人类疾病石蜡包埋组织收集整理保存技术
石蜡包埋组织miRNA做为肿瘤标志物的研究进展
石蜡包埋组织miRNA做为肿瘤标志物的研究进展miRNA是一类长度为19～25个核苷酸的非编码小分子RNA，从转录后水平调控mRNA的翻译，与肿瘤的发生、转移和预后进程密切相关。
近年来研究发现，石蜡包埋组织的miRNA仍然保持一定的完整性。
该文就石蜡miRNA作为肿瘤标志物的研究进展进行综述。
标签：miRNA；肿瘤；生物标志物miRNA是一类长为19～25nt小分子单链RNA，其与靶标基因3’UTR结合，通过降解mRNA或抑制其翻译，从而在转录后对靶标基因的表达水平进行调控。
与肿瘤的发生、转移、耐药、预后等密切相关。
目前研究miRNA的样本多来源于新鲜组织和细胞。
最近发现福尔马林固定石蜡包埋的组织（Formalin-fixed and Paraffin-embedded，FFPE）中miRNA保存比较完整并与新鲜组织中的miRNA 高度相关[1]，为miRNA的研究开辟了一个新的途径。
石蜡组织miRNA可能是一种理想的肿瘤标志物，该文就该领域的最新进展进行综述。
1 石蜡包埋组织miRNA中存在miRNA长期以来，医疗和科研机构采用福尔马林固定和石蜡包埋方法保存病理组织。
现在全世界已保存有大量的石蜡组织样本，覆盖所有已知的疾病。
每个石蜡组织样本都具有特别的价值，关联着大量的病人数据。
所以石蜡组织标本是人类对疾病研究宝贵的信息库，尤其是回顾性研究和少见疾病的研究。
然而通常mRNA甚至DNA、蛋白都有不同程度的降解。
但有研究表明，尽管大分子RNA 可能会发生降解，但在一般情况下，小分子RNA是不受石蜡固定影响。
此外，已有许多研究证实miRNA受FFPE处理的影响非常小，并且从FFPE样本中提取的microRNA与冷冻组织样本一样，可提供可信的表达谱。
甚至保存长达30年的FFPE样本仍可提供可信的microRNA表达谱数据[2]。
2 石蜡包埋组织miRNA的提取石蜡组织样本可经过异丙醇和乙醇脱蜡后通过trizol法提取总RNA，成本较低。
包埋标本保存方法(一)
包埋标本保存方法(一)包埋标本保存方法1. 为什么需要包埋标本保存方法？在科学研究、医学临床和教学等领域中，常常需要保存各种组织标本以供后续研究和观察。
而包埋标本保存方法则是一种常用的方式，可以保持组织的形态结构和细胞组织的完整性，方便后续的组织切片和观察。
2. 常见的包埋标本保存方法石蜡包埋法石蜡包埋法是目前常见的包埋标本保存方法之一。
具体步骤如下：•收集标本并固定：首先，收集所需的组织标本，并使用适当的固定剂进行处理，如福尔马林固定。
固定的目的是保持组织的形态结构，并杀死细胞以防止腐败。
•逐渐脱水：用一系列浓度逐渐增加的酒精对标本进行脱水处理，以去除细胞内的水分。
常见的浓度从70%酒精开始，逐渐增加至100%。
•渗透：使用石蜡进行渗透处理。
标本放入石蜡浴中，逐渐使用高温和高压使石蜡渗透到组织内部，以保持组织的形态结构。
•包埋：将渗透好的标本放入石蜡模具中，倒入液态石蜡，使其固化成块状。
•切片：将固化后的石蜡块切割成薄片，以供后续的染色和观察。
冰冻切片法冰冻切片法是一种快速制备组织切片的方法，适用于某些特殊情况下需要迅速观察标本的场景。
•准备标本：将组织标本从解剖体中取出后，迅速将其置于低温下。
可以使用液氮或干冰来冷冻组织。
•冰冻包埋：将冷冻的组织标本放入特制的冰冻介质中进行固定。
冻脱水剂是一种常用的冰冻包埋介质，可以缓慢去除冰冻组织的水分。
•切片：用冷冻切片机将固定的冰冻组织切割成薄片。
需要注意的是，冷冻切片的速度要快，以避免组织解冻。
树脂包埋法树脂包埋法是一种较为复杂的包埋标本保存方法，适用于需要进行电镜等高分辨观察的场景。
具体步骤如下：•剥离和切割：首先，将组织标本切成适当的大小，以便后续的处理步骤。
常用的切割工具有手术刀和组织切片机。
•固定和脱水：使用适当的固定剂固定组织，并使用一系列浓度逐渐增加的酒精进行脱水，去除组织中的水分。
•渗透：用树脂替代酒精，使其渗透到组织内部。
树脂通常是由环氧树脂和硬化剂组成，可以在高温下进行渗透。
石蜡包埋组织的DNA提取
石蜡包埋组织的DNA提取近10年来，现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类疾病研究的诸领域，为了解病理状态下基因组DNA的变化积累了新资料。
目前认为，人类基因组并非人们想像的那样稳定，诸如基因重排、扩增、缺失，突瘘和DNA甲基化类型改变等时有发生，这些改变对于基因表过和调控，以及疾病过程的发展与转归等方面均具有重要意义。
医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。
在石蜡切片上进行原位杂交或原位PCR分析的分子生物学方法，是免疫细胞化学技术的重要延伸。
通过对DNA或mRNA分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。
这些对开矿学延伸。
通过对DNA或mRNA 分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。
这些对形态学家较为熟悉的原位分子生物学技术，本节不再赘述。
Goelz(1985)和Dubeau等（1986 ）成功地从蜡块中提取出高质量的DNA，完全可以满足某些肿瘤分子生物学研究的需要，结束了DNA研究依赖于新鲜或冰冻的探针，诊断与鉴别诊断研究和患者预后评估等方面均具有重要价值。
本节重点讨论石蜡包埋组织DNA提取的方法学及其潜在的应用前景。
一、石蜡包埋组织DNA提取的基本方法从石蜡包埋组织中提取DNA的基本步骤，是在常规DNA提取方法的基础上改良和演变而业。
Goelz等（1985）最先提出的石蜡包埋组织DNA提取技术，是用机械的方法破碎组织，切除多余的石蜡，进入含SDS和高浓度蛋白酶K（１mg/ml）的提取缓冲液加温孵育，然后进行苯酚和氯仿抽提。
所得DNA虽不完整，但可被限制性内切酶切割，因而适于点杂交，印迹杂交等多种分了生物学实验。
Dubeau等（1986）在上述方法上作了改进。
首先通过组织切片和二甲苯和脱蜡，保证了组织的完全破碎，使细胞与消化液充分接触，使DNA释放和蛋白去除更加完全；其次通过两步消化的方法，将不适于做分子杂交的降解的DNA 小段去除，仅保留那些可螺旋化的完整的DNA分子，从而提DNA质量，适于做Sorthern印迹杂交分析。
石蜡包埋组织包埋安全操作及保养规程
石蜡包埋组织包埋安全操作及保养规程引言石蜡包埋技术广泛应用于生物医学科研领域中的组织学研究。
通过标本包埋可保证标本的稳定性和完整性，提高组织的质量，利于后续组织切片和病理学观察。
然而，在实验过程中，必须严格遵守包埋安全操作规程，否则将对实验者和实验设备造成极大的危害。
本文就石蜡包埋组织的包埋安全操作及保养规程进行详细介绍，帮助实验室进行风险评估及规范化操作，同时确保实验人员健康安全。
包埋前准备1. 安全设备•戴防护手套、口罩、护目镜等个人防护设备。
•保证操作环境通风良好，设置有洗眼器、呼吸器等应急设备。
2. 化学品准备及处理•质量上乘的石蜡及甘油，以及其他包埋设备。
•所有化学药品都应密闭存放，定期进行检查和更换。
3. 质量控制•理想包埋试剂应经过多次检测，并标注有试验效果包伊证明。
•操作人员应掌握正确认识标本组织特异性和处理时应注意的地方。
只有通过规范化的操作流程，才能保证标本质量。
操作流程1. 标本准备•采用新鲜、健康、质量优良的标本，并在取出后立刻进行处理和包埋。
新鲜的标本处理效果更佳。
2. 组织处理•将组织放入去离子水中多次清洗，去掉附在组织表面的油脂和血液等物质。
•将组织浸泡于甲醇中，去掉细胞内外的水分，使组织达到亲水性状态。
•通过升序乙醇溶液去除细胞内物质，然后通过石蜡溶解处理使组织形成半固态包埋块。
•最后，包埋块应置于冷柜中进行冷却处理。
3. 操作注意事项•操作人员应当避免直接接触化学试剂，以免造成化学伤害。
•石蜡温度不可过高，以免造成包埋物溢出和操作人员烫伤。
•包埋物应放置于冷却器中进行冷却处理，以便加速固化。
•包埋设备应保持干净，每次使用前应进行消毒以去除细菌和病毒污染。
维护保养1. 设备维护•每周对包埋设备进行检查，检查包埋机、石蜡剪切器和剖切机的使用情况是否正常，并在发现问题后及时修理和保养。
•每三个月更换一次石蜡维护油，并进行包埋人门更换，以确保包埋设备的稳定性和可靠性。
2. 石蜡管理•石蜡应存放于干燥、通风的环境中，以免发生化学变化。
石蜡包埋切片方法
石蜡包埋组织样品制备方法组织采集后，经固定、保存、石蜡包埋、切片、展片、烤片，方可进行HE染色（或其它化学染料染色）及免疫抗体标记。
以下操作依据组织大小及致密程度而定1、组织的采集、固定和保存：可依据实验目的及组织的特点而考虑采用不同的固定和保存方法。
此处只介绍实验室常用方法。
采取组织后，4%多聚甲醛（4%PFA）4︒C 固定1小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜，PBS缓冲液洗三次，每次10min至1小时，于30%、50%乙醇中各10 min至1小时，4︒C保存于70%乙醇中。
2、组织的包埋、切片、展片及保存：：固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54︒C石蜡包埋，常规切片，切片厚4 -10μm，贴于处理过的干净载玻片上，34︒C烤片过夜，之后收集于载片盒中，4︒C密封保存。
石蜡包埋：保存于4︒C 70%乙醇中的组织样品↓80%乙醇15 min↓95%乙醇15 min↓100%乙醇15min ⨯ 2↓1/2乙醇1/2二甲苯15 min↓二甲苯透明5-10 min↓1/2二甲苯1/2石蜡30 min↓石蜡（1） 1.5hr↓石蜡（2） 1.5-2.5hr↓石蜡（3）包埋↓4︒C保存3、石蜡组织切片的免疫标记：切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水，即可进行免疫反应，操作步骤与冰冻组织切片的反应方法相同。
石蜡组织切片脱蜡、复水步骤：密封保存于4︒C的组织切片↓二甲苯(1) 10 min↓二甲苯(2) 10 min↓二甲苯(3) 10 min↓1/2二甲苯1/2乙醇15 min↓100%乙醇 5 min↓95%乙醇 5 min↓80%乙醇 5 min↓70%乙醇5 min↓50%乙醇 5 min↓30%乙醇 5 min↓d2H2O 5 min4、石蜡组织切片的HE染色：切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水，于苏木精中室温染色5-20 min，迅速用水冲洗切片，至组织切片变蓝，镜检。
用0.1-0.5%盐酸乙醇分色1～2秒钟，也可用50ml H2O中加一滴氨水分色，效果亦好（如染色程度恰好，也可省略分色步骤）。
石蜡包埋技术
石蜡包埋技术制作石蜡切片，切片前须将石蜡渗透组织包埋于石蜡中，而水与石蜡又是不相混合的，所以在浸蜡，包埋前必须将组织内所含的水分脱去。
而大多数的组织固定剂是水溶液，随后的水冲洗也使其含有大量水分，因此必须先行脱水，一般是浸入逐级增加浓度的酒精来完成。
由于酒精和石蜡不能混合，须再用一种石蜡的溶剂来置换酒精，因大多数石蜡溶剂有使组织的折光率增高并表现为透明或半透明状，所以此步骤又称透明。
最后用石蜡浸渍组织并铸制成坚实的蜡块。
常规的石蜡包埋过程包括五个基本步骤，即固定，脱水，透明，浸蜡和包埋，前一章中已述过固定。
第一节脱水脱水就是用脱水剂完全除去组织内的水分，为下一步透明及浸蜡创造条件。
此外，脱水还可以使组织再次发生一定的硬化，脱水剂必须是与水在任何比例下均能混合的液体。
一．常用的脱水剂1．酒精：是制片最常用的试剂，可与水在任何比例下相混合，酒精的脱水能力比较强，又能硬化组织。
但是酒精的船头速度很快，对于组织会有明显的收缩作用。
因此在以酒精作为脱水剂时，应该先从浓度较低的酒精开始，然后递增其浓度，这样可以避免组织过度收缩。
第一瓶酒精浓度随固定剂，脱水组织的大小和种类而异，经水溶性固定剂固定的细柔组织需要慢慢脱水，从50％酒精开始。
如眼球，组胚组织等大多数组织标本则是从70％酒精开始，再经80％，95％以至无水酒精。
但是有时为了某种特殊要求，例如要做糖元的切片标本或是要做尿酸结晶染色切片标本，为了防止糖元和尿酸结晶在水中消失却要直接投入无水酒精中固定，而不需要经过水洗和低浓度酒精的脱水过程。
经无水酒精固定后的组织只需要再经过换一次无水酒精脱水即可。
用AAF固定液固定的组织可直接置于95％酒精开始脱水。
用醇性固定剂（如Carnoy）则可置于高浓度无水酒精内，但应多次换液以除酸。
一般情况下，组织经过70％，80％，90％，95％，以至无水酒精的脱水程序，即可达到脱水的要求。
但是为了能使大量的组织块同时进行脱水，则要求保持液体的浓度以保证脱水的作用，最好是以两次95％酒精，两次100％酒精重复进行脱水，以保证组织的水分脱净。
组织块石蜡包埋
组织块石蜡包埋的步骤：1.取材：尽量活杀，在处死30min内取材完毕，组织块的大小一般为（1.0-1.5cm）*1.0cm*(0.2-0.3cm)2.固定：常用甲醛液浓度为4%，是40%甲醛溶液和水按1:9比例配制而成。
固定时间以12-24h为宜。
（4℃冰箱可放置1-3个月）3.冲洗：将组织块放在固定的容器中用流水冲洗24h.4.脱水：一次70%酒精2h, 80%酒精2h, 90%酒精1h, 95%酒精40min,无水乙醇Ⅰ40min,无水乙醇Ⅱ30min。
可将组织放于70%酒精中过夜。
5.透明：将脱水后组织直接浸入二甲苯透明剂中（二甲苯Ⅰ, 二甲苯Ⅱ），每次透明为10min。
6.浸蜡：常规制片常用熔点高于56℃以上的石蜡，普通采用56℃-58℃石蜡。
先将组织浸入软蜡Ⅰ1h左右, 再浸入软蜡Ⅱ40min；硬蜡Ⅰ40min, 硬蜡Ⅱ1h。
（一般浸蜡时间为3-4h）软蜡熔点为45℃-50℃，硬蜡熔点为55℃-60℃。
7.包埋：将蜡液注入包埋硬具中，迅速将组织块平放入蜡液中，摆正并铺平，然后移至冷却台，使组织块同蜡液凝固在一起的过程。
（硬蜡凝固定型）石蜡切片法：在切片前应先切去标本周围过多的石蜡（此过程称为“修块”），但也不能留得太少，否则易造成组织破坏，连续切片时分片困难。
一般切片厚度为4-6μm。
贴片时先在干净的载玻片上涂一层蛋白甘油，然后于60℃恒温箱中烘烤1h，若未烤干可适当延长时间；若组织剥脱可涂一层蛋清加以固定。
做免疫组化时，玻片应涂多聚赖氨酸，亦可买防脱玻片。
HE染色的步骤：二甲苯Ⅰ5-10min→二甲苯Ⅱ5-10min→无水乙醇Ⅰ1-3min→无水乙醇Ⅱ1-3min→90%酒精1min→80%酒精1min→70%酒精1min→水洗→苏木精3-5min→水洗→盐酸酒精1-3s→水洗→饱和碳酸锂（氨水）10-30s→水洗→伊红3-5min→水洗（短）→70%酒精1-2s→80%酒精3-5min→90%酒精3-5min→95%酒精3-5min→无水乙醇5-10min→二甲苯Ⅰ3-5min→二甲苯Ⅱ3-5min→中性树胶封片染色液的配制：1.Harris苏木精的配制苏木精 1g硫酸铝钾 15g无水乙醇 10ml蒸馏水 200ml先用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，用无水乙醇溶解苏木精再倒入已溶解的硫酸铝钾蒸馏水中，煮沸1min后，稍冷却，慢慢加入红色氧化汞0.5g，继续加热至染液变为紫红色，用纱布盖瓶口，用滤纸过滤后每100ml加冰醋酸5ml。
疾病新鲜组织收集整理保存
w w w .e ge n e.o rg.cnw w w .e ge n e.o rg.cn 中国人类遗传资源疾病新鲜组织收集整理保存技术规程Technical Specification for the Fresh Tissue Trimming and Preservation of Chinese Disease Genetic Resources（讨论稿）中国人类遗传资源平台2005年10月w w w .e ge n e.o rg.cnw w w .e ge n e.o rg.cn新鲜组织是指以人体疾病诊断及治疗为目的，从患者的机体中切取的未经特殊化学试剂处理的病变组织。
为了提高疾病的诊断质量、促进临床工作、探讨及研究疾病的发病机制，收集整理保存人类疾病新鲜组织非常重要。
该技术规程中要求包括临床资料的完整性和病理诊断的准确性、操作人员资格的认定、标本处理的程序、所需的设备和条件，以及人类疾病新鲜组织应用的范围。
目前，我国尚无关于人类疾病新鲜组织收集整理保存工作的国家标准，为使我国相关工作有章可循，规范操作和管理，我们根据目前的研究积累，参考国际相关做法，同时结合中国国情，制定本规程。
w w w .e ge n e.o rg.cnw w w .e ge n e.o rg.cn前言 (II)1 范围 (1)2 规范性引用文件 (1)3 术语和定义 (2)4 临床资料及疾病诊断 (2)5 操作人员的资格认定 (2)6 标本的处理 (3)7 处理和存放标本的环境及条件 (4)8 标本的保存方法 (4)9 标本的管理和使用 (5)参 考 文 献 (6)w w w .e ge n e.o rg.cnw w w .e ge n e.o rg.cn人类疾病新鲜组织收集整理保存技术规程1 范围本规程适用于直接采用人体疾病新鲜组织进行的相关科研操作，以及通过直接制片或后续固定和石蜡包埋等处理进行疾病诊断与研究的操作等，因此在科研单位、医学院校和医院应规范执行。
人类疾病石蜡包埋组织收集整理保存技术
w w w .e ge n e.o rg.cnw w w .e ge n e.o rg.cn 中国人类遗传资源疾病石蜡包埋组织收集整理保存技术规程Technical Specification for the Paraffin Imbedding Tissue Collection and Trimming and Preservationof Chinese Disease Genetic Resources（讨论稿）中国人类遗传资源平台项目组2005年9月w w w .e ge n e.o rg.cnw w w .e ge n e.o rg.cn 前 言石蜡有适当硬度，包埋组织能够常规制备成36微米厚度的切片用于诊断和研究。
由于石蜡包埋组织能够较长时间地保存组织内的蛋白质和核酸，用石蜡包埋固定好的人类疾病组织制作成切片，可用于HE染色分析（通过镜下观察，做出临床病理诊断）、DNA 及RNA的原位杂交分析、蛋白质分析、核酸提取用于病原微生物的诊断或其它分子生物学诊断及研究等。
故规范性地作好石蜡包埋组织、提供适宜的蜡块储存环境、严格培训蜡块保管人员，以及明确蜡块管理使用程序非常重要。
目前，我国尚无关于人类疾病石蜡包埋组织收集整理保存工作的国家标准，为使我国相关工作有章可循，规范操作和管理，我们根据目前的研究积累，参考国际相关做法，同时结合中国国情，制定本规程。
w w w .e ge n e.o rg.cnw w w .e ge n e.o rg.cn 目 次前 言 (II)1 范围 (1)2 规范性引用文件 (1)3 术语和定义 (1)4 固定后组织的取材、脱水、透明、浸蜡 (2)4.1 取材 (2)4.2 洗涤 (2)4.3 脱水 (2)4.4 透明 (3)4.5 浸蜡 (4)5 组织包埋 (5)6 切片、展片及烤片 (6)7 染色 (7)8 封片 (8)9.1 蜡块存放环境 (8)9.2 蜡块存放温度 (8)10 保管人员的资格及要求 (9)11 蜡块使用的范围 (9)12 蜡块的医疗安全规范 (9)参 考 文 献 (11)w w w .e ge n e.o rg.cnw w w .e ge n e.o rg.cn人类疾病石蜡包埋组织收集整理保存技术规程1 范围本规程适用于与人体疾病石蜡包埋组织标本相关的诊断、医学及司法鉴定、科研操作，因此在医院、司法机关和科研单位应规范执行。
快速高效从石蜡包埋肿瘤组织中提取micro-RNA方法的研究
快速高效从石蜡包埋肿瘤组织中提取micro-RNA方法的研究李江超;杨扬;郝卓芳;周晓明;章倩倩;王丽京【摘要】Objective To look for better and low cost method for extracting microRNAs ( miRNAs)from paraffin-embedded tissue for miRNA diagnosis or other miRNAs assay. Methods The samples were collected from paraffin-embedded human breast cancer tissue stored over two years and MMTV transgenic mouse paraffin-embedded breast tissue over six months. The miRNAs extract paraffin tissue kit served as control. To detect the quality of miRNAs obtained by these two methods,used 2% gel electrophoresis and the OD value to confirm the quality and concentration. Furthermore,verified miRNAs by testing miRNA-375 and miRNA-218 with quantitative PCR. Results ①miRNAs extracted by our method met the experimental requirements( A260/280=1. 86-2. 21OD),and the lowest concentration was 38. 50mg/L.②The quantitative PCR can detect miRNAs and its copies number compared with the control,the difference was no significant(P﹥0. 05).③This method has relatively lower cost,about 1/10 cost of kit method,while the extraction process decreased about 1/3 time. Conclusion The method we optimized for extracted miRNAs from paraffin-embedded tissue is feasible,it provides a convenient experimental method,and a better approach to detect more retrospective specimens of paraffin-embedded tissue samples.%目的：探索一种从石蜡包埋组织标本中快速、便捷、低成本的提取miRNAs的方法。
石蜡包埋人体组织DNA分型的研究
#$%DE-%
OID2 D23 &23/345+"" 34D?HGD=I> K?IG3C0?3 Z=D2 D23 MM%Y D=WW03W =>G0XHD3C HD :.; （ C3KH?HEE=>=\3C） >*+(ED%0*+ A2=W -3D2IC =W 3HWJ DI IK3?HD3
H>C D23 C=?3GD &23/345+"" 34D?HGD=I> K?IG3C0?3 GI0/C ?3W0/D => ?3/=HX/3 @A’ DJK=>8, H>C 0W3E0/ EI? GHW3ZI?],
!
材料与方法 经福尔马林固定、 石蜡包埋的人体组 织 （ 本研究
室保存 +" 年以上） ； 案件中石蜡包埋人体病理组织（ 恶 性肿瘤） 。 （ +）预处理。切取石蜡包埋的人体组织块+,"-不同的预处理条件进行。
表! 条件 + 温度（ ;） 时间（ -=>） 预处理条件 条件 ! 条件 # 条件 $
#
摘要： 目的 法。 方法
研究石蜡包埋人体组织的()* 提取方法对其@A’分型的影响， 并建立石蜡包埋组织的()* 提取方 经不同预处理条件后采用 &23/345+"" 法提取石蜡包埋人体组织中的 ()*，用不同的反应体系进行 结果 经福尔马林固定、石蜡包埋的人体组织直接采用&3/345+"" 法提取()* 与:.;水浴 结论 该方法简便易行， 实验效果好， 适合检案。
"
结果与讨论
@A’
石蜡包埋步骤
石蜡包埋步骤
一、组织固定
按1：20将组织放入固定液【小块组织如卵巢可放入2ml EP管中加入2ml的bouins 固定液（4℃冰箱摇床中2~3h）或PFA固定液】；如果不进行下一步，可放于70%酒精中4℃冰箱中长期保存。
1组织脱水、渗透与包埋
○1脱水：
70% 乙醇（30min）→85%乙醇(30min) →95%乙醇(30min)→100%乙醇(30min)→100%乙醇(30min)。
注：○1若组织数量过多时，应分开脱水（20个组织左右）
○2脱水的体积至少为组织体积的4倍
○3乙醇纯度越高时，脱水的时间减少，否则引起组织过硬
○4最好能搅拌，使脱水充分
○2透明：
二甲苯I (30min)→二甲苯II(30min)。
注：在二甲苯的时间不宜过短或过长。
时间过短引起透明不充分，影响后面渗透包埋；时间过长则引起组织变脆。
○3渗透：
石蜡I (60min)→石蜡II(60min),62℃烘箱中。
○4包埋：
将组织放入盛有石蜡的模具中，摆好位置，于石蜡包埋机的冷台上冷却。
注：包埋时，切忌用手按石蜡盒中间，因为冷凝后，中间仍较软。
2 切片和贴片
将包埋好的组织块于切片机中约5µm，放于漂片机中展开，再将切片捞于多聚赖氨酸附膜载玻片上，编号，70℃干烤1h，贴片后60℃烤5h。
石蜡包埋技术
石蜡包埋技术制作石蜡切片，切片前须将石蜡渗透组织包埋于石蜡中，而水与石蜡又是不相混合的，所以在浸蜡，包埋前必须将组织内所含的水分脱去。
而大多数的组织固定剂是水溶液，随后的水冲洗也使其含有大量水分，因此必须先行脱水，一般是浸入逐级增加浓度的酒精来完成。
由于酒精和石蜡不能混合，须再用一种石蜡的溶剂来置换酒精，因大多数石蜡溶剂有使组织的折光率增高并表现为透明或半透明状，所以此步骤又称透明。
最后用石蜡浸渍组织并铸制成坚实的蜡块。
常规的石蜡包埋过程包括五个基本步骤，即固定，脱水，透明，浸蜡和包埋，前一章中已述过固定。
第一节脱水脱水就是用脱水剂完全除去组织内的水分，为下一步透明及浸蜡创造条件。
此外，脱水还可以使组织再次发生一定的硬化，脱水剂必须是与水在任何比例下均能混合的液体。
一．常用的脱水剂1．酒精：是制片最常用的试剂，可与水在任何比例下相混合，酒精的脱水能力比较强，又能硬化组织。
但是酒精的船头速度很快，对于组织会有明显的收缩作用。
因此在以酒精作为脱水剂时，应该先从浓度较低的酒精开始，然后递增其浓度，这样可以避免组织过度收缩。
第一瓶酒精浓度随固定剂，脱水组织的大小和种类而异，经水溶性固定剂固定的细柔组织需要慢慢脱水，从50％酒精开始。
如眼球，组胚组织等大多数组织标本则是从70％酒精开始，再经80％，95％以至无水酒精。
但是有时为了某种特殊要求，例如要做糖元的切片标本或是要做尿酸结晶染色切片标本，为了防止糖元和尿酸结晶在水中消失却要直接投入无水酒精中固定，而不需要经过水洗和低浓度酒精的脱水过程。
经无水酒精固定后的组织只需要再经过换一次无水酒精脱水即可。
用AAF固定液固定的组织可直接置于95％酒精开始脱水。
用醇性固定剂（如Carnoy）则可置于高浓度无水酒精内，但应多次换液以除酸。
一般情况下，组织经过70％，80％，90％，95％，以至无水酒精的脱水程序，即可达到脱水的要求。
但是为了能使大量的组织块同时进行脱水，则要求保持液体的浓度以保证脱水的作用，最好是以两次95％酒精，两次100％酒精重复进行脱水，以保证组织的水分脱净。
【干货】实验标本收集及保存方法
【⼲货】实验标本收集及保存⽅法1：病理标本收集及保存：1）冰冻切⽚：取下适当的组织块放于液氮保存； 2）⽯蜡切⽚：取下适当的组织块放于4%多聚甲醛保存；3）细胞爬⽚：细胞爬⽚4%多聚甲醛固定30min，换PBS浸没4℃保存。
2：分⼦⽣物学标本收集及保存：1）新鲜组织：切割标本后放于液氮或者-80℃冰箱保存； 2）⽯蜡标本：常温保存；3）全⾎标本：取适量全⾎加⼊EDTA或肝素抗凝采⾎管； 4）体液标本：⾼速离⼼取沉淀；5）细胞标本：细胞加TRizol裂解后液氮或者-80℃冰箱保存。
3：蛋⽩质实验标本收集及保存：1）新鲜组织：切割标本后放于液氮或者-80℃冰箱保存； 2）全⾎标本：取适量全⾎加⼊EDTA或肝素抗凝采⾎管；3）细胞标本：细胞加细胞裂解液充分裂解后液氮或者-80℃冰箱保存。
4：ELISA、放免、⽣化实验标本收集及保存：1）⾎清（⾎浆）样本：取全⾎加⼊促凝管（抗凝管），2500转离⼼20分钟左右，收集上清，液氮或者-80℃冰箱保存；2）尿液样本：样本2500转离⼼20分钟左右，液氮或者-80℃冰箱保存；胸腹⽔、脑脊液、肺泡灌洗液参照此实⾏；3）细胞样本：检测分泌性的成份时，样本2500转离⼼20分钟左右，液氮或者-80℃冰箱保存；检测细胞内的成份时，⽤PBS稀释细胞悬液，通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份，2500转离⼼20分钟左右，收集上清同上；4）组织样本：切割标本后，称取重量，⽤液氮或者-80℃冰箱冷冻保存备⽤。
5：代谢组学标本收集：1）尿液样本：样本2500转离⼼20分钟左右，液氮或者-80℃冰箱保存；胸腹⽔、脑脊液、肺泡灌洗液等参照此实⾏；2）组织样本切割标本后，称取重量，⽤液氮或者-80℃冰箱冷冻保存备⽤；。
包埋标本保存方法
包埋标本保存方法包埋标本保存方法方法一：固定剂法•在取得生物组织后，立即将其放入适当的固定剂中，如10%福尔马林。
•确保标本完全浸泡在固定剂中，避免出现气泡。
•标本固定时间取决于其大小和类型，一般为24-48小时。
•固定完成后，将标本转移到脱水剂中。
方法二：脱水法•将固定的标本转移到70%乙醇或其他适当的脱水剂中。
•逐渐提高脱水剂的浓度，如80%，90%，100%乙醇。
•每个脱水浓度至少进行1小时。
•脱水过程中要避免标本变形或破裂。
方法三：透明化法•将脱水的标本转移到透明化剂中，如二甲苯或其他有机溶剂。
•透明化剂的浓度可根据需要进行调整。
•透明化时间取决于标本的大小和类型，一般为1-2小时。
•透明化完成后，将标本转移到熔点温度适当的包埋剂中。
方法四：包埋法•将透明化的标本转移到包埋剂中，如石蜡。
•确保标本完全浸泡在包埋剂中。
•根据标本大小和类型的不同，包埋时间可在2-24小时之间。
•完成包埋后，将标本放置在包埋盒中。
方法五：储存与标识•标本储存时应放置在干燥、避光、防潮的环境中。
•为了便于辨认和管理，应为每个标本标上唯一的编号。
•标本储存时，可以放置在专门的标本柜中。
•定期检查标本，确保其保存完好。
以上是常用的包埋标本保存方法，根据具体情况选择合适的方法进行操作，以保证标本的质量和保存时间。
注意在操作过程中要遵循实验室安全规范，避免对自己和他人造成伤害。
方法一：固定剂法•在取得生物组织后，立即将其放入适当的固定剂中，如10%福尔马林。
•确保标本完全浸泡在固定剂中，避免出现气泡。
•标本固定时间取决于其大小和类型，一般为24-48小时。
•固定完成后，将标本转移到脱水剂中。
方法二：脱水法•将固定的标本转移到70%乙醇或其他适当的脱水剂中。
•逐渐提高脱水剂的浓度，如80%，90%，100%乙醇。
•每个脱水浓度至少进行1小时。
•脱水过程中要避免标本变形或破裂。
方法三：透明化法•将脱水的标本转移到透明化剂中，如二甲苯或其他有机溶剂。
石蜡包埋技术要点总结
• （六）包埋（埋蜡、沉床） 材料浸蜡后再换两次已熔融的纯蜡，然后 将材料和石蜡一起倒入提前叠好的包埋模 具中，用加热的镊子迅速将材料按一定的 间隔和所需的切面摆放整齐，同时用加热 的镊子赶走材料周围的气泡，待模具表面 的石蜡凝固后将纸盒平放入冷水中，使石 蜡迅速凝固。最后从模具中取出蜡块，以 便保存。注意将样品编号封于蜡块上，以 免样品混淆。
组织石蜡包埋和切片技术
• 在制作切片或超薄切片时，由于组织是柔 软的，或局部的软硬不均，这样制作厚薄 均匀的切片是困难的。所以有必要用一定 物质浸透组织内部，整个组织一样硬化， 以利于切成薄片，这种物质叫做包埋剂。 一股用光学显微镜观察的切片，用石蜡、 火棉胶、炭蜡、明胶等作包埋剂；电子显 微镜则用环氧树脂、聚苯乙烯树脂、异丁 烯树脂及水溶性树脂。
• 注：包埋时，切忌用手按石蜡盒中间，因 为冷凝后，中间仍较软。何师兄放到— 40℃冰箱使其快速凝固。 •
程序
• （一）材料的采集与分割 采集材料应根据制片的目的和要求而定，材料 要有代表性，无病虫害或其它损伤，如要观察 病理解剖，则要取病斑、病症部位。采下的材 料应立即放在标本箱或湿布包起来带回实验室 进行分割固定（如有条件也可在试验地采集后 进行分割固定）。为使固定液能迅速的渗透材 料，材料要进行分割。分割时动作要迅速，以 防材料萎蔫。分割块的大小，宜小不宜大，一 般不超过1cm3，分割后立即杀死固定。
• （八）切片 用切片机（如旋转切片机）将蜡块切成连 续的蜡带。切片时先把切片刀夹在刀架上， 再把载蜡器夹在固定装置上（注意安装切 刀的角度，刀口运行方向与材料切面平 行），然后调整好所需厚度，一般可在 7~14微米，视材料和所需观察对象而定， 转动切片机切片。
具体流程
• 1 脱水： • 多聚甲醛中取出组织，流水冲洗数分钟→70% 乙醇 （2h,可延长过夜）→85%乙醇(2h) →95%乙醇Ⅰ (1h)→95%乙醇Ⅱ(1h) →无水乙醇Ⅰ (30min)→无水乙 醇Ⅱ (30min)。 • 注：1若组织数量过多时，应分开脱水（20个组织 左右） • 2脱水的体积至少为组织体积的5倍 • 3乙醇纯度越高时，脱水的时间减少，否则引起 组织过硬 • 4 最好能搅拌，使脱水充分。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
w w w .e ge n e.o rg.cnw w w .e ge n e.o rg.cn 中国人类遗传资源疾病石蜡包埋组织收集整理保存技术规程Technical Specification for the Paraffin Imbedding Tissue Collection and Trimming and Preservationof Chinese Disease Genetic Resources（讨论稿）中国人类遗传资源平台项目组2005年9月w w w .e ge n e.o rg.cnw w w .e ge n e.o rg.cn 前 言石蜡有适当硬度，包埋组织能够常规制备成36微米厚度的切片用于诊断和研究。
由于石蜡包埋组织能够较长时间地保存组织内的蛋白质和核酸，用石蜡包埋固定好的人类疾病组织制作成切片，可用于HE染色分析（通过镜下观察，做出临床病理诊断）、DNA 及RNA的原位杂交分析、蛋白质分析、核酸提取用于病原微生物的诊断或其它分子生物学诊断及研究等。
故规范性地作好石蜡包埋组织、提供适宜的蜡块储存环境、严格培训蜡块保管人员，以及明确蜡块管理使用程序非常重要。
目前，我国尚无关于人类疾病石蜡包埋组织收集整理保存工作的国家标准，为使我国相关工作有章可循，规范操作和管理，我们根据目前的研究积累，参考国际相关做法，同时结合中国国情，制定本规程。
w w w .e ge n e.o rg.cnw w w .e ge n e.o rg.cn 目 次前 言 (II)1 范围 (1)2 规范性引用文件 (1)3 术语和定义 (1)4 固定后组织的取材、脱水、透明、浸蜡 (2)4.1 取材 (2)4.2 洗涤 (2)4.3 脱水 (2)4.4 透明 (3)4.5 浸蜡 (4)5 组织包埋 (5)6 切片、展片及烤片 (6)7 染色 (7)8 封片 (8)9.1 蜡块存放环境 (8)9.2 蜡块存放温度 (8)10 保管人员的资格及要求 (9)11 蜡块使用的范围 (9)12 蜡块的医疗安全规范 (9)参 考 文 献 (11)w w w .e ge n e.o rg.cnw w w .e ge n e.o rg.cn人类疾病石蜡包埋组织收集整理保存技术规程1 范围本规程适用于与人体疾病石蜡包埋组织标本相关的诊断、医学及司法鉴定、科研操作，因此在医院、司法机关和科研单位应规范执行。
2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本规程的引用而成为本规程的条款。
凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本规程，然而，鼓励根据本规程达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本规程。
GB/T 1.1-2000 标准的结构和编写规则GB 19489-2004 生物安全通用要求ISO 15189 医学实验室质量和能力的专用要求ICD-10 WHO国际疾病分类编码CNAL AC23-2003 医学实验室认可准则《人类疾病固定组织的收集整理保存技术规程》《人类遗传资源管理办法》《赫尔辛基宣言》3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。
3.1 人类疾病石蜡包埋组织资源是指可经过石蜡包埋保存的人体各种疾病组织材料及相关信息资料。
3.2 标本为了进行疾病的临床诊断、治疗及相关的研究工作，所切取或采集的人体各组织器官的样本。
w w w .e ge n e.o rg.cnw w w .e ge n e.o rg.cn3.3 固定人体组织固定是采用适宜的固定液充分地固定组织，以便将组织细胞的固有形态结构保存下来，满足疾病诊断和相关研究的需要。
固定液除了可以固定组织之外，还具有硬化组织细胞的作用。
4 固定后组织的取材、脱水、透明、浸蜡人体新鲜组织的固定要根据后期不同的用途选用不同的固定剂，常规选用4%中性甲醛液（用缓冲液配制），经病理医师取材和标记后，将组织依次进行冲洗、脱水(用递升浓度的乙醇等)、透明(用二甲苯等)和浸蜡(用石蜡)处理，然后用石蜡将组织包埋成蜡块，再经切片和染色，制成切片。
4.1 取材由具有一定经验的病理医师进行组织标本的取材。
该医师应熟悉正常和异常组织大体结构，必须切取到病变组织、正常组织及二者交界组织，大小各为 2cm×1.5cm×0.3cm，同时完成相关的记录，如病理号、取材部位、组织大小和大体描写等。
4.2 洗涤洗涤的目的是把渗入组织中的固定液洗去，以利于脱水及透明，并防止染色过程中福尔马林色素的产生。
经常规固定液固定的组织须流水冲洗约30分钟，具体时间依固定时间长短而稍有不同。
4.3 脱水脱水的目的是去除组织内固有的水分和组织经过固定及洗涤后含有的大量水分，以利于透明剂和石蜡渗入组织。
可使用脱水剂逐步将组织块内的水分置换出来。
脱水剂必须是易溶于水的有机溶剂，常规使用的有乙醇、丙酮等。
由于脱水剂穿透组织的速度很快，常导致组织过度收缩及变脆，因此必须采用梯度脱水的处理方法，从低浓度开始，依次递增，直至纯脱水剂，最终组织内部的水分将被高浓度脱水剂所取代。
目前，脱水过程已全部实现了自动化，各公司生产的脱水机型号和基本原理一样，具体操作方法及条件设定请参照脱水机使用说明。
整个脱水过程在常温下进行：w w w .e ge n e.o rg.cnw w w .e ge n e.o rg.cna) 乙醇－甲醛（AF）液固定：60～120 分钟；b) 80%乙醇：60～120分钟；c) 95%乙醇I：60～120分钟；d) 95%乙醇II：60～120分钟；e) 无水乙醇I：30～60分钟；f) 无水乙醇II：30～60分钟；g) 无水乙醇III：30～60分钟；4.3.1 注意事项a) 未经充分固定的组织不得进入脱水程序，用于脱水的试剂容积应为组织块总体积的5～10倍以上；b) 组织脱水必须由低浓度向高浓度逐步过渡，若组织含水量过多(如胚胎组织)，则脱水剂浓度应由更低级(如30%～40%乙醇)开始；c) 组织脱水要彻底干净，只有把水分脱去，才能使组织块在二甲苯中透明，石蜡才能渗透到脂肪细胞和组织中去，若脱水不彻底，则切片后组织与空气接触即干燥收缩，蜡块切面组织会出现凹陷现象。
即使勉强切片，染色效果也很差，且组织于染色时易脱落。
因此脱水彻底与否是制片质量好坏的一个重要环节；d) 脱水时间要适当，若时间太短则脱水不彻底；时间过长则会促使组织收缩变硬。
脱水时间要根据组织块大小、厚度、脱水剂的新旧程度等适当增减调节；e) 脱水必须在有盖瓶子内进行。
因高浓度乙醇很易吸收空气中的水分，阴雨天空气中湿度较大也会影响乙醇的浓度；f) 必须保持无水乙醇的绝对无水。
纯乙醇中如含有水分，可加入无水硫酸铜吸收水分。
无水硫酸铜遇水变成蓝色，用后的无水硫酸铜，经高温干燥后，仍可重复使用。
另一方法是采用磺酸钾型阳离子交换树脂吸收水分。
把吸满了水的树脂，加温到150℃左右变成干燥的树脂，也可重复使用。
4.4 透明乙醇等脱水剂不能溶解石蜡，所以在浸蜡之前需要一个既能与乙醇混合又能溶解石蜡的媒剂，称为透明剂，以便使石蜡渗入到组织中去。
当组织中全部为透w w w .e ge n e.o rg.cnw w w .e ge n e.o rg.cn明剂占有时，光线可以透过，组织可呈现不同程度的透明状态，此种现象称为透明。
如果组织不能透明，表明脱水不彻底，必须重新脱水补救，否则将影响到浸蜡的进行，但重新脱水后的效果往往不好。
4.4.1 透明效果判定肉眼观察组织块呈半透明或透明状态即可。
4.4.2 透明剂常用的透明剂有二甲苯(xylene)、甲苯(toluene)、苯(benzene)、氯仿(chloroform)和TO型生物制片透明剂等，各类透明剂各有其优缺点。
对于人体组织宜使用二甲苯进行透明：a)二甲苯I：20 分钟；b)二甲苯II：20 分钟；c)二甲苯III：20 分钟。
4.4.2.1 注意事项:a) 二甲苯的容积应为组织块总体积的5～10倍以上；b) 组织块在二甲苯中透明的时间不宜过长,以防组织变硬、变脆，具体时间依不同类组织类型和大小而定，一般组织块呈现棕黄色或暗红色透明即可；c) 二甲苯应及时过滤、更换；d) 组织块经二甲苯处理后不显现透明时，常提示该组织固定或脱水不充分，应查找原因并妥善处理。
4.5 浸蜡组织经过透明后，移入溶化的石蜡溶液内，这一步骤称浸蜡(infiltration)，其目的是以石蜡置换出组织块中的二甲苯，使较软的组织块变成有一定硬度的组织蜡块，以便切成薄片。
浸蜡的方法是将组织块经过二甲苯透明后，立即投入到溶化的石蜡中去。
在浸蜡时组织必须经过数次纯石蜡处理(石蜡I、II、III)，使剩余透明剂完全除尽，否则将影响切片质量。
根据熔点的不同，石蜡分为软蜡和硬蜡。
软蜡熔点低，硬蜡熔点高。
一般切片所用的软蜡熔点为42～45℃或45～50℃，硬蜡熔点为52～54℃或56～60℃，现在也有62—64℃的硬蜡，适用于南w w w .e ge n e.o rg.cnw w w .e ge n e.o rg.cn方夏天或较坚硬的组织。
组织较硬时，用硬蜡，反之，用软蜡。
浸蜡在温箱中进行，箱内温度略高于石蜡熔点2～3℃即可。
若箱内温度偏低，石蜡会凝固，则达不到浸蜡目的。
温度过高，浸蜡的组织会出现收缩变硬，同时组织中的抗原易受到破坏，不利于免疫组织化学等蛋白质分析。
在更换蜡杯时，要有一定的间隔时间，尽量减少组织内含有的二甲苯被带入最后的纯石蜡杯中，而影响浸蜡程度。
人体组织的浸蜡操作宜采用以下步骤：a)石蜡 I（45～50℃）：60分钟；b)石蜡 II（56～58℃）：60分钟；c)石蜡 III（56～58℃）：60分钟。
4.5.1 注意事项a) 熔化的石蜡必须有专人负责，必须在熔蜡箱内或水浴中（70℃）进行，不得用明火加温；b) 熔蜡的容积应为组织块总体积的5～10倍以上；c) 组织块经二甲苯适度透明后方可转入浸蜡过程，应尽可能减少将透明后组织块表面的二甲苯带入熔化的蜡中；d) 浸蜡时间要适当。
时间过短，浸蜡不充分，组织将过软；过长时间则组织变硬、变脆；e) 熔蜡应定期过滤、更换。
5 组织包埋包埋(embedding)是组织经过固定、脱水、透明、浸蜡后，再用石蜡铸成蜡块的过程。
包埋用的石蜡熔点要和浸蜡用的石蜡熔点相一致；包埋用的石蜡温度要稍高于浸蜡的温度。
先将熔化的石蜡倾入包埋模具中，再用加热的弯曲的钝头镊子轻轻夹取已经浸过蜡的组织块，使组织块的最大面或特别指定处的组织面向下埋入熔蜡中。
要将组织块平整地置放于包埋模具底面的中央处。
一般切面方向朝下放置；管状、囊壁、皮肤及层次清楚的黏膜应立埋；包埋于同一蜡块内的多块细小组织应彼此靠近；包埋时应使组织急速均匀地凝固，以免石蜡产生白色结晶导致切片破碎。