HPLC手性固定相法在体内药物分析中的应用

手性柱的分类和应用举例
含碳水化合物的手性固定相 举例
周婕等用[12]新型键合直链纤维素衍生化合物手性固定相Chiralpak IC色谱柱(50 mm×4.6 mm,5 μm)，流动相正己烷－异丙醇-二乙胺 (80:20:0.1), 流速0.8 mL/min，检测波长273 nm，柱温25 ℃,血 浆中西沙必利对映体能够完全分离，分离度1.65，其血浆提取回收 率达87%，线性范围为10～160 μg/mL，最低检测限为5 μg /mL， RSD＜4.0%。
π-氢键型键合固定柱
例：韩海等[4]用Pirkle型 Sumichiral OA手性柱对体内D酸性氨基酸进行了拆分测定，并建立了快速分系统，用 本系统对免疫功能低下的老年病小鼠动物模型快速老化 小鼠亚系1 (SAMP1) 进行分析发现了其胸腺和脾脏中D天门冬氨酸的含量较对照组同龄抗快速老化小鼠亚系 1(SAMR1)有显著升高趋势。
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手性分子：组成相同但空间结构上互成镜像 的分子，称之为对映异构体。 分子结构中含有不对称碳原子是最常见的手 性结构。 根据对偏振光的作用不同可分为R、S体 两者的等量混合物称之为消旋体。
COOH
COOH
HH
OH
CH3
OH
CH 精品课件
3
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手性药物药效学差异
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手性柱的分类和应用举例
配体交换相 将手性配体通过各种间隔基与硅胶键合，属亲水性固定相 。通过一个金属离子与一个配体分子和一个对映体溶质 分子结合成可逆的非对映体而达到分离。
例：苏丹等[16]用Phenomenex chirex 3126 配体色谱柱， 对肌肽对映体进行了拆分。。
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手性柱的分类和应用举例
排泄 肾脏排泄的立体选择性主要表现在肾小管分泌、主动转运和肾代谢过程， 导致对映体间发生相互作用。
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1992年美国食品与药品监督管理局（FDA）提出 发展单一对映体生产计划和对映体药物纯度的 鉴定规定后，如何能快速而准确的分离和测定 手性药物已成为医药界关注的重大课题。
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手性药物拆分方法
核酸类手性固定相 寡糖类的手性固定相等
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手性柱(商品柱） Chiralcel柱类型与应用
手性聚合物固定相Chiralcel柱类型与应用
柱型号
固定相，官能团
Chiralcel OA
纤维素三乙酯
Chiralcel OB
纤维素三苯甲酸酯
Chiralcel OC
纤维素三苯氨基甲酸酯
Chiralcel OD 纤维素（3，5-二甲苯基氨基甲酸酯）
HPLC手性固定相法 在体内药物分析中的应用
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手性药物（chiral drug）
药物分子结构中引入手性中心后，得到的一对互为实物 与镜像的对映异构体。
这些对映异构体的理化性质基本相似，仅仅是旋光性有 所差别，分别被命名为R-型（右旋）或S-型（左旋）、 外消旋。
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反应停事件
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手性药物的药代动力学
吸收 被动吸收：手性因素无影响。 主动转运和易化扩散：可能发生对映体间的竞争性相互作用和吸收的变化
分布 手性药物对映体竞争性的与血浆蛋白、酶或受体结合，都可引起对映体间 相互作用及其在分布上的改变。
代谢 相互抑制作用：对映体竞争同一代谢酶，会发生对映体间的相互抑制。 单向抑制作用：如果一个对映体是另一个对映体的代谢抑制剂，则会发生 单向抑制作用。
利用物理性质——溶解度、吸附力等的差异，如：结晶 法、色谱法等；
利用反应速度差异的动力学拆分法； 利用酶的高度特异性的催化反应的酶拆分法
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手性药物色谱法拆分
超临界流体色谱法（SFC） 气相色谱法（GC） 高效液相色谱法（HPLC） 高效毛细管色谱法（HPCE）
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手性HPLC法
间接法（CDR） 柱前衍生化法，手性试剂衍生化法（CDR），将具有高光 学纯度的手性衍生化试剂（CDR）反应引入第二个手性 中心，形成非对映异构体，可在普通固定相上实现分离 测定。
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手性柱的分类和应用举例
含肽或蛋白质键合相 CHIROBIOTIC V 手性柱
糖肽类抗生素（万古霉素）键合在硅胶上，由于万古霉素 结构特点使柱子具有手性的氢键结合部位、肽键结合部 位和碳水化合物结合部位，可与被分离物质发生静电作 用、包合作用、偶极叠加作用、电荷转移作用、形成氢 键和立体排斥等作用，可采取正相、反相和新极性有机 相分离，对胺类、中性酰胺、脂类有很好的立体选择性
其他类型的手性柱 分子印迹聚合物手性固定相（MIP-CSP） 分子印迹聚合 物(MIPs)通过分子印迹技术合成的对特定目标分子（模 板分子）及其结构类似物具有特异性识别和选择性吸附 的聚合物。MIPs 发挥特异性识别作用的关键是其具有 能与模板分子及类似物的官能团相结合的特殊空穴[17] 。MIP-CSP 依靠拥有对印迹单对映体立体结构具有记忆 功能的结合位点来进行手性识别的，利用与不同对映体 吸附作用的差异实现拆分。
张亮等[14]以Chiralpak AD-RH(4.6 mm×150 mm,5 μm)色谱柱，10 mmol/L硼砂缓冲液(0.1%三乙胺，pH 9.0)-乙腈-乙醇(50:25:25) 为流动相分离普萘洛尔对映体，检测波长为229 nm,研究普萘洛尔 对映体及其外消旋体经大鼠皮肤渗透的对映体选择性。结果萘洛尔 对映体在21 min 内完全分离(分离度Rf =2.2),在3～200 μg/mL内 线性关系良好。Chiralpak AD 还用于建立了血浆中奥美拉唑对映 体的分析方法[15]。
以Pirkle型应用最为广泛。 分离原理在与溶质间的n-n相互作用，氢键作用和偶极-偶极作用。 Pirkle型手性固定相通过链烃基将手性有机小分子链接到硅胶载体上制得。
含端羧基或异氰酸酯基的手性基团的化合物与氨基键合硅胶进行缩合反应 分别形成含酰胺型或脲型结构的手性固定相。
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手性柱的分类和应用举例
直接法 手性选择剂键合到固定相表面或加入流动相中，药物对 映体通过与手性选择剂形成的暂时的非对映络合物的能 量差或稳定性不同而达到分离的目的。
手性固定相法（CSP） 手性流动相法（CMPA）
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手性柱的分类和应用举例
π-氢键型键合固定柱 将有光学活性的有机小分子通过一定间隔基键合到硅胶柱上。
β－内酰胺，生物碱 甲基芳基酯，甲氧基芳基酯
芳香化合物 生物碱，胺，莨菪碱，β－受体拮抗剂
生物碱，胺，莨菪碱 酯，酰胺，含磷化合物，芳香化合物
酯，酰胺，含磷化合物
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手性柱（商品柱）
Astec CYCLOBOND系列(键合环糊精手性柱),手性、非手 性选择性，可与LC-MS兼容；
Astec CHIROBIOTIC系列(大环糖肽型手性柱),可用于含 水和非水流动相，特别适用于极性和可电离化合物的分 离；
Chiralcel OE
纤维素二苄醚
Chiralcel OF 纤维素三（对氯苯基氨基甲酸酯）
Chiralcel OG 纤维素三（对甲苯基氨基甲酸酯）
Chiralcel OJ
纤维素三（对甲苯基甲酸酯）
Chiralcel OK
纤维素三肉桂酸酯
Chiralcel AD 淀粉三（3，5-二甲苯基氨基甲酸酯）
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手性药物药效学差异
两种对映体的作用相反 如：异丙肾上腺素（ β1-受体激动剂） R-(-)-：受体激动作用 S-(+)-：受体拮抗作用
一种对映体具有药理活性，另一种具有毒性作用
氯胺酮为中枢性麻醉药物，只有(S)-(+)-对映体才具有麻醉作用，而(R)(-)-对映体则产生中枢兴奋作用。
镇静药沙度利胺（反应停）， (R)-对映体有镇静作用， (S)-对映体及其 代谢产物有严重的胚胎毒性和致畸作用。
两种对映体具有相同或相近的药理活性 异丙嗪：抗组胺；普罗帕酮：抗心律失常。
一种对映体具有药理活性，另一种活性弱或无活性 非甾体抗炎药物的α-芳基丙酸类化合物，如萘普生、布洛芬等。
两种对映体药理活性相似，但反应强度不同 代表药物：抗癌药环磷酰胺， S-对映体活性是R-对映体的2倍。
两种对映体具有不同的药理活性 作用于不同的靶器官、组织而呈现不同的作用模式。 代表药物：索他洛尔， S-对映体——β阻断作用 R-对映体——抗心律失常作用
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手性柱的分类和应用举例
含肽或蛋白质键合相 将蛋白质、酶和抗体等生物大分子键合到硅胶，可用于分 离酸类、胺类、β-氨基酸类药物。
例：用T1-酸糖蛋白(T1-acidglycoprotein, AGP)ChiralAGP 柱
顾景凯等对口服给药后兔血浆中新抗炎镇痛剂SFZ-47 [(±)-3H-1, 2-二氢-2-( 4-甲基苯胺基)-甲基-1-吡咯里嗪酮]对映异构体进行 了分离测定，两种异构体得到较好分离，血浆中(-)-SFZ-47对映体 浓度始终高于(+)-SFZ-47, 说明(+)-SFZ-47体内优先消除。 王晓琳 液相色谱法对注射及口服布洛芬精氨酸之后布洛芬对映体进 行分离。 房晶等测定了苯磺酸左旋氨氯地平血药浓度。
Chiralcel AS 淀粉三（S）-1-苯乙基氨基甲酸酯）
Chiralcel OT(+)
聚三苯甲基乙丁烯酸酯
Chiralcel O(&拆分化合物类型 脂肪酸族小分子化合物 脂肪酸族和芳香族小分子化合物
环戊烯酮类 生物碱，胺，莨菪碱，β－受体拮抗剂
芳香化合物 β－内酰胺，生物碱，二氢吡啶
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手性柱的分类和应用举例
含碳水化合物的手性固定相 β-环糊精（CD)手性固定相，CD与硅胶上不水解的硅烷链 相连，CD分子呈锥筒状洞穴，大小有CD环大小决定，洞 穴内为疏水性缩醛氧原子，洞穴外沿为亲水性羟基，对 映体以能否进入洞穴形成包合物及紧密程度，产生不同 的保留时间从而得到拆分。