琼脂扩散实验
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实验二 马立克氏病 琼脂扩散实验
鸡马立克氏病是由 鸡 马 立 克 氏 病 病 毒 MDV） （ MDV ） 引起的鸡的一种 肿瘤性传染病。 肿瘤性传染病。临床上以 消瘦、麻痹、皮肤和内脏 消瘦、麻痹、 出现肿瘤为主要特征。 出现肿瘤为主要特征。可 造成严重的经济损失， 造成严重的经济损失，是 世界养鸡业的主要疾 病之一。 病之一。
实验步骤
抗原检测
Ag+ 2 6 5
抗体检测
1 2
6 5
Ab+ Ag+
3
Ag+ 4
3
检测羽髓抗原 检测羽髓抗原
2，3，5，6孔分别 ， ， ， 孔分别 加入倍比稀释的待检羽髓浸液 加入倍比稀释的待检羽髓浸液
检测待检血清 检测待检血清
1~5孔分别加入倍比稀释的待测效 孔分别加入倍比稀释的待测效 孔分别加入倍比稀释的 价的血清， 孔加 孔加PBS 价的血清，6孔加
标准琼扩抗原
待检羽髓浸液
此沉淀带的基本形式分为3种。
思考题
试分析在抗原和抗体分子量相同时，以下六种情况中抗原和 抗体的浓度差异以及在凝胶中的扩散率大小（用＞、＜、≈ 表示）
A
B
C
D
E
F
Ag Ab
鸡马立克氏病引起的劈叉姿势
马立克氏病诊断主要根据
流行病学 临床症状 病理组织学检查 病毒分离鉴定 血清学试验: ① 琼脂扩散实验(OIE推荐的替代试验方法) AGP可用于20日龄以上马立克氏病鸡羽髓 抗原检测和1月龄以上鸡血清抗体检测。 ② 酶联免疫吸附实验
实验目的要求、类型、 实验目的要求、类型、仪器与材料
目的要求 了解琼脂扩散试验进行疾病诊断的操作和结果判定方法 仪器与材料 器材：琼脂打孔器、微量移液器或带胶乳头滴管、平皿等。 试剂：马立克氏病标准抗原、标准阳性血清和标准阴性血清。 实验类型 单向单扩散、单向双扩散、双向单扩散、双向双扩散 双向双扩散
实验原理
利用可溶性抗原和抗体在半固体凝胶中进行相向扩散反应， 当抗原抗体分子相遇并达到适当比例时，就会互相结合、凝集， 在两孔之间比例最合适的位置上出现白色沉淀带，从而判定相应 的抗体和抗原。 可用于20日龄以上马立克氏病鸡羽髓抗原检测和1月龄以上 鸡血清抗体检测。
实验步骤
3．检测抗原时，中央孔加马立克氏病标准阳性血清，周边1、4 孔加马立克氏病标准琼扩抗原，周边2、3、5、6孔加待检羽髓 浸液，即在试管内加入1～2滴PBS然后将羽髓在其中挤压而成。 加样后将琼脂平皿置湿盒内，于37℃温箱孵育，8～24h内观察 结果。
注意事项
1、切勿剧烈振荡融化后的琼脂糖，防止气泡的出现。 2、反应时间要适宜，时间过长，沉淀线可解离而导致假 阴性、不出现或不清楚。 3、加样时，注意不要产生气泡，以加满为度。 4、每加完不同的样后要更换枪头，以免造成污染。
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实验原理
A. B. C. D. 琼脂糖的疏散网状结构有利于大分子的自由迁移； 合适比例的抗原抗体结合后聚集形成沉淀； 沉淀的产生阻止抗原抗体复合物的自由运动； 沉淀带一经形成，就像一道特异性的屏障一样，继续扩散而 来的相同的抗原抗体，只能是沉淀带加浓加厚，而不能再向 外扩散，但对其他抗原抗体系统则无屏障作用。
实验原理
沉淀线的特征与位置： 1 2 3 抗原、抗体的特异性和浓度 抗原、抗体分子的大小 扩散率
实验原理
a.如抗原抗体的浓度基本平衡时，此沉淀带的位置主要决定 于两者的扩散系数。 b.如果抗原过多，则沉淀带向抗体偏移，反之亦然。
实验原理
c.
抗原分子量> 抗原分子量>抗体分子量
抗原分子量= 抗原分子量=抗体分子量
抗原分子量< 抗原分子量<抗体分子量
实验步骤
琼脂平板制备
0.01M PBS
1%琼脂粉 琼脂粉
1／万硫柳汞 ／
水浴加热融化
封底
实验步骤
鸡群马立克氏病感染情况的监测通常采用琼脂扩散试验， 检测对象包括：血清中马立克氏病病毒特异抗体或感染鸡羽髓 中马立克氏病病毒抗原。其操作方法如下： 1．琼脂糖平板制备 用0.01M pH7.4的PBS配制1％琼脂糖溶
液，水浴加温充分溶化后，加入培养皿，制成厚度约2～3mm厚 的琼脂糖凝胶板；置于室温下冷却凝固后，用7孔（梅花孔）打 孔器准确打孔，加热封底。
实验步骤
2．检测血清抗体时，中央孔内滴加马立克氏病病毒标准琼扩抗 原，周边孔滴加待检血清，但至少一孔加阳性血清，抗原和血 清的加入量以加满而不溢出为度。样品加毕后，将琼脂平皿加 盖后平放于加盖的湿盒内，37℃温箱中孵育8～24h，观察并记 录结果。测定抗体效价时可倍比稀释血清，以出现沉淀带的血 清最大稀释度为抗体效价。
结果判定
当被检样品孔与中心孔之间形成清晰的沉淀线，并与周边已 知抗原孔的沉淀线互相融合时判为阳性；不出现沉淀线者判为 阴性
结果判定
已知抗原与阳性血清之间所产生的沉淀线末端弯向 被检样品孔内侧时，则该被检样品判为弱阳性。 Ab+ 待检血清
Ag+
结果判定
被检材料可能出现两条以上沉淀线，其中一条与已知抗原和 阳性血清的沉淀线融合者判为阳性。当抗原存在多种成分时，将 呈现多条沉淀线以至交叉反应线，因此可用来检查抗原和免疫血 清的特异性、纯度或浓度，比较抗原之间的异同点，因而应用范 围较广。
鸡马立克氏病是由 鸡 马 立 克 氏 病 病 毒 MDV） （ MDV ） 引起的鸡的一种 肿瘤性传染病。 肿瘤性传染病。临床上以 消瘦、麻痹、皮肤和内脏 消瘦、麻痹、 出现肿瘤为主要特征。 出现肿瘤为主要特征。可 造成严重的经济损失， 造成严重的经济损失，是 世界养鸡业的主要疾 病之一。 病之一。
实验步骤
抗原检测
Ag+ 2 6 5
抗体检测
1 2
6 5
Ab+ Ag+
3
Ag+ 4
3
检测羽髓抗原 检测羽髓抗原
2，3，5，6孔分别 ， ， ， 孔分别 加入倍比稀释的待检羽髓浸液 加入倍比稀释的待检羽髓浸液
检测待检血清 检测待检血清
1~5孔分别加入倍比稀释的待测效 孔分别加入倍比稀释的待测效 孔分别加入倍比稀释的 价的血清， 孔加 孔加PBS 价的血清，6孔加
标准琼扩抗原
待检羽髓浸液
此沉淀带的基本形式分为3种。
思考题
试分析在抗原和抗体分子量相同时，以下六种情况中抗原和 抗体的浓度差异以及在凝胶中的扩散率大小（用＞、＜、≈ 表示）
A
B
C
D
E
F
Ag Ab
鸡马立克氏病引起的劈叉姿势
马立克氏病诊断主要根据
流行病学 临床症状 病理组织学检查 病毒分离鉴定 血清学试验: ① 琼脂扩散实验(OIE推荐的替代试验方法) AGP可用于20日龄以上马立克氏病鸡羽髓 抗原检测和1月龄以上鸡血清抗体检测。 ② 酶联免疫吸附实验
实验目的要求、类型、 实验目的要求、类型、仪器与材料
目的要求 了解琼脂扩散试验进行疾病诊断的操作和结果判定方法 仪器与材料 器材：琼脂打孔器、微量移液器或带胶乳头滴管、平皿等。 试剂：马立克氏病标准抗原、标准阳性血清和标准阴性血清。 实验类型 单向单扩散、单向双扩散、双向单扩散、双向双扩散 双向双扩散
实验原理
利用可溶性抗原和抗体在半固体凝胶中进行相向扩散反应， 当抗原抗体分子相遇并达到适当比例时，就会互相结合、凝集， 在两孔之间比例最合适的位置上出现白色沉淀带，从而判定相应 的抗体和抗原。 可用于20日龄以上马立克氏病鸡羽髓抗原检测和1月龄以上 鸡血清抗体检测。
实验步骤
3．检测抗原时，中央孔加马立克氏病标准阳性血清，周边1、4 孔加马立克氏病标准琼扩抗原，周边2、3、5、6孔加待检羽髓 浸液，即在试管内加入1～2滴PBS然后将羽髓在其中挤压而成。 加样后将琼脂平皿置湿盒内，于37℃温箱孵育，8～24h内观察 结果。
注意事项
1、切勿剧烈振荡融化后的琼脂糖，防止气泡的出现。 2、反应时间要适宜，时间过长，沉淀线可解离而导致假 阴性、不出现或不清楚。 3、加样时，注意不要产生气泡，以加满为度。 4、每加完不同的样后要更换枪头，以免造成污染。
Leabharlann Baidu
实验原理
A. B. C. D. 琼脂糖的疏散网状结构有利于大分子的自由迁移； 合适比例的抗原抗体结合后聚集形成沉淀； 沉淀的产生阻止抗原抗体复合物的自由运动； 沉淀带一经形成，就像一道特异性的屏障一样，继续扩散而 来的相同的抗原抗体，只能是沉淀带加浓加厚，而不能再向 外扩散，但对其他抗原抗体系统则无屏障作用。
实验原理
沉淀线的特征与位置： 1 2 3 抗原、抗体的特异性和浓度 抗原、抗体分子的大小 扩散率
实验原理
a.如抗原抗体的浓度基本平衡时，此沉淀带的位置主要决定 于两者的扩散系数。 b.如果抗原过多，则沉淀带向抗体偏移，反之亦然。
实验原理
c.
抗原分子量> 抗原分子量>抗体分子量
抗原分子量= 抗原分子量=抗体分子量
抗原分子量< 抗原分子量<抗体分子量
实验步骤
琼脂平板制备
0.01M PBS
1%琼脂粉 琼脂粉
1／万硫柳汞 ／
水浴加热融化
封底
实验步骤
鸡群马立克氏病感染情况的监测通常采用琼脂扩散试验， 检测对象包括：血清中马立克氏病病毒特异抗体或感染鸡羽髓 中马立克氏病病毒抗原。其操作方法如下： 1．琼脂糖平板制备 用0.01M pH7.4的PBS配制1％琼脂糖溶
液，水浴加温充分溶化后，加入培养皿，制成厚度约2～3mm厚 的琼脂糖凝胶板；置于室温下冷却凝固后，用7孔（梅花孔）打 孔器准确打孔，加热封底。
实验步骤
2．检测血清抗体时，中央孔内滴加马立克氏病病毒标准琼扩抗 原，周边孔滴加待检血清，但至少一孔加阳性血清，抗原和血 清的加入量以加满而不溢出为度。样品加毕后，将琼脂平皿加 盖后平放于加盖的湿盒内，37℃温箱中孵育8～24h，观察并记 录结果。测定抗体效价时可倍比稀释血清，以出现沉淀带的血 清最大稀释度为抗体效价。
结果判定
当被检样品孔与中心孔之间形成清晰的沉淀线，并与周边已 知抗原孔的沉淀线互相融合时判为阳性；不出现沉淀线者判为 阴性
结果判定
已知抗原与阳性血清之间所产生的沉淀线末端弯向 被检样品孔内侧时，则该被检样品判为弱阳性。 Ab+ 待检血清
Ag+
结果判定
被检材料可能出现两条以上沉淀线，其中一条与已知抗原和 阳性血清的沉淀线融合者判为阳性。当抗原存在多种成分时，将 呈现多条沉淀线以至交叉反应线，因此可用来检查抗原和免疫血 清的特异性、纯度或浓度，比较抗原之间的异同点，因而应用范 围较广。