两种灭活方法制备的猪肺炎支原体灭活疫苗的免疫效果比较

两种灭活方法制备的猪肺炎支原体

灭活疫苗的免疫效果比较

王全杰，刘洪斌，张智明，王彬，杨鹏欣，窦海燕，孟福强，丁国杰∗

（哈药集团生物疫苗有限公司研发中心，哈尔滨１５００６９）

［收稿日期］２０１４－０８－２５㊀［文献标识码］Ａ㊀［文章编号］１００２－１２８０（２０１４）１１－００１９－０５㊀［中图分类号］Ｓ８５９．７９＋７

［摘㊀要］㊀为对比使用甲醛㊁二乙烯亚胺（ＢＥＩ）两种灭活方法制备的猪肺炎支原体灭活疫苗对猪的呼吸道发病率㊁肺部病变记分㊁饲料转化率㊁日增重㊁以及猪血清抗体水平等指标的影响，将１２０头健康仔猪随机分成三个试验组和一个对照组，于７㊁２１日龄对试验组的仔猪进行疫苗接种，所有猪于２０㊁５０㊁８０及１４０日龄采血分离血清，检测血清中猪肺炎支原体抗体水平㊂结果显示，用ＢＥＩ灭活的疫苗在呼吸道发病率㊁肺部病变记分㊁饲料转化率㊁日增重㊁以及猪血清抗体水平等各项指标均好于甲醛灭活的疫苗（Ｐ＜０．０５），与进口疫苗无显著差异㊂试验表明，使用ＢＥＩ灭活方法制备的猪肺炎支原体灭活疫苗的免疫效果好㊂

［关键词］㊀灭活；二乙烯亚胺；甲醛；支原体；免疫效果

作者简介：王全杰，硕士，从事动物疫苗研究通讯作者：丁国杰㊂Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｉｎｇｇｕｏｊｉｅ１９７４＠１２６．ｃｏｍ

ＣｏｍｐａｒｉｖｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＩｍｍｕｎｅＥｆｆｅｃｔｓｏｆＩｎａｃｔｉｖａｔｅｄ

ＭｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＶａｃｃｉｎｅｓｗｉｔｈＴｗｏＰｅｒｐａｒａｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄｓ

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（ＨａｒｂｉｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＧｒｏｕｐＣｏ．，Ｌｔｄ，ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＶａｃｃｉｎｅ，Ｈａｒｂｉｎ１５００６９，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｉｍｍｕｎｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｗｏｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄＭｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｖａｃｃｉｎｅｓｐｒｅｐａｒｅｄｗｉｔｈｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅａｎｄｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ（ＢＥＩ）ｗｅｒｅｃｏｍｐａｒｅｄｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｉｎｃｉｄｅｎｃｅｏｆｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｄｉｓｅａｓｅ，ｌｕｎｇｌｅｓｉｏｎｓｃｏｒｅ，ｄａｉｌｙｗｅｉｇｈｔｇａｉｎ，ｆｅｅｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｒａｔｉｏａｎｄｐｏｒｃｉｎｅｓｅｒｕｍａｎｔｉｂｏｄｙｌｅｖｅｌｓ．１２０ｈｅａｌｔｈｙｐｉｇｌｅｔｓｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｔｈｒｅｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐｓａｎｄａｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅｐｉｇｌｅｔｓｉｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐｓｗｅｒｅｖａｃｃｉｎａｔｅｄａｔｔｈｅａｇｅｏｆ７ａｎｄ２１ｄａｙｓ．Ａｔ２０，５０，８０ａｎｄ１４０ｄａｙｓｏｆａｇｅ，ｗｅｓｅｐａｒａｔｅｄｂｌｏｏｄｓｅｒｕｍｏｆａｌｌｐｉｇｓ，

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㊀㊀猪支原体肺炎是由猪肺炎支原体（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｍｈｐ）引起的一种慢性接触性呼吸道疾病，俗称喘气病［１］㊂感染猪慢性㊁持续干咳，其中育肥前期猪咳嗽最严重㊂该病能造成猪的日增重和饲料转化率等生产性能指标的明显下降，严重影响经济效益，同时还容易引起其他细菌病毒的继发感染，大幅增加治疗费用［２］㊂

免疫接种猪肺炎支原体疫苗是防控该病的重要手段之一，接种疫苗可减少肺部损伤，提高料肉比及缩短出栏时间［３］㊂目前，猪支原体肺炎疫苗主要有弱毒疫苗和灭活疫苗，由于弱毒疫苗需要胸腔接种，操作困难，所以不易于推广普及㊂灭活疫苗通过肌肉注射进行接种，易于操作，同时生产工艺简单㊁使用安全㊁方便㊁易于保存，并能刺激动物产生高滴度抗体和显著的免疫保护效果［４］㊂在灭活疫苗的研制中，用到最多的灭活剂是甲醛，甲醛是比较传统的灭活剂，其主要通过对蛋白和核酸的烷化作用，使病毒丧失感染性［５］㊂二乙烯亚胺（ＢＥＩ）是另一类良好的病毒灭活剂，其作用原理是破坏微生物核酸，而不影响其蛋白质成分，并保持病毒抗原性［６］㊂本实验分别用ＢＥＩ和甲醛对猪肺炎支原体进行灭活并制备成疫苗，并设立进口疫苗作为对照，通过动物试验，比较两种灭活疫苗对支原体肺炎的抵抗能力㊂

１㊀材料与方法

１．１㊀材料

１．１．１㊀试验动物㊀１日龄健康杜长大三元杂交仔猪１２０头（支原体肺炎母源抗体为阴性），由哈药集团生物疫苗有限公司实验动物中心提供㊂１．１．２㊀供试抗原及疫苗㊀猪肺炎支原体Ｐ－５７２２－３菌株抗原由哈药集团生物疫苗有限公司提供，猪支原体肺炎灭活疫苗（进口）由美国辉瑞公司生产㊂１．１．３㊀主要试剂㊀二乙烯亚胺（ＢＥＩ），购自ＦＬＵＣＡ公司；硫代硫酸钠购自Ａｌｆａ公司，甲醛，购自国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠，购自国药集团化学试剂有限公司；猪肺炎支原体ＥＬＩＳＡ抗体检测试剂盒，由美国ＩＤＥＸＸ公司生产㊂１．２㊀方法

１．２．１㊀灭活疫苗的制备㊀将检验合格的菌液（抗原浓度ȡ１０８ＣＣＵ／ｍＬ）分成两组㊂第一组为ＢＥＩ灭活组，向菌液中加入ＢＥＩ溶液至终浓度４ɢ，（３７ʃ２）ħ下搅拌培养至少２４ｈ㊂加入硫代硫酸盐溶液（最终浓度４ｍｍｏｌ／Ｌ），继续搅拌至少２４ｈ［７］；第二组为甲醛灭活组，向菌液中缓慢加入甲醛溶液至终浓度２ɢ，（３７ʃ２）ħ下灭活至少２４ｈ㊂半成品检验合格后，用磷酸缓冲盐水调整抗原浓度，并调ｐＨ至７．０ʃ０．２，加入佐剂后乳化㊂１．２．２㊀试验分组㊀将试验动物随机分成４组，３０头／组，Ａ组为ＢＥＩ灭活疫苗组，Ｂ组为甲醛灭活疫苗组，Ｃ组为进口疫苗组，Ｄ组为空白对照组㊂Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ组分别于７㊁２１日龄进行疫苗免疫，肌肉注射，２ｍＬ／头，Ｄ组注射同样剂量的生理盐水㊂所有试验猪按照常规饲养进行管理，仔猪于２８日龄断奶，７０日龄转入育肥舍㊂１．２．３㊀观察指标１．２．３．１㊀生产性能指标㊀注射疫苗后，分别于２８㊁７０㊁１５５㊁１８０ｄ称量猪体重，并记录饲养各个阶段饲料使用情况㊂计算并比较各组的日增重及料肉比情况㊂

１．２．３．２㊀发病情况统计㊀在饲养的全程记录试验猪的发病情况，计算呼吸道发病率㊂

呼吸道发病率＝

呼吸异常猪的累计头数

每组猪数ˑ观察天数㊂

同时，在７５日龄时，每组随机抽取１０头猪进行宰杀，观察和记录每头猪的肺脏病变情况，通过５５分法［８］记分，计算肺炎减少率㊂

肺炎减少率＝

对照猪肺炎平均分－免疫猪肺炎平均分

对照猪肺炎平均分

ˑ１００％㊂１．２．３．３㊀抗体检测㊀每组随机抽取１０头试验猪，分别于２０㊁５０㊁８０㊁１４０日龄通过前腔静脉采血并分离血清，按照ＥＬＩＳＡ抗体检测试剂盒说明书进行检测，在波长为６５０ｎｍ处测量和记录样品和对照的吸光度值㊂检测结果的判定标准［９］：Ｓ／Ｐ＜０．３为阴性，Ｓ／Ｐ＞０．４为阳性，０．３ɤＳ／Ｐɤ０．４为可疑㊂

２㊀结果

２．１㊀猪生长各阶段平均体重及生产性能试验结果仔猪分别于出生后７日龄和２１日龄两次免疫猪气喘病疫苗，接种后免疫仔猪均无过敏反应，没有的临床异常反应，注射部位无肿块和异常反应㊂表明两种灭活疫苗对仔猪安全性良好㊂猪生长各阶段的平均体重见表１㊂