原。由于抗体已与凝胶混合，不会再扩散，仅抗 原从小孔向四周扩散，因此称为单向琼脂扩散试验。
实验方法
加样：于中央孔加入牛IgG，周围1-5孔加入倍比稀释不同浓度的标准兔抗牛IgG 血清抗体，6孔加入生理盐水作对照。每孔各加10μl。
双向琼脂扩散试验原理
实验材料
1．伤寒杆菌诊断血清、痢疾杆菌诊断血清。 2.菌种：待检菌斜面培养物（伤寒/痢疾）。 3.其他：载玻片、接种环、盛消毒水的容器、 记号笔、酒精灯等。
实验方法
1．用记号笔在干净的载玻片上均分二格并标明 1，2。 2．无菌操作，用接种环分别于一、二格内各加 2～3环伤寒杆菌、痢疾杆菌诊断血清。 3．用灭菌接种环自待测菌琼脂斜面上挑取少许 细菌置第一格内，搅匀。接种环灭菌后同法取待 检菌置于第二格内，混匀。 4．轻轻摇动玻片，1～2分钟后观察玻片凝集 现象，记录结果。 观察完毕，将玻片置于盛有消毒液的容器中。
间接凝集抑制试验－－ 免疫妊娠试验
实验目的
1．了解直接凝集与间接凝集的区别，间 接凝集与间接凝集抑制的区别。 2．学习间接凝集抑制试验的操作方法。
实验原理
可溶性抗原与相应抗体充分作用后再加入已 知抗原致敏的载体颗粒，此时因抗体已被可 溶性抗原结合，不再出现载体凝集现象。
临床上常用此试验作早期妊娠检查，具有灵 敏、快速之优点。
医学免疫学 实验
牡丹江医学院 病原生物学教研室
目的： 1．掌握免疫学的基本实验方法和技术操作。 2．通过实验设计和实验结果的分析，使学生掌握科 学的思维方法，培养其独立分析问题和解决问题的能力， 提高独立工作的能力。 要求： l．每次实验课前必须做好预习，明确实验目的、原理、 方法及操作中的注意事项，避免和减少发生错误。 2．实验过程中必须持严肃认真的态度。 3．对实验结果必须进行仔细地观察和真实地记录， 然后进行科学地分析，得出恰当结论。 4．独立认真完成实验报告，书写要字迹清楚，语言 简练,表格清晰，画图应力求反应实物标本的原状。
免疫检验考试辅导：单向扩散试验
单向扩散试验：琼脂内混入抗体，待测抗原从局部向琼脂内自由扩散，如抗原和相应抗体结合，则形成沉淀环。
1、试管法：将一定量的抗体混入0.7%琼脂糖溶液中，注入小试管内，上层加抗原溶液使待测抗原在凝胶中自由扩散，在抗原抗体比例恰当位置形成沉淀环。
2、平板法：是将抗体或抗血清混入0.9%琼脂糖内，未凝固前倾注成平板，然后在上打孔，将抗原加入孔中，放37℃让其自由扩散，24～48h后可见孔周围出现沉淀环，测定环的直径或面积计算标本中待测抗原的浓度。
有两种计算方法：l）Mancini曲线：适用大分子抗原的和长时间扩散（>48h）的结果，沉淀环直径的平方与抗原浓度呈线性关系c/d2=k.（其中c为抗原浓度 d为沉淀环直径 k为常数）
3、单向扩散试验检测时的注意点：
（1）抗血清必须特异性强、效价高、亲和力强，在良好条件下保存。
（2）每次测定都必须作标准曲线。
（3）每次测定时必须用质控血清作质控。
（4）注意双环现象（出现了两种抗原性相同成分）。
（5）应用单克隆抗体测量多态性抗原时，测定值偏低；用多克隆抗体测量单克隆病时，测定值偏高。
试验8单向琼脂免疫扩散试验
实验 8 单向琼脂免疫扩散试验一、目的了解单向琼脂免疫扩散试验的原理和操作过程。
原理将某种特异性抗体混合于琼脂中，制成含抗体的琼脂板，再于琼脂板上打孔，并将一定量的抗原加入孔中。
抗体与琼脂混合后，不会再扩散，只有孔中抗原向四周呈辐射状扩散，如抗原与已知的抗体相对应，在两者比例适合处即出现由免疫复合物所形成的白色沉淀环，沉淀环的大小（直径或面积）与抗原浓度成正比。
以不同浓度的标准抗原与固定浓度的抗血清反应后测得沉淀环直径，然后从标准曲线中求得其含量。
主要用于测定血清IgG、IgM、IgA和补体成分的含量。
材料1. 抗原：待测人血清、已知含量的IgG参考蛋白2. 抗体：抗人IgG抗体3. 3%琼脂凝胶、4.5ⅹ10cm塑料板、直径3mm打孔器、注射器针头、定量加样器、湿盒（盒内铺有湿纱布）、半对数坐标纸。
方法1. 抗体琼脂板的制备（1）将3%琼脂置沸水浴加热溶化，吸取6ml加至试管内，置56水浴保温。
（2）用 0.9%生理盐水将抗人IgG抗体作适当稀释，吸取稀释好的抗人IgG6ml加至另一试管，置56℃水浴保温。
（3）将上述在56℃中保温的琼脂和已稀释好的抗体充分混匀，立即将此12ml含抗体的琼脂倾注于放在水平台上的塑料板上，待板冷却。
此抗体琼脂板的厚度为2mm，琼脂浓度为1.5%。
2. 稀释参考血清和待测血清;（1）稀释参考血清：每支冻干参考血清中加入蒸馏水0.5ml，待完全溶解后，用生理盐水稀释成几个不同稀释度。
例如参考血清IgG含量为11.66mg/ml。
参考血清稀释度1：10 1：16 1：20 1：32 1：40 1：64IgG相应含量为1166 728 583 364 291 182（2）待测血清用生理盐水作1：40稀释。
3. 打孔用打孔器在琼脂板上打孔，孔径3mm，孔间距15mm，用注射器针头挑出孔中琼脂，不可损坏孔缘。
4. 加样打孔后立即用微量加样器分别吸取各种稀释度参考血清10ul，准确地加到琼脂板孔中，每种稀释度加二个孔。
《双向琼脂扩散试》课件
缺点
影响因素多
双向琼脂扩散试验的结果受到多种因 素的影响，如抗原和抗体的质量、浓 度、扩散速度等，可能导致试验结果 的差异。
试验周期较长
由于抗原和抗体需要在琼脂凝胶中扩 散，因此试验的完成需要一定的时间 。对于快速检测的需求，双向琼脂扩 散试验可能不是最佳选择。
灵敏度与特异性难以平衡
在提高试验的灵敏度的同时，可能会 牺牲部分特异性；反之亦然。因此， 在实际应用中需要权衡灵敏度和特异 性之间的平衡。
主观性较强
试验结果的判断依赖于操作者的主观 观察，因此结果的准确性和可靠性可 能受到操作人员经验和技术水平的影 响。
05
双向琼脂扩散试验的改进与发 展趋势
改进方法与技术
01
02
03
04
优化试验条件
通过调整温度、pH值、离子 强度等参数，提高试验的稳定
性和准确性。
自动化与智能化
引入自动化设备和技术，实现 试验过程的自动化和智能化，
优点
操作简便
灵敏度高
双向琼脂扩散试验是一种经典的血清学检 测方法，操作简便，易于在实验室或临床 环境中实施。
该试验对微量抗原和抗体具有较强的检测 能力，能够检测出低浓度的抗原或抗体。
特异性好
结果直观
由于采用琼脂凝胶作为载体，抗原和抗体 在凝胶中扩散，形成浓度梯度，从而达到 高度特异性识别的效果。
试验结果可以通过观察凝胶上的沉淀线来 直接判断，无需复杂的仪器设备。
食品中病原菌检测
通过双向琼脂扩散试验，可以检测食品中是否存在某些病原菌， 确保食品安全。
食品添加剂检测
该试验也可用于检测食品中是否含有超标的食品添加剂，如防腐剂 、色素等。
食品过敏原检测
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火箭免疫电泳
单向免疫琼脂扩散
实验原理
将适量的抗体均匀混入琼脂内制成琼脂板，打孔，在孔中加入一定量的待测抗原， 抗原向四周呈辐射状扩散，与抗体相遇，在比例合适时形成白色沉淀环。
实验原理
此方法用已知的抗体测未知的抗原。由于抗体已与凝胶混合，不会再扩散，仅抗 原从小孔向四周扩散，因此称为单向琼脂扩散试验。
实验方法
加样：于中央孔加入牛IgG，周围1-5孔加入倍比稀释不同浓度的标准兔抗牛IgG 血清抗体，6孔加入生理盐水作对照。每孔各加10μl。
将琼脂板平放于湿盒内，置37℃温箱中，分别于24小时观察结果。
实验结果
观察孔间沉淀线的数目及特征。本试验1至5孔与中央孔之间是否可出现清晰的乳 白色沉淀线。
沉淀环直径的大小与抗原含量成正比，用标准抗原制成标准曲线，从标准曲线上， 可以查出待检样品中抗原的含量。
实验原理
标准品抗原浓度测定 1.测定沉淀环直径 2.在标准曲线上查找相应抗原浓度
不同病人抗原浓度测定
绘制标准曲线
实验方法
（一）标准曲线的制备
制作琼脂板所需要的1%盐水琼脂（4mL）。 首先分装其1/2量的2%盐水琼脂，溶化后置56℃水浴中平衡温度备用。
实验
单向、双向免疫琼脂 扩散
沉淀反应
可溶性抗原（如细菌外毒素、血清蛋白等）与相应抗体特异性结合后，在一定条件 （适量电解质、适宜的pH值及温度）下，经过一定时间，在比例适宜处形成肉眼 可见的沉淀现象。
沉淀反应
环状沉淀反应
沉
淀
反
琼脂扩散试验
应
对流免疫电泳
电
双向扩散
＋
单向扩散
泳 技 术
絮状沉淀反应
周围6个孔放不同稀释度的相应Ab。 以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为该抗体的效价。 可进行任意稀释。
抗原抗体纯度鉴定
“1” 为单一抗原抗体系统。 “n” 为多个抗原抗体系统。 *可以用混合抗原鉴定抗体纯度。 *可以用混合抗体鉴定抗原纯度。
实验方法
制作琼脂板所需要的1%盐水琼脂（4mL），溶化后置56℃水浴中平衡温度备用。 将载玻片置于水平桌面上，倾注已融化1%盐水琼脂，制作琼脂板。 琼脂凝固后，用打孔器打孔，本实验采用梅花型。
注意事项
加样时，吸取每份标本均应更换塑料吸头； 实际检测过程中，标准曲线必须与样品测定同时制备； 孵育时间应控制在24~48h，时间太短可能产生不了沉淀线，时间太长会造成沉
淀线的扩散。
双向免疫琼脂扩散
实验原理
可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散，彼此相遇后形成一定类型的特异 性沉淀线。
检未知抗原或抗体
ABC DEF
Ag Ab
A: 浓度Ag、Ab及扩散率近似； B：浓度Ag、Ab近似，扩散率Ag＞Ab ； C：浓度Ag、Ab近似，扩散率Ag＜Ab ； D：浓度Ag＞Ab，扩散率近似； E：浓度Ag＞Ab，扩散率Ag＞Ab ； F：浓度Ag＜Ab，扩散率Ag＜Ab ；
抗原性质分析
(1) 沉淀线吻合：
待检抗原与标准抗原完全相同。
(2) 沉淀线相切：
待检抗原中含有与标准抗原相同的抗 原，还含有另外的抗原与抗血清相对 应。
实验方法
(3) 沉淀线相交：
待检抗原有与抗血清对应的抗原， 但和标准抗原不同。
(4) 沉淀线部分吻合：
待测抗原和标准抗原性质相同，但 含量较低。
抗体效价滴定
实验原理
沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及相互间比例，而且与其分子 大小及扩散速度相关。
当抗原抗体存在多个系统时，可呈现多条沉淀线乃至交叉反应。 依据沉淀线的形态、清晰度及位置可以了解抗原或者抗体的性质。
双向琼脂扩散试验的应用
检测未知抗原或抗体 抗原性质分析 抗体效价滴定 抗原或抗体纯度鉴定
沉淀线与中央孔的距离随抗原的浓度减小而增大。 6孔是生理盐水，为阴性对照，与中间空间无白色沉淀线。 拍照记录，根据实验现象判断实验结果。
实验报告
根据实验结果，绘制标准蛋白曲线。 绘制两个实验结果图。
谢谢观看
量（单位/ml）为横座标，绘制成标准曲线。
实验结果
用尺子测量并记录沉淀环直径，然后以沉淀环直径为纵座标，以标准参考蛋白量 （单位/ml）为横座标，绘制成标准曲线。
实验结果
注意事项
制备抗体琼脂板时，琼脂温度必须严格控制，温度太低琼脂会凝固，太高则会影 响抗体的活性；
加样孔内的琼脂应挑干净，切不可损坏孔的边缘，确保每孔的液面基本一致； 加样量一定要精确，并且不能逸出孔外，否则结果不好观察；
实验方法
打孔：将琼脂板置于模板上，在同一直线上用打孔器打孔5个，孔距10mm。 用PBS缓冲液稀释不同浓度的标准参考蛋白。（牛免疫球蛋白IgG，应根据制品
说明进行稀释） 加样：将已稀释的不同浓度的标准参考蛋白依次用微量加样器每孔加入10ul。
（注意：每一稀释度均应更换塑料吸头）。
实验方法
将加样的琼脂板放湿盒中，置37℃温箱，24小时后观察结果。 用尺子测量并记录沉淀环直径，然后以沉淀环直径为纵座标，以标准参考蛋白
实验方法
稀释抗体：用pH7.2的PBS稀释标准兔抗牛IgG血清抗体，使最终浓度为抗体效 价的一倍，其分装量应与2%盐水琼脂量相等。
制备琼脂板：将已稀释的标准兔抗牛IgG血清抗体于56℃水浴中预热半分钟，再 倾注于已溶化并维持56℃的2%盐水琼脂中混匀，取4ml即刻倾注于玻片上，待 凝固后即可。