凝胶层析法

－、凝胶层析的基本原理
凝胶层析的原理
l 分子大小不同混合物上柱； 2 洗脱开始，小分子扩散进人凝胶 颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；3 大小分子分开： 4大分子行程 较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中
凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每 个颗粒犹如一个筛子。当样品溶液通过 凝胶柱时，相对分子质量较大的物质由 于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗 粒间的孔隙，随着溶剂流动，因此流程 较短，向前移动速度快而首先流出层析 柱；反之，相对分子质量较小的物质由 于直径小于凝胶网孔，可自由地进出凝 胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，它 们从凝胶内扩散到胶粒孔隙后再进入另
像Sephadex一样，商品聚丙烯酰胺为颗粒 状的干粉，它有十分明显形成块状并粘附在一 起的倾向，在溶剂中能自动溶胀成胶。 根据聚丙烯酰胺凝胶的溶胀性质和分离范 围的不同，可分成10种类型。各种类型均以英 文字母P和阿拉伯数字表示，从Bio-Gel P-2至 Bio-Ge1 P-300。P后面的阿拉伯数字乘以1000 即相当于排阻限度（按球蛋白或肽计算）。目 前，美国Bio-Rad Laboratories生产并出售多 种规格的Bio-Gel P。
3．分离条件缓和。凝胶骨架亲水，分 离过程又不涉及化学键的变化，所以对 分离物的活性没有不良影响。 4．应用广泛。适用于各种生化物质，如 肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸的分离 纯化、脱盐、浓缩以及分析测定等。分离 的分子量范围也很宽，如Sephadex G类为 102～105d；Sepharose类为105～108d。
式中Ve为脱体积，它包括自加入样品时算 起，到组分最大浓度出现时所流出的体积。 Kd为每个溶质分子在流动相和固定相之间的 一个特定的分配系数，它只与被分离物质分 子大小和凝胶颗粒内孔隙大小分布有关。Kd 可通过实验由Ve、Vo和Vi求得。
Ve＝Vo＋Kd.Vi
可改写为：
（Ve-Vo） Kd=－－－－ Vi
聚丙烯酰胺凝胶的结构
在聚丙烯酰胺凝胶的合成过程中，单体和交 联剂的配比可以任意改变。以（T）代表100mL凝 胶溶液中含有的单体和交联剂总克数，称为凝胶 浓度。而其中交联剂占单体和交联剂总量的百分 比称为交联度，以（C）表示，交联度越大，网 孔越小，交联度越小，则网孔越大。聚丙烯酰胺 凝胶全是由碳一碳骨架构成，稳定性较好，适合 于做凝胶层析的载体。只有在极端pH条件下酰胺 键才被水解为羧基，使凝胶带有一定的离子交换 基团，故一般只在pH2～11的范围内使用。
。
美国的为Bio－GA，有6个型号，即Bio-G 0.5M，1.5M，5M，15M，50M和150M。阿拉伯 数字乘以106表示排阻限度。
英国的称为Sagavac，又分为 Sagavac 2F，4F，6F，8F，10F和2C， 4C，6C，8C，10C。前面的阿拉伯数字 表示凝胶中干胶的百分数，F代表粉末 状，C代表颗粒状。 丹麦的称为Gelarose，有5种类型， 即2％，4％，6%，8％和10％。
琼脂糖凝胶做成珠状后不再脱水 干燥，否则不能再溶胀恢复原有形状， 因此商品大都以含水状态供应，并应 在湿态保存。一般悬浮在l0-3 mo1/L EDTA和0.02%叠氮化钠溶液中。百分数 表示干胶量。
四、凝胶层析技术
（一）凝胶的选择与处理
选择适宜的凝胶是取得良好分离效 果的最根本的保证。选取何种凝胶及其 型号、粒度，一方面要考虑凝胶的性质， 包括凝胶的分离范围（渗入限与排阻限） 还有它的理化稳定性、强度、非特异吸 附性质等；另一方面还要注意到分离目 的和样品的性质。
3．葡聚糖凝胶离子交换剂
在G类凝胶上引入一些酸性或碱性基团后， 则制得各种葡聚糖凝胶离子交换剂 。 如 引 入 磺 乙 基 （ SE-Sephadex ） 、 羧 甲 基 （ CM-Sephadex ） 及 二 乙 胺 基 乙 基 （ DEAESephadex A）等。葡聚糖凝胶离子交换剂具有 离子交换和分子筛双重作用。其结构多孔、疏 松、非特异性吸附很少，层析时流速易控制， 特别适用于蛋白质、酶、激素、多核苷酸等的 分离纯化，以及生化制剂的除热原。
4．聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶也是一种人工合成凝胶，其 商品名为生物凝胶P（Bio-gel-P），和交联 葡聚糖一样，为颗粒状干粉，在溶剂中能自 动吸水溶胀成凝胶。其由单体丙烯酰胺
和交联剂甲叉双丙烯酰胺
通过自由基引发聚会形 成聚丙烯酰胺凝胶。 （见下图）。只要控制单体用量和交联剂 的比例，就能得到不同型号的凝胶。
10.在凝胶层析中要想得到好的层析结果 应注意那些问题和采取那些措施？ 11.凝胶用过后，有那几种保存方法？ 12.葡聚糖凝胶离子交换剂，葡聚糖凝胶 和离子交换剂有何异同及特点？
凝胶层析（gel chromatography）常出 现多种名称 ：
如凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析、凝 胶渗透层析等。
Vi简称内水体积，可由g· Wr求得（g为干 凝胶质量，单位为g，Wr为凝胶吸水量，以mL ／g表示）。Vi也可以从洗脱一种完全不受凝 胶微孔排阻的小分子溶质（如重铬酸钾）的 洗脱体积Ve计算，即
Ve＝Vo＋Vi
对某物质在凝胶柱内洗脱体积Ve、Vo和 Vi之间的关系可用下式表示： Ve＝Vo＋Kd.Vi
一凝胶颗粒，如此不断地进入与逸出，使 流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱。 而中等大小的分子，它们也能在凝胶颗粒 内外分布，部分进入颗粒，从而在大分子 物质与小分子物质之间被洗脱。这样，经 过层析柱，使混合物中的各物质按其分子 大小不同而被分离。
Vt=Vo+Vi+Vg
Vt=π R2h
V。简称为外水体积，Vo等于被完全排阻 的大分子的洗脱体积。可以用一个已知相对 分子质量远超过凝胶排阻极限的有色分子， 如常用的蓝色葡聚糖-2000溶液通过柱床， 即可测出柱床的外水体积Vo。
1．葡聚糖凝胶
葡聚糖凝胶（Sephadex）具有良好的 化学稳定性，是目前生化产品制备中最 常用的凝胶。
G类葡聚糖凝胶（Sephadex-G）的最基本骨架是 葡聚糖，它是一种以右旋葡萄糖为残基的多糖， 分子间主要是α-1,6-糖苷键（约占95%），分 枝为l，3-糖苷键（约占5%），以1-氯-2，3-环 氧丙烷（见右式）Cl－CH2－CH－CH2为交联剂将
5．分辨率不高，分离操作较慢。由于凝 胶层析是以物质分子量的不同作为分离 依据的，分子量的差异仅表现在流速的 差异上，所以分离时流速必须严格把握。 因而分离操作一般较慢。而且对于分子 量相差不多的物质难以达到很好的分离。 此外，凝胶层析要求样品粘度不宜太高。 凝胶颗粒有时还有非特异吸附现象 。
三、常用凝胶的结构和性质 凝胶层析法常用的凝胶有天然凝胶 （如琼脂粉凝胶）和人工合成凝胶（如 葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）。
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来自百度文库
链壮结构连接为三维空间的网状结构的高 分子化合物（下图）
交联葡聚糖凝胶的化学结构
葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和 葡聚糖的配比及反应条件来控制。交联度越 大，网孔越小，吸水膨胀就越小。交联度越 小，网孔越大，吸水膨胀就越大 。 G类葡聚糖凝胶常用G-X代表，X数字既代表 交联度，也代表特水量。X数字越小，交联度 越大，网孔越小，适用于分离低分子质量生化 产品。X数字越大，交联度越小，网孔越大， 适用于分离高分子生化产品。X数字也代表凝 胶的持水量，如G-25表示1g干胶持水2.5mL， G-100表示 1g干胶持水10mL，依次类推。
凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影 响。—般来说，细粒凝胶柱流速低，但洗脱峰 窄，分辨率高，多用于精制分离或分析等。粗 粒凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低， 多用于粗制分离，脱盐等。下图表示在同一流 速下不同粒度的Sephadex G-25柱的洗脱效果。
凝胶粒度与洗脱效果的关系图
对生物样品来说，经常遇到的是两种 分离形式。一种是只将分子量极为悬殊的 两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类 分离或组分离。另一类则是要将分子量相 差不很大的大分子物质加以分离，如分离 血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离。 后者对实验条件和操作要求都比较高。下 面以最常用的葡聚糖凝胶类为例，分别加 以讨论 。
β-D-吡喃半乳糖和3，6脱水-L-吡喃半 乳糖相结合的链状多糖。这种琼脂糖被 用来进行凝胶层析，它既具有琼脂凝胶 相同的分离区间，又没有吸附作用。但 其稳定性远不如葡聚糖凝胶和生物胶P， 强酸强碱能引起结构破坏。最好使用条 件控制在pH 4～9之间，温度0～40℃， 超出此范围,可能被破坏。
琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝 胶。它的商品名因生产厂家不同而异。 瑞典的商品名称为Sepharose，有3种型号， 即Sepharose 2B，4B和6B（同中国相同）。 阿拉伯数字表示凝胶中干胶的百分含量。
5．琼脂糖凝胶（Sepharose）
琼脂糖凝胶（agarose gel）可以分离 葡聚糖凝胶和生物胶所不能分离的大分子， 使凝胶层析的分离区间扩大到大分子和病 毒颗粒，其最大范围可达相对分子质量 108 ，但是由于琼脂有强烈的吸附作用， 给使用造成了困难，后来，从琼脂中分离 出两个组分，一个组分为带负电荷的琼脂 果胶，含有磺酸基和羧基；另一组分叫琼 脂糖，它不含有带电基团，其结构是有
当Kd＝0时，Ve=Vo，说明这种溶质相对分子 质量大，完全不能进入凝胶颗粒微孔内，被 排阻于凝胶颗粒之外而最先洗脱下来；
当Kd＝1时，即Ve小分子 ＝Vo＋KdVi，说明这 种溶质的相对分子质量小，完全向凝胶颗粒 内扩散，在洗脱过程中将最后流出柱外。
但实际上，约有1/5的内水因溶剂化作用 而呈水合状态，妨碍小分子的自由扩散。故 实际上Ve小分子 ＝Vo＋0.8Vi；当0＜Kd＜l时， 意味着溶质分子只有部分向凝胶颗粒内扩散， Kd愈大，进入凝胶颗粒内的程度愈大；Kd＝ 0.5时，其洗脱体积Ve＝Vo十0.5Vi。
5.凝胶层析有何优缺点？
6.常用凝胶分那几类？分别叙述它们各 自的应用范围及特点。 7.在实验中应如何选择凝胶与预处理？
8.细粒凝胶柱流速慢，洗脱峰越窄，分辨 率高，适用于什么产品多分离或分析？粗 粒凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率 低，适用于产品制备那个阶段的分离？
9.什么是“类分离”和“分级分离 ”？
2．亲脂性葡聚糖凝胶
这种凝胶既亲脂又亲水，可在多种有机溶 剂中膨胀。这种凝胶在pH＞2的不含氧化剂的溶 液中稳定。用低级醇为溶剂时，对芳香族、杂 环族化合物仍有吸附作用。但用氯仿时则可去 除对上述化合物的吸附作用，而对含羟基与羧 基的化合物却有吸附作用 。 国产Sephadex LH－20可用于分子筛层析、 吸附层析和分配层析。很适用于脂肪酸、甘油 脂、类固醇、维生素、激素类生化产品的分离。 洗脱剂可用单一有机溶剂如甲醇、氯仿等，也 可用混合溶剂如氯仿与甲醇的混合液。
不同型号葡聚糖凝胶柱床参数 型号 G-10
G-15 G-25 G-50 G-75 G-100 G-200
Vt 2
3 5 10 13 17 30
V0 0.8
1.1 2 4 5 6 9
Vi 1
1.5 2.5 5 7 10 20
二、凝胶层析的特点
1．凝胶层析操作简便，所需设备简单。 有时只要有一根层析柱便可进行工作。 分离介质—凝胶完全不需要像离子交换 剂那样复杂的再生过程便可重复使用。 2．分离效果较好，重复性高。最突出 的是样品回收率高，接近100％。
凝胶层析的定义：
凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。 利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分 子进行层析分离，称凝胶层析 。
凝胶层析的应用范围：
凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、 多肽、激素、多糖、核酸类等物质。分子大小 彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可 以完全将它们分开。利用凝胶的分子筛特性， 可对这些物质的溶液进行脱盐、浓缩、去热源 和脱色。 凝胶层析的优点 凝胶层析具有设备简单、操作方便、分离 迅速及不影响分子生物学活性等优点。目前已 被广泛应用于各种生化产品的分离和纯化。
凝胶层析法
思考题（课前设疑）
1.层析分离技术包括哪些技术？分别叙 述凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、 高压液相层析、疏水层析、聚焦层析的 分离纯化原理。 2.一般在粗品制备阶段和精品纯化阶段 分别应采用哪些层析分离技术？
3.膜分离技术的原理是什么？它同一般
的透析方法相比有何特点？
4.凝胶层析的应用范围有那几方面？