微生物学实验设计书

微生物学设计性实验

环境中放线菌的提取分离，鉴定以及生物活性的研究

摘要：放线菌是重要的抗生素产生菌，具有抑菌性，本实验以土壤中的放线菌为实验对象，经过对土壤中的放线菌的分离纯化从而获得纯种的放线菌，进而对它的抑菌性进行研究，得出的结论为土壤中的放线菌具有抑菌性。

关键词：放线菌分离纯化抑菌性

1.前言

因其菌落呈放射状而得名。大多有基内菌丝和气生菌丝，少数无气生菌丝，多数产生分生孢子，有些形成孢囊和孢囊孢子。依靠孢子繁殖。表面上和属于真核生物的真菌类似，从前被分类为“放线菌目”(Actinomycetes)。但因为放线菌没有核膜，且细胞壁由肽聚糖组成，和其它细菌一样。目前通过分子生物学方法，放线菌的地位被肯定为广义细菌的一个大分支。放线菌用革兰氏染色可染成紫色（阳性），和另一类革兰氏阳性菌——厚壁菌门相比，放线菌的GC含量较高。

2.1实验目的

学习和掌握土壤中放线菌的分离和纯化技术

观察放线菌菌体的基本形态

鉴定以及探究其生物活性

3. 实验原理

放线菌是原核生物，是重要的抗生素产生菌，在土壤中的数量仅次于细菌，尤其在有机质丰富、透气性好的中性到微碱性土壤中的数量较多，土壤颗粒的分散程度对于分离放线菌也有影响。分离放线菌时，一般在制备的土壤稀释液时添加百分之十的酚或在分离培养基中加相应的抗生素以抑制细菌和霉菌。（如加链霉素25-50μ/ml以抑制细菌;添加制霉菌素50μ/ml或多菌灵30μ/ ml以抑制霉菌）。胆酸钠处理土壤悬液后土壤分散效果较好，且优于纯蒸馏水。这可能是因为胆酸钠对土壤腐殖质具有较强的结合能力从而有利于破坏土壤团聚结构。重铬酸钾对土壤真菌、细菌的抑制作用较明显，然而对放线菌并无抑制作用。而且其价格低廉。其可作为理想的放线菌分离抑制剂。实验证明酵母膏、SDS（十二烷基硫酸钠）也有抑菌的作用。

要想获得放线菌的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。

4 材料与方法

4.1 菌源：

选定采土地点后，铲去表土层2—3cm，取3—10cm深层土壤10g，装入已灭过菌的纸袋中，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。土壤采集后应及时分离，凡不能及时分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌相的变化。

4 .2 试剂与仪器

培养基：

1、高氏一号培养基： K2HPO4﹒3H2O 0.5g，可溶性淀粉 20g，KNO3 1g, MgSO4﹒7H2O 0.5g， FeSO4﹒7H2O 0.01g，NaCl 0.5g， H2O 1000ml。

2、 LB培养基（液体）：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，H2O 1000ml，pH 7.0 5、 LB培养基（固体）：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，琼脂 16g，H2O 1000ml，pH 7.0

无菌培养皿，无菌镊子，无菌滴管，显微镜，涂布棒，载玻片，盖玻片，无菌移液管，称量纸，药勺，酒精灯，

10％的酚溶液或（抑制细菌生长），盛有90ml的无菌水并带有玻璃珠的三角瓶，盛有4.5ml无菌水的试管，无菌移液管，接种环，0.1％的美蓝染液

3 试验方法

注意：所取的土样不可过湿，防止样品中杂菌过多；至土壤稀释液时要振荡充分，是土样与水充分混合，将菌分散。

3.1 分离

（1）制备土壤稀释液称取土样1g，加入到一个盛有99ml并装有玻璃珠的无菌水中，并加入10滴10％的酚溶液（抑制细菌生长），有时也可不加酚。震荡后静置5min，即成10-2土壤稀释液。

（2）倾注法分离将土壤稀释液分别稀释为10-3、10-4、10-5三个稀释度，然后用无菌移液管依次分别吸取1ml10-3、10-4、10-5土壤稀释液于相应编号的无菌培养皿内，用高氏1号培养基倒平板，每

个稀释度做2-3个平行皿。

（3）培养冷凝后，将平板倒置于28℃恒温

4.观察鉴定

（1）菌落形态及菌苔特征的观察

观察放线菌菌落表面形状，大小，颜色，边缘，以及有无色素分泌到培养基内等；并用接种环挑取菌落，注意菌丝在培养基上着生的紧密情况。

（2）个体形态的观察

（3）生物活性的鉴定

抑菌实验

菌种的活化：把放线菌接种到种子培养基，37℃培养2天，同时把金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别接到LB液体培养基置于37℃培养发酵：将活化的放线菌接种到发酵培养基上，37℃培养3天

试验步骤：将发酵液离心，得上清。同时，将配置好的LB固体培养基倒入平皿，将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别涂布于细菌培养基中，恒温培养一段时间，将滤纸用打孔器打成5mm直径的圆纸片，将圆纸片浸入发酵液中10min左右，用镊子取出备用。

把4片圆纸片平整的放在培养基的四个区域，在38摄氏度下培养18~20h，观察，测量抑菌圈的大小。

5.实验结果

6.注意事项.

（1）土壤采集后应及时分离，凡不能及时分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌相的变化。

（2）调节PH 时要小心操作，尽量避免回调而带入过多的无机离子。

（3）配置培养基时应注意各药勺不要混用：称完药品后应及时盖

紧瓶盖。