食品检测培训课件

分子生物学细菌鉴定

1. 2.
16S rRNA分析 特异片段扩增


3.DNA指纹技术 （RFLP－DNA的限制 性片段长度多态性 , RAPD-随机扩增多态性 )
PCR仪
BD Phoenix System“凤凰” 全自动细菌/鉴定药敏系统
1．概况1998年Becton Dickinson and Company公司 Phonenix全自动细菌鉴定药敏系统
VIDAS
原理： VIDAS(bioMerieux Vitek公司)是应用酶 联免疫荧光试验 (ELFA)检测食品中的 病原菌。即用荧光标 记后的抗体检测特异 性的抗原 (沙门氏菌、 李斯特菌、葡萄球菌 毒素、E．Coli O157和单核细胞增生 李斯特氏菌)
FDA认可使用的检测系统
就到这里！谢谢大家！
食品微生物检验
2011.5.19
一、微生物检测工作的意义

据世界卫生组织估计，在全世界每年数以亿计的 食源性疾病患者中，70％是由于食用了各种致病 性微生物污染的食品和饮水造成的。2000年至 2002年，中国疾病预防控制中心营养与食品安全 所对全国部分省市的生肉、熟肉、乳和乳制品、 水产品、蔬菜中的致病菌污染状况的监测结果表 明，微生物性食物中毒仍居首位，占39.62％；化 学性食物中毒占38.56％；动植物性和原因不明的 食物中毒均占10％左右。


三级生物安全水平（BSL-3）：能够安全地从 事国内和国外的，可能通过呼吸道感染，引起严 重或致死性疾病的病原微生物工作的生物安全水 平。如：炭疽芽孢杆菌、鼠疫杆菌、结核分枝杆 菌、狂犬病毒 四级生物安全水平（BSL-4）：能够安全地从 事国内和国外的，能通过气溶胶传播，实验室感 染高度危险，严重危害人和动物生命和环境的， 没有特效预防和治疗方法的微生物工作的生物安 全水平。与上述相近的或有抗原关系的，但尚未 完全认识的病原体也应在此种水平条件下进行操 作，直到取得足够的数据后，才能决定是继续在 此种安全水平下工作还是在低一级安全水平下工 作。如：埃博拉病毒、马尔堡病毒、天花病毒
灭菌彻底与否指示

灭菌指示胶带（3M） 生物指示（嗜热脂肪芽孢杆菌 121.1℃）
紫外灯相关

强度：对室内空气的消毒，直接照射法：采用室内悬吊式 紫外线消毒时，室内安装紫外线消毒灯（30Ｗ紫外灯，在 1.0m 处的强度 >70μW/cm2）的数量为平均每立方米不 少于 1.5W，照射时间不少于30min。


原理：细菌先经碱性染料结晶紫染色，而经碘液 媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌此 色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为 两大类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为 革兰氏阴性菌（ Gˉ ）。 G﹢菌：细胞壁厚，肽 聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时， 肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物 在细胞膜上。呈紫色。 Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联 松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高, 乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出 细胞壁，番红染液复染后呈红色。 革兰氏阳性菌：葡萄球菌属（主要是金黄色葡萄 球菌）、蜡样芽孢杆菌、单增李斯特氏菌等；革 兰氏阴性菌：埃希氏菌属、沙门氏菌属、志贺氏 菌属（痢疾杆菌等）、霍乱弧菌、副溶血性弧菌 等。
原理 采用荧光增强原理 与传统酶、底物生化呈 色反应结合。（菌种库 270种细菌）
MicroScan微生物自动鉴定及药敏系统

概况 MicroScan自动细菌鉴定系统包括半自动系列 AutoScan-4以及全自动系列Walkaway 40/96 。是美国最 普遍使用的鉴定系列之一。 原理 将荧光物质均匀 地混在培养基中，菌 种接种到鉴定板，通 过检测荧光底物的水 解、底物被利用后的 pH变化，特殊代谢产 物的生成和某些代谢 产物的生成率来进行 菌种鉴定。

Sensititre (自动荧位数码鉴定及荧光分析相 结合。荧光分析是用荧光标记细菌表面特异酶的底物，经 细菌水解底物产生荧光来判断结果
AutoReader ARIS（可以自动孵育）
VITEK
VITEK-ATB(半自动微生物鉴定和药敏系统) Vitek-AMS（全自动细菌鉴定和药敏分析系统 ） Vitek II
紫外线辐照时间计算

照射剂量和时间：不同种类的微生物对紫外线的敏感性不同，用紫外 线消毒时必须使用照射剂量达到杀灭目标微生物所需的照射剂量。 杀灭一般细菌繁殖体时，应使照射剂量达到10 000μW.s/cm2；杀灭 细菌芽孢时应达到100 000μW.s/cm2；病毒对紫外线的抵抗力介于细 菌繁殖体和芽胞之间；真菌孢子的抵抗力比细菌芽孢更强，有时需要 照射到600 000μW.s/cm2，但一般致病性真菌对紫外线的抵抗力比细 菌芽胞弱；在消毒的目标微生物不详时，照射剂量不应低于100 000μW.s/cm2。辐照剂量是所用紫外线灯在照射物品表面处的辐照强 度和照射时间的乘积。因此，根据紫外线光源的辐照强度，可以计算 出需要照射的时间。例如，用辐照强度为 70μW/cm2 的紫外线表面 消毒器近距离照射物品表面，选择的辐照剂量是 100 000μW.s/cm2， 则需照射的时间是： 100 000μW.s/cm2 ÷ 70μW/cm2 = 1429 s ÷ 60s ≌ 24min。
六、提高检测速度的一些方法
一、设备更新： 移液管、吸球/移液器

普通高压蒸汽灭菌器/全自动高压蒸汽灭菌器

搅拌器或匀浆机/拍击式均质器


二、采用快速检测方法进行粗筛 纸片法 快速检测试剂盒
测试片检测结果图像
七、常见微生物检测设备
Biolog全自动快速微生物鉴定仪
Biolog微生物鉴定数据库容量是目前世界上最大 的，可鉴定包括细菌、酵母和丝状真菌在内总计 1973种微生物，涵盖了所有的人类、动物、植 物病原菌以及食品和部分环境微生物，其中细菌 234个属，1 226个种。 原理： Biolog自动微 生物分析系统主要 根据细菌等95种碳 源的利用情况,配合 四唑类显色物质进 行鉴定。
三、 无菌操作和注意事项 1、概念的理解 无菌是指物体中没有活的微生物存在。 防止微生物进入人体或物体的操作方法， 称为无菌技术或无菌操作。 关键点： 人：操作前洗手更衣等 物：试剂器械 环境：无菌室
四、 革兰氏染色




革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别 染色法，1884年由丹麦医师、细菌学家 Christain Gram创立。 步骤： a. 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液 ，染1min，水洗。 b. 滴加革兰氏碘液，作用lmin，水洗。 c. 滴加95%乙醇脱色约15-30s，直至染色液被洗 掉，不要过分脱色，水洗。 d. 滴加复染液，复染lmin，水洗、待干、镜检。

传统的微生物检测方法，主要包括形态检查和生化方法，
涉及的实验较多、操作繁琐、需要时间较长、准备和收尾
工作繁多。

1955年德国学者F.J.Forg 发明了一种简单快速的大肠菌 群快速检测法—纸片法，使原来的检测周期由72小时缩短 到15小时，材料成本降低了四分之三，同时大大简化了操
作程序。从此，这种生化检测方法开始发展起来。


更换频率：紫外线灯使用过程中其辐照强度逐渐降低，故 应定期测定消毒紫外线的强度，一旦降到要求的强度以下 时，应及时更换。 紫外线消毒灯的使用寿命，即由新灯 的强度降低到70μW/cm2 的时间(功率≥30W)，或降低到 原来新灯强度的 70%（功率 <30Ｗ）的时间，应不低于 1000h。紫外线灯管有高硼玻璃和石英玻璃之分，由于高 硼玻璃的UV254nm紫外线透过率只有50%左右，一般只 有1000小时；石英是紫外线透过率最高的材料，普通石英 可以透过UV254的80%以上，石英玻璃紫外线灯寿命一般 大于6000小时，进口的紫外线灯可以到8000h以上，部分 厂家可以达到1200小时。 紫外线强度计至少1年标定1次 。
五、BSL简介




biology security level (BSL):生物安全水平 根据所用病原微生物的危害程度、对人和动物的易感 性、气溶胶传播的可能性、预防和治疗的可行性等因素， 其实验室生物安全水平共分为四级，一级最低，四级最高 。 一级生物安全水平（BSL-1）：能够安全操作，对实 验室工作人员和动物无明显致病性的，对环境危害程度微 小的，特性清楚的病原微生物的生物安全水平。 二级生物安全水平（BSL-2）：能够安全操作，对实 验室工作人员和动物致病性低的，对环境有轻微危害的病 原微生物的生物安全水平。如：大肠埃希氏菌

另外，将培养基固化在试剂盒中的速测盒法，也是一种较 为简洁快速的检测方法，省去了大量的实验准备工作。
二、开展微生物检测所需的基本条件



无菌室（含紫外灯等消毒设备的隔离空间）； 恒温培养箱； 微生物检测设备、器皿、试剂等； 高压灭菌锅；（灭菌是否彻底） 具备以上设备和无菌操作概念即可进行检测了。