间接免疫荧光讲ppt课件
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间接免疫荧光讲
荧光显微镜、玻片架、滤纸、37℃温箱等。
实验步骤
1. 滴加01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上， 10min后弃去，使标本保持一定湿度。
2. 滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体 标本，覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷盒 内，37℃保温30min。
3. 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的 PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸 泡，每缸3-5 min，不时振荡。
试剂与仪器
磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS 进 行稀释
缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M 碳 酸盐缓冲液1份配制
搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml ）
有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）
3. 为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对 照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。
• 标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS 。
荧光标记物对照：PBS+荧光标记物 • 特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体， 再加荧光标记的特异性抗体。
阴性对照：阴性血清+荧光标记物
4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥， 加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
5. 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性 荧光强度，一般可用“+”表示： （-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+） 荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（ +++ --++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧 光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为 （±）或（-），即可判定为阳性。
实验步骤
1. 滴加01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上， 10min后弃去，使标本保持一定湿度。
2. 滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体 标本，覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷盒 内，37℃保温30min。
3. 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的 PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸 泡，每缸3-5 min，不时振荡。
试剂与仪器
磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS 进 行稀释
缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M 碳 酸盐缓冲液1份配制
搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml ）
有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）
3. 为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对 照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。
• 标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS 。
荧光标记物对照：PBS+荧光标记物 • 特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体， 再加荧光标记的特异性抗体。
阴性对照：阴性血清+荧光标记物
4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥， 加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
5. 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性 荧光强度，一般可用“+”表示： （-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+） 荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（ +++ --++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧 光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为 （±）或（-），即可判定为阳性。
《间接免疫荧光实验》课件
的准确性和可靠性。
培训与技能 提升
为提高实验结果的可靠性，应进行重复实验，并对结 果进行统计分析，以确定结果的稳定性和可重复性。
06
CATALOGUE
实验应用与拓展
在生物学研究中的应用
细胞生物学
用于标记和观察细胞表面 的抗原，研究细胞结构和 功能。
微生物学
用于检测和鉴别病原体， 如细菌、病毒和寄生虫。
03
解读结果的意义
解释实验结果的生物学意义，并 将其与实验目的和预期结果进行 比较。
结果分析的注意事项
排除非特异性荧光
01
在解释荧光信号时，需排除非特异性荧光的干扰，确保结果的
准确性。
重复实验验证
02
为确保结果的可靠性，需进行重复实验验证，并对结果进行统
计学分析。
结果解读的局限性
03
了解实验结果的局限性，避免过度解读或误导性解读。
免疫学
用于研究免疫系统的抗原 和抗体反应，探索免疫疾 病的发病机制。
在医学诊断中的应用
感染性疾病诊断
用于检测和鉴别各种感染性疾病的病原体，如病毒、细菌和寄生 虫。
自身免疫性疾病诊断
用于检测自身抗体，辅助诊断和治疗自身免疫性疾病。
肿瘤诊断
用于检测肿瘤标志物和癌细胞表面抗原，辅助肿瘤的诊断和分类 。
实验方法的改进与拓展
其他试剂设备
其他试剂和设备包括洗涤液、 封片剂、显微镜、荧光显微镜
等。
洗涤液用于清洗细胞或组织样 本，去除未结合的抗体和荧光
标记物。
封片剂用于固定细胞或组织样 本，防止荧光标记物的脱落。
显微镜和荧光显微镜用于观察 和检测荧光标记物，提高实验 的准确性和可靠性。
03
CATALOGUE
培训与技能 提升
为提高实验结果的可靠性，应进行重复实验，并对结 果进行统计分析，以确定结果的稳定性和可重复性。
06
CATALOGUE
实验应用与拓展
在生物学研究中的应用
细胞生物学
用于标记和观察细胞表面 的抗原，研究细胞结构和 功能。
微生物学
用于检测和鉴别病原体， 如细菌、病毒和寄生虫。
03
解读结果的意义
解释实验结果的生物学意义，并 将其与实验目的和预期结果进行 比较。
结果分析的注意事项
排除非特异性荧光
01
在解释荧光信号时，需排除非特异性荧光的干扰，确保结果的
准确性。
重复实验验证
02
为确保结果的可靠性，需进行重复实验验证，并对结果进行统
计学分析。
结果解读的局限性
03
了解实验结果的局限性，避免过度解读或误导性解读。
免疫学
用于研究免疫系统的抗原 和抗体反应，探索免疫疾 病的发病机制。
在医学诊断中的应用
感染性疾病诊断
用于检测和鉴别各种感染性疾病的病原体，如病毒、细菌和寄生 虫。
自身免疫性疾病诊断
用于检测自身抗体，辅助诊断和治疗自身免疫性疾病。
肿瘤诊断
用于检测肿瘤标志物和癌细胞表面抗原，辅助肿瘤的诊断和分类 。
实验方法的改进与拓展
其他试剂设备
其他试剂和设备包括洗涤液、 封片剂、显微镜、荧光显微镜
等。
洗涤液用于清洗细胞或组织样 本，去除未结合的抗体和荧光
标记物。
封片剂用于固定细胞或组织样 本，防止荧光标记物的脱落。
显微镜和荧光显微镜用于观察 和检测荧光标记物，提高实验 的准确性和可靠性。
03
CATALOGUE
《间接免疫荧光法》课件
06
问题与展望
常见问题及解决方案
荧光染色不均
可能是由于抗体浓度过高或孵育 时间不足，解决方案是调整抗体
浓度和孵育时间。
非特异性染色
可能是由于血清内源性荧光物质干 扰，解决方案是使用去内源性荧光 物质处理。
荧光淬灭
可能是由于荧光物质不稳定，解决 方案是使用更稳定的荧光物质或采 用避光染色技术。
研究展望
01
02
03
04
医学诊断
用于检测和诊断各种疾病，如 自身免疫性疾病、感染性疾病
等。
生物学研究
用于研究细胞表面抗原、细胞 内抗原等，以及探索细胞与细
胞之间的相互作用。
农业科研
用于检测植物病毒、细菌和真 菌等病原微生物，以及研究植
物抗病性等。
环境监测
用于检测环境中的有害物质和 污染物，如重金属、农药等。
优化抗体标记技术
探索更高效、特异性和稳定的抗体标记技术 ，提高荧光染色的敏感度和特异性。
深入研究荧光物质
研究荧光物质的性质和作用机制，为提高染 色效果提供理论支持。
拓展应用领域
将间接免疫荧光法应用于更多疾病的研究和 诊断，如肿瘤、感染性疾病等。
建立标准化操作流程
制定标准化的操作流程和质控标准，提高实 验结果的可靠性和可比性。
通过使用针对特定抗原的抗体 ，间接免疫荧光法能够特异地 识别和标记目标抗原。
定位准确
间接免疫荧光法能够准确地定 位抗原的位置，有助于了解抗 原在细胞或组织中的分布情况 。
可视化结果
通过荧光显微镜观察，间接免 疫荧光法能够直观地展示抗原 的存在和分布，便于结果的解
读和分析。
局限性
抗体依赖
间接免疫荧光法依赖于针对特定抗原的抗体，如果抗体不适用或不可 获得，该方法可能无法应用。
免疫荧光技术课件PPT课件
蛋白质相互作用研究
总结词
免疫荧光技术可用于研究蛋白质之间的 相互作用，揭示生命活动的分子机制。
VS
详细描述
利用两种不同颜色的荧光标记抗体分别与 两种蛋白质结合，通过荧光共振能量转移 等技术，可以观察到两种蛋白质在空间上 的接近程度，从而推断它们之间的相互作 用。
药物筛选与开发
总结词
免疫荧光技术可用于药物筛选和开发过程中，评估药物对细胞或组织的影响。
多模态成像融合
将免疫荧光技术与光声成像、光学相干成像等其他成像技 术融合，实现多模态、多维度的生物分子成像，将有助于 更全面地了解生物样本的结构和功能。
临床应用转化
加强免疫荧光技术的临床应用研究，将其应用于疾病的早 期诊断、疗效评估和预后判断等领域，提高临床诊疗水平。
THANKS
感谢观看
研究和发展新的抗体和荧光标记技术，提高免疫荧光技术的灵敏度 和特异性，降低假阳性结果。
多标记检测
实现多标记免疫荧光技术，能够在同一样品上同时检测多种目标分 子，提高实验的信息量。
05
免疫荧光技术的应用实例
细胞内抗原定位
总结词
通过免疫荧光技术，可以精确定位细胞内的抗原，有助于研究细胞结构和功能。
详细描述
抗体
结合方式
荧光物质通过化学键与抗体结合，形 成荧光抗体，这种荧光抗体可以特异 性地结合抗原，形成抗原-抗体-荧光 抗体的复合物。
抗体是免疫系统产生的一种蛋白质， 能够特异性地结合抗原，形成抗原-抗 体复合物。
荧光信号的激发与检测
激发方式
荧光信号的激发通常采用特定波 长的光，如紫外光或蓝紫光，这 些光能够激发荧光物质发出可见
光。
检测设备
检测设备通常采用荧光显微镜， 能够检测到荧光信号并对其进行
间接免疫荧光讲(共8张PPT)
10
min到数小时，一般30
min已
荧（光+）标荧记光物较对足弱照，：但够P清BS楚。+可荧见光染；标记色物 温度多采用室温（25℃左右），高于37℃
2M碳 酸盐缓冲液1份配制
4的PBS三缸可浸泡，加每缸强3-5染min色，不效时振果荡。，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎
4的PBS 1500ml）
01mol/L，pH7. 01mol/L，pH7. 4的PBS 1500ml）
荧光标记物对阴照：性PBS对+荧照光标：记物阴性血清+荧光标记物
荧光显微镜、玻片架、滤纸、37℃温箱等。 阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。
01mol•/L，pH7阳. 性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。 阳性对照：阳性血清+荧光标记物
试剂与仪器
磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进 行稀释
缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳 酸盐缓冲液1份配制
搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml） 有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）
01mol/L，pH7.
2M碳 酸盐缓冲液1份配制
染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而 2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 n已足够。
4的PBS进 行稀释
变化，染色时间可以从 4的PBS 1500ml）
01mol/L，pH7.
如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性 对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。
间接免疫荧光法精品PPT课件
[材料]
1、淋巴细胞分层液（葡蔗糖-泛影葡胺， 比重为 1.077±0.001g/L） 2、 2％台盼蓝染液 3、 Hank’s液或者RPMI-1640培养基 4、试管、吸管、水平离心机等
[方法] 1、无菌采集静脉血2ml注入盛有2ml Hank’s液（含
100u/ml肝素）的试管中，混匀。
2、吸取淋巴细胞分层液2ml加入离心管中，再将稀 释抗凝血液小心沿管壁加至分层液上，应注意保 持两者界面清晰。（关键）
First antibody secondary antibodyfluorochrome
原理
PBMC
Target cells
材料
• PBMC • 兔抗人白细胞血清 (Ab1) • FITC-抗兔单克隆抗体 (Ab2)
方法
• 吸管取1滴PBMC液体（约10ul）滴加到标本片黑色圈圈背 面中央, 静止5-10分钟，待PBMC干燥。
间接免疫荧光
武汉大学基础医学院 免疫学教研室 潘勤
外周血单个核细胞分离
----- 葡蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法
[原理] 外周血单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞、
单核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同。 红细胞和多核细胞比重较大，为1.092左右，而淋 巴细胞和单核细胞比重为1.075左右。利用比重为 1.077左右的分层液作密度梯度离心，使一定比重 的细胞按密度梯度分布，从而将各种血细胞加以 分离。
3、室温2000r／min离心20min。管内可分为四层。
4、用毛细吸管轻轻吸出乳白色的单个核 细胞，加入另一支已含有2~5 mlHank’s液的离心管中，混匀。
5、室温下，1500 rpm离心10 min。
6、弃上清，将PBMC用1ml PBS稀释，混 匀
间接免疫荧光法检测血清中抗核抗体PPT教案课件(临床免疫学)
印片
37℃30′
洗涤
37℃30′
洗涤
待测血清 （ANA?） 荧光标记的 羊抗人IgG
荧光显微镜检测
实验步骤
1、小鼠断颈处死取肝， PBS或NS漂洗，剪取肝横断面印 片于玻片上，左右各一处，自然干燥；滴加无水乙醇固定， 室温凉干；
2、左右印片处分别盖上一片小纸片，分别滴加阳性血清 和阴性血清各1滴，37℃30′；
免疫实验室注意事项：
1、必须穿白大衣进实验室； 2、实验中注意实验室秩序； 3、如发生意外如损坏玻璃器材等，要及时报告； 4、要节约实验药品； 5、实验后要回收的玻璃器材如载玻片等，放于指定陶瓷 缸内；废纸及一次性用品弃于垃圾桶内。 6、实验完毕，清理桌面，保证实验试剂和器械放回原位。
抗原 抗体
标记 抗体
荧光 光原
间接免疫荧光法原理示意图
免疫荧光检测制备的总体方法
标本制作 荧光抗体染色 荧光显微镜检查
标本的制作
标本类型
组织切片：冷冻切片、石蜡切片（最常用）。 印片：肝、脾等细胞。 涂片：各种体液、穿刺液、细菌培养物和细胞悬
液等。
荧光抗体染色
间接法
特异性抗体与相应 抗原反应，荧光素 标记的抗抗体再与 第一抗体结合。
实验一
间接免疫荧光法 检测血清中抗核抗体
间接免疫荧光技术原理
免疫荧光技术是免疫标记技术中发展最早的技术。
本实验是利用荧光标记第二抗体（羊抗人IgG） 检测未知抗体（一抗）的方法。以检测人血清 中抗核抗体（ANA）为例。 病人血清中ANA（Ab）能与各种系细胞核成 分（Ag）特异性结合，此种结合的Ab（IgG型） 能与荧光标记的羊抗人IgG（二抗）结合，在 荧光显微镜下，细胞核显示荧光，提示血清中 ANA的存在。
37℃30′
洗涤
37℃30′
洗涤
待测血清 （ANA?） 荧光标记的 羊抗人IgG
荧光显微镜检测
实验步骤
1、小鼠断颈处死取肝， PBS或NS漂洗，剪取肝横断面印 片于玻片上，左右各一处，自然干燥；滴加无水乙醇固定， 室温凉干；
2、左右印片处分别盖上一片小纸片，分别滴加阳性血清 和阴性血清各1滴，37℃30′；
免疫实验室注意事项：
1、必须穿白大衣进实验室； 2、实验中注意实验室秩序； 3、如发生意外如损坏玻璃器材等，要及时报告； 4、要节约实验药品； 5、实验后要回收的玻璃器材如载玻片等，放于指定陶瓷 缸内；废纸及一次性用品弃于垃圾桶内。 6、实验完毕，清理桌面，保证实验试剂和器械放回原位。
抗原 抗体
标记 抗体
荧光 光原
间接免疫荧光法原理示意图
免疫荧光检测制备的总体方法
标本制作 荧光抗体染色 荧光显微镜检查
标本的制作
标本类型
组织切片：冷冻切片、石蜡切片（最常用）。 印片：肝、脾等细胞。 涂片：各种体液、穿刺液、细菌培养物和细胞悬
液等。
荧光抗体染色
间接法
特异性抗体与相应 抗原反应，荧光素 标记的抗抗体再与 第一抗体结合。
实验一
间接免疫荧光法 检测血清中抗核抗体
间接免疫荧光技术原理
免疫荧光技术是免疫标记技术中发展最早的技术。
本实验是利用荧光标记第二抗体（羊抗人IgG） 检测未知抗体（一抗）的方法。以检测人血清 中抗核抗体（ANA）为例。 病人血清中ANA（Ab）能与各种系细胞核成 分（Ag）特异性结合，此种结合的Ab（IgG型） 能与荧光标记的羊抗人IgG（二抗）结合，在 荧光显微镜下，细胞核显示荧光，提示血清中 ANA的存在。
相关主题
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6
3. 为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对 照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。
• 标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS 。
荧光标记物对照：PBS+荧光标记物 • 特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体， 再加荧光标记的特异性抗体。
阴性对照：阴性血清+荧光标记物
间接免疫荧光法
(Indirect immunofluorescence, IFA)
.
1
基本原理
将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原
反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧
光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗
原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病
毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免
疫病理检查。染色程序分为两步，第一步，用未知
未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原标本上，
在湿盒中37℃保温30min，使抗原抗体充分结合，然
后洗涤，除去未结合的抗体。第二步，加上荧光标
记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM抗体。如果第一步
发生了抗原抗体反应，标记的抗球蛋白抗体就会和
已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定未知抗
有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）
荧光显微镜、玻片架、滤. 纸、37℃温箱等。
3
实验步骤
1. 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上， 10min后弃去，使标本保持一定湿度。
2. 滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体
标本，覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷 盒内，37℃保温30min。
• 阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。
阳性对照：阳性血清+荧光标记物
如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，
阳性对照和待检标一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就
有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在 当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐 渐下降。
体。
.
2
试剂与仪器
磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS 进 行稀释
缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M 碳 酸盐缓冲液1份配制
搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml ）
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8
3. 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的 PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三 缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。
4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，
加一滴缓冲甘油，以盖玻. 片覆盖。
4
5. 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性 荧光强度，一般可用“+”表示： （-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+） 荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（ +++ --++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧 光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为 （±）或（-），即可判定为阳性。
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5
注意事项
1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一 定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度 过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原 而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。染色温度多采用室温（25℃左右）， 高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如 流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长 染色时间。低温染色过夜较37℃30 min效果好的多 。