4.光合作用

注意电极与反应液间不能留有气泡！

开启光源，每隔10秒记录一次氧浓度，共10~20次 全链、PSI、PSII活性各重复测定3次 数据处理



取氧浓度直线变化部分数据，计算氧浓度变化速度 用每毫克叶绿素每秒释放或消耗的氧表示光合电子传递 速率
注意事项





叠氮化钠和甲基紫精等实际有毒，注意采 取防护措施。 操作过程维持低温，尽可能避免直射光 氧电极反应杯每次测定前需清洗干净、去 除水滴。小心操作避免损坏。 透镜聚光焦点处温度较高，反应杯应使用 循环水浴；小心操作避免灼伤。 实验失败要自行检查原因，然后重做实验
类囊体膜制备 及光合电子传递活性分析
实验目的

掌握叶绿体和类囊体膜的制备方法 了解氧极谱法分析光合电子传递活性的原 理，掌握光系统不同组分活性的分析方法
光合作用仪器分析方法 的基本原理及其应用
调制式叶绿素荧光仪
溶解氧分析仪
实验原理

光合作用

光反应：水的光解与光合电子传递 暗反应：C同化 放氧复合体 PS II PS I ……
2 50 mM Hepes 10 mM NaCl 2 mM NH4Cl 3 mM MgCl2 1.0 mM 叠氮化钠（有毒，注意） 用NaOH调节pH值到 7.5 0.5 mM MV（剧毒，最后加，MW=256）

PSI反应液：取全链反应液100mL添加以下物质


1mM 还原型抗坏血酸（易氧化，不能长时间存放） 10 μM DCMU 3 100 μM DCIP
2.光合作用 饱和光强
*PS
3.电子接收能力不限
1.电子供给饱和
PS
4.合适的监测指标
光合电子传递链（Z-scheme）
*PSI
FeS
*PSII
Pheo QA QB PQ DCMU Cyt b6f PC MV
Fd
NADP+
NADP+还原酶
2e
O2
PSI
NADPH
H2O
放氧复合体
DCIP
2e
O2
2e

叶绿体提取液/悬浮液（Hepes-NaOH, pH7.6），1L

20 mM Hepes 0.5M 蔗糖 10 mM NaCl, 用NaOH调节pH值到 7.6， 冷却到4 ℃备用
1
ຫໍສະໝຸດ Baidu
调pH的NaOH统一配置为200 mM

全链（PSI+PSII）反应液，200mL




Chl = (8.02×OD663 + 22.21×OD645)/1000×总稀释倍数 叶绿体原液中总叶绿素含量应在1 mg/ml以上

稀释叶绿体悬浮液到1 mg/ml叶绿素

随后实验需要 约1 ml，制备2 ml

电子传递活性测定（放氧或吸氧）

预先将反应液温度平衡到室温温度 取0.9 ml反应液到反应杯中，加入0.1 ml叶绿体悬 浮液（反应体系含100 μg叶绿素），插入氧电极， 平衡稳定2-3分钟

影响光反应的因素（内因）

光合电子传递链（Z-scheme）
*PSI
FeS
*PSII
Pheo QA QB PQ Cyt b6f PC
Fd
NADP+
NADP+还原酶
2e
NADPH
O2
2e PSI
H2O
放氧复合体
O2
2e
PSII
O2-. H2O + O2 H2O2
假环式电子传递
光系统电子传递能力（最大活性） 检测基本原理

可逆结合

阻断电子从PSII到PSI（实际上是PC）的传递
抑制放氧复合体的释放氧气，但电子传递仍能 正常进行

叠氮化钠的作用


MV（甲基紫精、百草枯）的作用

在PSI后接收电子 获得的电子很容易传递给O2，产生超氧阴离子 自由基

常用作氧化胁迫（oxidative stress）试剂
仪器与试剂
思考问题

提取液、反应液中各种试剂的作用 影响试验结果的因素

仪器

低温离心机 溶解氧测定仪
HEPES NaCl NaOH NH4Cl 蔗糖 氯化镁 抗坏血酸（钠盐，还原型） 叠氮化钠 MV（甲基紫精， Methyl Viologen） DCMU（敌草隆） DCIP（2,6-2二氯酚靛酚， 2,6-二氯靛酚钠）

试剂





试剂配制

PSII反应液（Hepes-NaOH, pH7.0），100mL 50 mM Hepes 4 10 mM NaCl 2 mM MgCl2 30 μM DCIP 用NaOH调节pH值到 7.0
实验步骤

叶绿体提取



取菠菜叶片10 g，用30 ml（10 + 20 ml）提取缓冲液 于冰上研磨匀浆 匀浆用三层纱布过滤，滤液转到50ml离心管 500g，4 ℃离心5 min，取上清液到新管中，弃残渣 3000g，4 ℃离心10 min，去上清液，沉淀用10 ml提 取缓冲液悬浮 5000g，4 ℃离心10 min，沉淀用3 ml提取缓冲液悬浮， 4 ℃水浴保存备用

叶绿素含量测定

分别取0.2 ml叶绿体悬浮液到3个1.5 ml EP管中，各加 入0.8 ml丙酮，震荡混匀（此处稀释了5倍） 4 ℃ 10000g离心10分钟，将上清液转移到新管中 取叶绿素溶液，稀释适当倍数，测定OD663和OD645 计算出叶绿体悬浮液中的叶绿素浓度（取平均值）
PSII
希尔反应（Hill reaction）
*PSII 离体叶绿体在光照条件下照光，使水分 解，释放氧气并还原电子受体的反应
2e
+
Fe3+ DCIP
……
H2 O
放氧复合体
O2
2e
PSII
希尔氧化剂。完整叶绿体是双层膜结构， 如果使用希尔氧化剂不能自由通过叶绿 体膜则不发生希尔反应，但裸露的类囊 体膜可以。这个性质可用于检测实验提 取得到叶绿体的完整度。

DCIP（也称DCPIP）的作 用

希尔氧化剂

蓝色，被还原后无色

可用于比色测定

可接收PSII传递来的电子被 还原；也可以被抗坏血酸等 还原剂还原，还原后可作为 PSI的电子供体
3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1dimethylurea

DCMU的作用

阻断PQ与光系统II的结合位点