免疫细胞培养流程20180528

细胞生产流程
2.细胞分离
• 血液收集
① 生物安全柜紫外照射30min，开机运行至 少5min； ② 镊子夹取酒精棉球；
③ 酒精棉球擦拭手术剪及止血钳“头部”， 单向擦拭； ④ 夹取新的酒精棉球擦拭血袋管路； ⑤ 止血钳夹住血袋管路，手术剪剪掉血袋管 路前段，利用重力，使血液通过管路收集 至离心管中。
细胞生产流程
5.细胞收获
① 收集细胞培养液； ② 移入250ml一次性离心管，离心，收集沉淀 的细胞，轻轻打散。 ③ 移至50ml一次性离心管，离心，收集沉淀的
细胞，轻轻打散。
④ 重复步骤。 ⑤ 细胞加入生理盐水，混匀。 ⑥ 取样，计数、检验、留样。
免疫细胞生产流程
细胞生产流程
细胞制备中心
• • • • •
1 细胞采集 2 细胞分离 3 细胞培养 4 细胞质检 5 细胞收获
生物制品规模的细胞制备中心
除细胞采集外，所有操作均在符合GMP标准的洁净环境下操作。
细胞生产流程
1.细胞采集
• 机采（单采）
血细胞分离机采集PBMC达到109数量级，细胞数量
细胞生产流程
3.细胞培养
① 一般，PBMC收集约1x106/ml外周血
（因人而异）；
② 计数； ③ 根据计数结果，收集到的PBMC，用初始 培养基重悬，按1~3x106/ml的密度接种 于初始培养容器（培养瓶或培养袋）； ④ 置于5% CO2 、37℃的 二氧化碳培养箱 中培养，定期显微镜观察细胞，计数，依
2.细胞分离
• 注意事项 ① 血液、分离液及环境温度在20~25℃之间， 分离效果较好； ② 抗凝血稀释时要去除抗凝剂体积； ③ 吸取PBMC时不可避免会吸取部分分离液， 要足够稀释，才可以把PBMC离心下来； ④ 离心时，升降加速度要调到足够低档； ⑤ 严格无菌操作。
细胞生产流程
3.细胞培养
① 一般，PBMC收集约1x106/ml外周血
细离心
• 新鲜抗凝血与生理盐水1:1 混匀后，小心滴加于淋巴细胞分离液之 液面上。离心机升速降速都设置为低档。离心。
细胞生产流程
2.细胞分离
• 密度梯度离心
• 细胞收集：
吸取白膜层，离心洗涤。细胞培养基（1640）或其他缓冲溶液洗涤两次收集PBMC。
细胞生产流程
据细胞生长状况补加扩增培养基。
⑤ 初始培养基及扩增培养基或者相关细胞因 子添加依据培养目的配制或添加。
细胞生产流程
3.细胞培养
培养过程中，显微镜观察：
细胞生产流程
4.细胞质检
① 细胞收获前48小时取样检测。
② 计数、细胞活率检测；
③ 内毒素检测； ④ 细菌、真菌检验； ⑤ 支原体检测； ⑥ 流式表型检测； ⑦ 细胞杀伤检测。 根据不同的培养目标制定相关的质检合格标准。
（因人而异）；
② 计数； ③ 根据计数结果，收集到的PBMC，用初始 培养基重悬，按1~3x106/ml的密度接种 于初始培养容器（培养瓶或培养袋）； ④ 置于5% CO2 、37℃的 二氧化碳培养箱 中培养，定期显微镜观察细胞，计数，依
据细胞生长状况补加扩增培养基。
⑤ 初始培养基及扩增培养基或者相关细胞因 子添加依据培养目的配制或添加。
多，培养周期短。对患者（顾客）身体要求高。
• 手采
采集患者外周血50-200ml，PBMC达到108数量级，
细胞数量较少，培养周期略长。
细胞生产流程
2.细胞分离
• PBMC
PBMC即peripheral blood mononuclear cell，外周血单个核细胞。外周血各种血细胞的密度不同， 利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从 而将各种血细胞分离。