高效液相色谱定性定量分析方法

一些商品化仪器
流动相 脱气装置
四元泵
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检测器 柱温箱 样品盘
控温箱
启动液相色谱仪器的流程
开启HPLC系统各个设备的电源 打开泵、自动进样器、检测器电源，
待设备通过自检后，打开计算机启动 色谱管理软件 准备流动相
过滤，脱气 色谱泵排气
用新配制的流动相灌注泵
高效液相色谱仪组成
▫ 输液系统 ▫ 进样系统 ▫ 分离系统 ▫ 检测系统 ▫ 数据记录处理系统
采用梯度洗脱时，柱在重复使用前，用泵把几倍于柱体 积的起始溶剂压经柱子，以重新建立起始的平衡来得到再 生。
HPLC检测器应提供的功能
• 对样品有响应并有一个输出信号 • 应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性关系；并
且所设计的校正技术应该促进这种关系
理想的HPLC检测器
• 高灵敏度；可忽略的基线噪音 • 宽的线性范围 • 独立于流动相及操作参数的响应
液相色谱流程图
溶剂
HPLC色谱柱
数据处理系统
自动进样器 色谱泵
检测器
废液
液相色谱的流动相
色谱液柱：相Zo柱rbax-S-ta-b4保l.e6B*o2留n5d0mmC值,158um与pH的关系
流动相：27%甲醇：73%磷酸 pH： 2.5&2.6 温度： 50℃ 流速： 1.0mL/min.
pH变化值 0.1
高效液相色谱定性定量分析方法
基本原理和特点
➢基本原理：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固 定相时,由于与 固定相(stationary phase)发生作用(吸附, 分配,离子吸引,排阻,亲和)的大小,强 弱不同,在固定相中 滞留时间不同,从而先后从固定相中流出.
➢特点：分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动 化。
▫ 更好的定量
▫ 更好地完成色谱峰纯度/均一性
N
吸• 光目度前（实A验bs室or中ba最nc流e 行UV的/V选is择）检测 ▫ 多数公司约75%的检测器是吸光度检测器（其中50%是多 波长，25%是PDA）
• 测量通过溶液后的紫外或可见光光强度的损失 • 吸光度与样品浓度呈线性关系 • 在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大
RS变化值 1.6
2. 流动相类别
按流动相组成分：单组分和多组分 按极性分：极性、弱极性、非极性 按使用方式分：等度洗脱和梯度洗脱
对溶剂的要求 • 水：
去离子水
自动纯水仪
纯净水
商品瓶装水
• 溶剂:
色谱纯（甲醇，乙腈，乙醇，丙酮，异丙醇）
• 试剂:
分析纯
• 不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质要 求越高放置时间越短。
吸• 光这度种检检测测器器（简U单V/、Vi可s）靠－ 优点 • 多数人熟悉并喜欢这种技术 • 可以作梯度实验并且是非破坏性的 • 大多数有机化合物有一定程度的吸光度 • 一般来说灵敏度还可以
▫ 对压力、温度及流速等变化不敏感 • 长时间操作的稳定性 • 低死体积 • 非破坏性 • 选择性
灵敏度：信噪比
• 灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音的6比:1值
（S/N）
• 检测限（LOD）：S/N = 2~4
• 定量限（LOQ）：S/N = 8~10
• 好的信噪比有利于：
S
▫ 更好的色谱峰确认
普通分析型液相色谱的滞后体积为2~4ml
滞后体积变化的影响
设计不好的HPLC系统，滞后体积随反压变化 滞后体积随反压变化的后果：
梯度的准确性不好，造成：方法的适应性不好 用静态梯度混合器；固定滞后体积可明显改善梯度特性
固定滞后体积，改善了梯度性能 梯度百分比
梯度曲线
好的梯度 滞后曲线
保留时间
2．梯度洗脱的主要条件 ① A 流动相/弱溶剂组成；
强溶剂 A%
② B 流动相/强溶剂组成；
③ 梯度时间；
④ 梯度曲线：线性、凸型或凹型等。
time
5 2 1
梯度洗脱
3
2 1
梯度：低压混合
• 低压梯度 ▫ 用单泵产生梯度，泵前（低压端）混合 ▫ 对脱气要求高 ▫ 不易调节梯度的滞后体积
• 如设计不当，梯度的 准确性受影响 ▫ 滞后体积（系统 体积）设计合理
普通的低压梯度系统 梯度百分比
不好的梯度 滞后曲线
保留时间
液相色谱的色谱柱
色谱柱的连接
Stop_depth长度不合适造成柱前死体积
色谱柱的连接
锥箍锥度不合适造成渗漏
可能提高柱效的方法
除去柱上端固定相变色部分 (约3mm左右)，再补充新的 固定相。
色谱柱吸附未被洗脱成分时，柱效将明显下降，选合适 的溶剂进行洗净。
流动相的保存
有机溶剂流动相：
室温下密封，避光保存
缓冲盐流动相：
当日现配现用： 低温下密封保存，一般不超过3天 防止微生物生长
有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相：
低温密封保存 防止有机相的挥发
选用适宜的容器
1．梯度洗脱的特点
（1）改善分离, 加快分析速度； （2）改善峰形, 减少拖尾, 有利于 痕量组分的检测； （3）增加峰容量； （4）强烈滞留的组分不容易残留在 柱上, 保持柱性能长期良好； （5）下次分析时, 流动相需要一段 平衡时间；不同溶剂的UV吸收程度稍 有差异, 可能会引起基线漂移
梯低压梯度滞A DB后C：系溶 系统剂 统体(输泵积送)的影阻 混响尼 合器 器
度 比例阀
进样器
色谱柱
检测器
滞后(系统)体积
注意∶滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路
滞后(系统)体积
高 压
溶剂输送 系统(泵)
梯 度
溶剂输送
系统(泵)
进样器
梯度混合器
死体积/谱带展宽体积 (无色谱柱时)
色谱柱
• 理想的HPLC用水应为18.2Ω的超纯水，并通过0.22um 的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。
过滤与脱气
过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是 使用无机盐配制的缓冲液。
脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响： 1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形 3）检测器中的气泡产生基线波动
检测器
梯度滞后大小的影响
滞后体积太大会引起梯度变化的延迟 ▫ 例如：滞后体积为2.0ml，流速1.0ml/min 实际梯度会比设置值晚 2 分钟响应，没有问题 ▫ 对微柱色谱影响更大，同上例但流速0.1ml/min 实际梯度会比设置值晚20 分钟响应，不能接受
滞后体积的不同会使方法转换麻烦 ▫ 滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现 ▫ 滞后体积的变化会导致梯度重现性不好