实验一-双向免疫扩散试验
双向扩散试验
双向扩散试验
双向扩散试验：在琼脂内抗原和抗体各自向对方扩散，在最恰当的比
例处形成抗原抗体沉淀线，根据沉淀线的位置、形状以及对比关系，
可对抗原或抗体作出定性分析。
双向扩散试验也分为试管法和平板法。
1、试管法：
在含有抗原的溶液和含有抗体琼脂中间，加一层普通琼脂，让下
层抗体和上层抗原向中间自由扩散，在抗原、抗体浓度最适时形成沉
淀线。
2、平板法：
是在琼脂板上相距3～5mm打一对孔，或者梅花孔、双排孔、三角
孔等。
在相应孔中加入抗原或抗体，待其自由扩散后，抗原、抗体形
成可见的沉淀线。
根据沉淀线的位置可作如下分析：
①抗原、抗体是否存在及其相对含量。
一般沉淀线靠近抗原孔，
提示抗体量大，沉淀线靠近抗体孔，提示抗原量大。
②抗原、抗体相对分子量的分析;抗原或抗体在琼脂内自由扩散，
其速度受分子量影响。
分子量小者，扩散快，反之较慢。
由于慢者扩
散圈小，局部浓度较大，形成沉淀线弯向分子量大的一方。
如若两者
分子量相等，则形成直线。
③抗原性质的分析，受检的抗原性质可能完全相同、部分相同、
完全不同，沉淀弧可分别出现完全融合、部分融合、不融合三种情况;
④抗体效价的滴定。
抗体效价是抗原、抗体经过自由扩散形成沉
淀线，出现沉淀线的最高抗体稀释度为该抗体的效价。
试验 双向免疫扩散 (1)
实验双向免疫扩散法【原理】可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散，彼此相遇后形成一定类型的特异性沉淀线。
沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及相互间比例，而且与其分子大小及扩散速度相关。
当抗原、抗体存在多个系统时，可呈现多条沉淀线乃至交叉反应。
依据沉淀线的形态、条数、清晰度及位置可了解抗原或抗体的若干性质，如浓度、特异性等。
【实验材料】0.8%琼脂糖(巴比妥缓冲液配制)巴比妥钠缓冲液(μ=0.05，pH=8.6)：巴比妥钠10.30g、巴比妥1.84g、甘氨酸1.0g、Peg6000 4g，加900ml水加温助溶，待冷，转入1000ml容量瓶内，再加水到刻度，测试pH后装瓶待用。
载玻片打孔器微量加样器及塑料吸头湿盒抗原：人IgG蛋白抗体：兔抗人IgG免疫血清【实验方法】1）将已溶化的0.8%琼脂糖管放90~95℃水浴箱中平衡温度备用；2）将载玻片置于水平桌面上，倾注已溶化琼脂约4mL，使成厚度约1.5~2mm琼脂板；（注意：倾注速度不要过快，以免琼脂溢出载玻片；倾注过程要连续以保证琼脂板均匀平滑）；3）琼脂凝固后，用打孔器打孔，根据不同需要可制成三角型、方阵型或梅花型，本次试验采用梅花型。
梅花型即七个孔构成一组，孔径3mm，孔距4mm；梅花型打孔可以依据模板。
为便于识别加样方向或区分不同的组，可在琼脂糖胶的边缘打孔或切角标记。
打孔完毕后，将载玻片在酒精灯的火焰上过几遍，可防止漏液。
4）免疫血清的稀释：取5只干净的小试管，各加入70μL的生理盐水。
取70μL免疫血清加入第一支试管，震荡30秒，使其与生理盐水混匀，即为1:2稀释血清；再从第一支试管中吸取70μL的1:2稀释血清加入第二只试管中，震荡30秒，使其与生理盐水混匀，即为1:4稀释血清；依次操作，即可得到1:8、1:16、1:32的倍比稀释血清。
4）用微量加样器加6~8µL抗原于中央孔中，周围各孔分别各加6~8µL不同稀释度的免疫血清；注意每加一样品均需更换吸头，以防止交叉污染，影响实验结果；加样时，不要使样品溢出加样孔。
双向琼脂扩散实验报告
一、实验目的1. 掌握双向琼脂扩散试验的原理。
2. 熟悉双向琼脂扩散试验的操作方法。
3. 学会分析双向琼脂扩散试验的结果。
二、实验原理双向琼脂扩散试验（Double immunodiffusion test）是一种经典的免疫学实验方法，用于检测抗原与抗体之间的特异性结合。
该实验基于抗原与抗体在琼脂凝胶中相互扩散的原理。
当抗原和抗体在琼脂凝胶中相遇时，如果两者浓度比例合适，就会在两者相遇处形成白色沉淀线，称为沉淀反应。
三、实验材料1. 抗原：待检测的样品。
2. 抗体：已知抗体。
3. 琼脂粉：精制琼脂粉。
4. 生理盐水。
5. 载玻片。
6. 打孔器（直径3mm）。
7. 湿盒。
8. 吸管。
四、实验方法1. 制备琼脂板：用生理盐水配制1.0～1.5%琼脂，隔水煮沸使溶化，用吸管吸取3.5ml趁热浇于载玻片上，制成琼脂板。
2. 打孔：待琼脂凝固后，按图所示用打孔器打孔，并用针头挑去孔中琼脂（孔距为5mm）。
3. 加样：在孔中加抗体，在孔的周围加抗原。
加样时勿使样品外溢或在边缘残存小气泡，以免影响扩散结果。
4. 扩散：将加好样品的琼脂板置于湿盒内，于37℃温箱中放置24小时后观察结果。
五、实验结果1. 观察孔间沉淀线的数目与特征。
2. 分析沉淀线的形状、大小、位置等特征，判断抗原与抗体之间的特异性结合。
六、结果分析1. 若凝胶中抗原抗体是特异性的，则形成抗原—抗体复合物，在两孔之间出现一清晰致密白色的沉淀线，为阳性反应。
2. 若在72小时仍未出现沉淀线，则为阴性反应。
3. 结果分析时，需考虑抗原特异性、抗原浓度、沉淀线形状等因素。
七、讨论双向琼脂扩散试验是一种简单、灵敏、特异的方法，可用于检测抗原与抗体之间的特异性结合。
该实验在临床医学、生物学等领域有广泛的应用，如病原体检测、药物过敏检测、肿瘤标志物检测等。
在本实验中，我们成功进行了双向琼脂扩散试验，并观察到了清晰的沉淀线。
这表明抗原与抗体之间存在特异性结合，验证了实验结果的准确性。
双向凝胶扩散实验报告
一、实验目的1. 了解双向凝胶扩散实验的原理和方法。
2. 掌握双向凝胶扩散实验的操作步骤。
3. 学会观察和分析实验结果。
二、实验原理双向凝胶扩散实验是一种经典的免疫学实验方法，主要用于检测抗原和抗体之间的特异性反应。
该实验基于抗原和抗体在凝胶中扩散并形成沉淀线的原理。
当抗原和抗体在一定比例下相遇时，会发生特异性结合，形成不溶性的抗原抗体复合物，从而在凝胶中形成一条明显的沉淀线。
三、实验材料1. 琼脂糖凝胶板2. 抗原和抗体试剂3. 打孔器4. 微量加样器5. 温度计6. 移液管7. 湿盒8. 显微镜四、实验步骤1. 准备工作：将琼脂糖凝胶板放入温水中软化，然后取出用剪刀裁剪成合适的尺寸。
2. 打孔：用打孔器在凝胶板上打孔，孔径约为3mm。
3. 加样：用微量加样器将抗原和抗体分别加入凝胶板上的相邻孔中，注意加样时避免产生气泡。
4. 固定：将凝胶板放入湿盒中，放入37℃的恒温箱中扩散24小时。
5. 观察结果：取出凝胶板，用显微镜观察沉淀线的形成情况。
五、实验结果与分析1. 结果：在抗原和抗体孔之间形成了明显的沉淀线，表明抗原和抗体发生了特异性结合。
2. 分析：根据沉淀线的位置、数量和形状，可以初步判断抗原和抗体的特异性和浓度。
沉淀线距离抗原孔越远，说明抗体浓度越高；距离抗体孔越远，说明抗原浓度越高。
若出现多条沉淀线，可能表明抗原或抗体不是单一的成分。
六、实验讨论1. 实验过程中，加样时应避免产生气泡，以免影响实验结果。
2. 在恒温箱中扩散时，应保持湿盒内温度恒定，以确保实验结果的准确性。
3. 实验结果受多种因素影响，如抗原和抗体的浓度、凝胶板的质量、实验条件等。
在实际操作中，应注意这些因素的影响，以提高实验结果的可靠性。
七、结论本次实验成功地进行了双向凝胶扩散实验，观察到了抗原和抗体之间的特异性反应，验证了实验原理。
通过分析实验结果，我们可以初步判断抗原和抗体的特异性和浓度，为后续的免疫学研究提供参考。
生化大实验双向琼脂免疫扩散
五 注意事项
1.用琼脂浇培养皿时，培养皿必须保持水平位置。
2.每个孔的加样量应保持一致，既使每个孔都被 加满，又必须不使样品溢出孔外。 3.打孔时注意不要将孔弄破。
六 复习题
1.什么是抗原？ 2.什么是抗体？ 3.双向免疫扩散的原理及应用。
2用已知抗血清或抗原检测未知抗原或抗双向免疫扩散常见孔型有三孔型双孔型双排孔型梅花孔型见图1双向免疫琼脂扩散孔型双向免疫琼脂扩散孔型三孔型双孔型梅花孔型双排孔型双排孔型1
纯度检测方法二：
双向免疫扩散试验
一实验目的
学习双向免疫扩散实验原理 掌握双向免疫扩散实验操作方法
基本概念
抗原：抗原（antigenicity）是指能够刺激机体 产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答 产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生 免疫效应（特异性反应）的物质。 抗体：抗体(antibody)指机体的免疫系统在抗 原刺激下，由B淋巴细胞分化成的浆细胞所产 生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的 免疫球蛋白。
二 实验原理
双向免疫扩散是一种定性试验。将抗原、抗体分 别加入琼脂板相对应的小孔中，使两者互相扩散， 在比例适当处形成可见的沉淀线。观察沉淀线的 位置、数量、形状，以及对比关系，可对抗原或 抗体进行定性分析，常用于: （ 1 ）抗原或抗体的纯度鉴定。也可对抗体效价进行 初步估算。 （ 2 ）用已知抗血清（或抗原）检测未知抗原（或抗 体） （3）抗原或抗体相对分子量的估计 双向免疫扩散常见孔型有三孔型、双孔型、双排 孔型、梅花孔型（见图1）
○ ○ ○ 三孔型
○ ○
双孔型
○ ○ ○ ○ 双排孔型
○ ○○○ ○
梅花孔型
图1 双向免疫琼脂扩散孔型
双相免疫扩散试验
双相免疫扩散试验
实验原理：抗原和抗体在含有电解质的琼脂凝胶板的对应孔中，各自向四周凝胶中扩散，当二者发生特异性反应时，在浓度比例合适处形成可见的白色沉淀线。
本实验用于检测免疫成功与否及所产生的抗体的效价，抗体效价以出现明显沉淀线时的抗体的最高稀释度为判定终点。
一般来说，当效价≥1:16时（可在1:64以上），即可放血收集血清。
试剂和器材：
1.待测血清（抗体）
2.0.4%BSA（抗原）
3.琼脂粉、生理盐水
4.载玻片、吸管、滴管、打孔器、湿盒等
步骤和方法：
1.制备琼脂凝胶：生理盐水配制浓度为12g/L的琼脂，完全溶化至澄清
2.浇板：将载玻片置于水平台上，吸取琼脂加在玻片上，盖满、平整、无气泡
3.打孔：待琼脂凝固后，按下图打孔
4.加样：中心孔加入抗原，1-6孔所加血清的稀释度分别为：
1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,1:256,每孔加样10μl
5.扩散：将加好样的琼脂板放入湿盒中，室温放置1-3d观察结果
结果判定：肉眼观察是否产生乳白色沉淀线
注意事项：
1. 加样时不要溢出空外
2. 反应时间要适宜，时间过长，沉淀线可解离而导致假阴性，时间过短，则沉
淀线不出现或不清楚。
免疫化学实验操作指导书：双向免疫扩散法
实验(三) 双向免疫扩散法
双向扩散法（double diffusion）又称琼脂扩散法，是利用琼脂凝胶为介质的一种沉淀反应，扩散作用使分处两处的抗原和相应抗体相遇，形成抗原—抗体复合物，比例合适时将出现沉淀现象。
一. 实验目的：测定免疫血清的效价
二. 器材与试剂
1. 载玻片
2. 打孔器
3. 微量取液器
4. 稀释板
5. 培养器或带盖培养皿
6. 抗原
7. 免疫血清（抗血清）
8. 琼脂糖（或进口分装琼脂粉）
9. pH 7.2磷酸缓冲生理盐水（PBS）100ml
三. 实验方法
1.琼脂凝胶板的制作
称取0.6g琼脂粉放入三角瓶中，加入50ml PBS, 加热溶解成1.2%的琼脂溶液（冬天则琼脂的浓度为1%），用5~10ml小量筒量取4ml 倾入洁净水平放置的载玻片中，凝固后用打
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实验一-双向免疫扩散试验
实验一双向免疫扩散试验一、实验目的1、熟练掌握免疫扩散法的操作步骤2、掌握抗血清效价的测定和特异性抗体的分析技术二、实验原理在一定条件下，抗原能与相应的抗体相互作用，发生免疫沉淀反应。
免疫扩散法就是使抗原与抗体在琼脂糖凝胶中自由扩散而相遇，从而形成抗原抗体复合物，由于此复合物分子量增大并产生聚集，不再继续扩散而形成肉眼可见的带状或线状沉淀带。
抗原抗体复合物的沉淀带是一种特异性的半渗透性屏障，它可以阻止免疫学性质与其相似的抗原抗体分子通过，而允许那些性质不相似的分子继续扩散，这样由不同抗原或不同抗体所形成的沉淀带各有各的位置，从而可以分离和鉴定混合系统。
利用琼脂糖凝胶作为扩散介质是因为一定浓度的琼脂糖凝胶，其内部为多孔网状。
而且孔径很大，可以允许大分子物质（分子量自十几万到几百万以上）自由通过。
因为大多数抗原和抗体的分子量都在20 万以上，所以它们在琼脂糖凝胶中几乎可以自由扩散。
而且琼脂糖凝胶又具有良好的化学稳定性、含水量大、透明度好、来源方便、处理容易等优点，因此是免疫沉淀检测技术中最理想的扩散介质。
双向免疫扩散法测定时将加热溶化的琼脂或琼脂糖浇至玻片上，等琼脂凝固后，打多个小孔，将抗原和抗体分别加入小孔内，使抗原和抗体在琼脂板上相互扩散。
当二个扩散圈相遇，如抗原和抗体呈特异性的结合且比例适当时，将会形成抗原抗体复合物的沉淀，该沉淀可在琼脂中呈现一条不透明的白色沉淀线。
如果抗原与抗体无关，就不会出现沉淀线，因此可以通过该试验，用特异性抗体鉴定抗原，或反之用已知抗原鉴定抗体。
三、实验仪器和试剂1、仪器设备载玻片、打孔器和挑针、湿盒、恒温箱、三角瓶、移液管、微量移液器2、试剂和材料（1）生理盐水（2）1.2%琼脂胶：称取1.2 g 琼脂糖，加100mL 生理盐水，加热溶解（3）抗原及相应免疫血清：抗原为人IgG，抗体为羊抗人IgG 免疫血清四、实验步骤1、制备琼脂玻片：将已加热溶化的1.2%琼脂5mL，迅速倾入洁净干燥的载玻片上，室温自然冷却凝固。
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实验一双向免疫扩散试验
一、实验目的
1、熟练掌握免疫扩散法的操作步骤
2、掌握抗血清效价的测定和特异性抗体的分析技术
二、实验原理
在一定条件下，抗原能与相应的抗体相互作用，发生免疫沉淀反应。
免疫扩散法就是使抗原与抗体在琼脂糖凝胶中自由扩散而相遇，从而形成抗原抗体复合物，由于此复合物分子量增大并产生聚集，不再继续扩散而形成肉眼可见的带状或线状沉淀带。
抗原抗体复合物的沉淀带是一种特异性的半渗透性屏障，它可以阻止免疫学性质与其相似的抗原抗体分子通过，而允许那些性质不相似的分子继续扩散，这样由不同抗原或不同抗体所形成的沉淀带各有各的位置，从而可以分离和鉴定混合系统。
利用琼脂糖凝胶作为扩散介质是因为一定浓度的琼脂糖凝胶，其内部为多孔网状。
而且孔径很大，可以允许大分子物质（分子量自十几万到几百万以上）自由通过。
因为大多数抗原和抗体的分子量都在20 万以上，所以它们在琼脂糖凝胶中几乎可以自由扩散。
而且琼脂糖凝胶又具有良好的化学稳定性、含水量大、透明度好、来源方便、处理容易等优点，因此是免疫沉淀检测技术中最理想的扩散介质。
双向免疫扩散法测定时将加热溶化的琼脂或琼脂糖浇至玻片上，等琼脂凝固后，打多个小孔，将抗原和抗体分别加入小孔内，使抗原和抗体在琼脂板上相互扩散。
当二个扩散圈相遇，如抗原和抗体呈特异性的结合且比例适当时，将会形成抗原抗体复合物的沉淀，该沉淀可在琼脂中呈现一条不透明的白色沉淀线。
如果抗原与抗体无关，就不会出现沉淀线，因此可以通过该试验，用特异性抗体鉴定抗原，或反之用已知抗原鉴定抗体。
三、实验仪器和试剂
1、仪器设备
载玻片、打孔器和挑针、湿盒、恒温箱、三角瓶、移液管、微量移液器
2、试剂和材料
（1）生理盐水
（2）1.2%琼脂胶：称取1.2 g 琼脂糖，加100mL 生理盐水，加热溶解
（3）抗原及相应免疫血清：抗原为人IgG，抗体为羊抗人IgG 免疫血清
四、实验步骤
1、制备琼脂玻片：将已加热溶化的1.2%琼脂5mL，迅速倾入洁净干燥的载玻片上，室温自然冷却凝固。
2、打孔：
在凝固的琼
脂糖胶上用
打孔器或吸
嘴按图 1 打
梅花孔（孔径
约3mm，孔距
4mm），用针
头小心挑去琼脂。
为便于识别加样方向或区分不同的组，可在琼脂糖胶边缘打上小孔或切角标记。
打孔完毕，将载玻片在酒精灯火焰上方过几遍，可防止漏液。
3、稀释免疫血清：取5 支0.5mL 的离心管，各加入10μL 生理盐水。
如图2 所示，取10μL 免疫血清加入1 号管中，吸打使其与生理盐水混匀，即为1︰2 稀释血清；再从1
号管吸取1︰2 稀释血清10μL 加入2 号管中，吸打混匀，即为1︰4 稀释血清；重复操作，
获得1︰8、1︰16 和1︰32倍比稀释血清。
图2 倍比稀释免疫血清
4、加样：以上方孔为第1 孔，按顺时针方向分别称为2、3、4、5 和6 孔。
抗原加入中心孔，倍比稀释的免疫血清加入周围孔，留1 孔加生理盐水，以作空白对照，每孔加样10μL。
5、温育：将琼脂糖胶置于湿盒（饭盒垫上纱布，加蒸馏水润湿）中，37℃温育12-24 h。
6、结果观察：观察抗原抗体产生的白色沉淀线。
免疫血清的滴度以一定抗原浓度下出现白色沉淀线的最高稀释度来表示。
五、注意事项
1、制备琼脂玻片时，用移液管向玻片加上琼脂时，要一次性迅速完成，防止形成气泡或在移液管中凝固，影响操作或结果。
2、打孔时，其他六个孔要尽量围着中间孔呈圆形均匀分布。
2、注意记录琼脂糖胶的标记和加样顺序。
六、结果分析
试验结果如右图所示:从
图中我们可以看到一条白
色沉淀线，说明以人IgG
与羊抗人IgG 免疫血清相
关，在琼脂糖凝胶中自由
扩散而相遇，从而形成抗
原抗体复合物。
而这条线
沿着各孔边缘弯曲，且随
着血清浓度从第一孔到第
五孔递减，第六孔为生理
盐水，其颜色从第一孔到
第五孔逐渐变浅，到第六
孔消失。
这符合试验原理，
证明试验操作成功。
七、问题讨论
1、为什么将载玻片在酒精灯火焰上方过几遍，可防止漏液？
答：因为加温可以使琼脂溶解，封闭住打孔可能产生的细小裂痕，以免试剂随裂痕漏出影响实验结果判定。