多酚氧化酶的制备和性质研究
多酚氧化酶6页
多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）是自然界中分布极广的一种金属蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性。
由于其检测方便，是被最早研究的几类酶之一。
自1883年Yoghid发现日本漆树液汁变硬可能和某种活性物质相关，1938年Keilin D.和Mann G.研究了蘑菇多酚氧化酶的提取和纯化，得到多酚氧化酶并将这类酶称为polyphenol oxidase。
多酚氧化酶又称儿茶酚氧化酶，酪氨酸酶，苯酚酶，甲酚酶，邻苯二酚氧化还原酶，是六大类酶中的第一大类氧化还原酶。
多酚氧化酶的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌。
在广义上，多酚氧化酶可分为三大类：单酚单氧化酶(酪氨酸酶tyrosinase,EC.1.14.18.1)、双酚氧化酶(儿茶酚氧化酶catechol oxidse,EC.1.10.3.2)和漆酶(laccase,EC.1.10.3.1)。
在这三大类多酚氧化酶中，儿茶酚酶主要分布在植物中，微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶。
现在大部分文献所说的多酚氧化酶一般是儿茶酚氧化酶和漆酶的统称。
编辑本段二、多酚氧化酶在自然界的分布1植物中的多酚氧化酶及作用在植物(如苹果、荔枝、菠菜、马铃薯、豆类、茶叶、桑叶、烟草等)组织中，PPO是与内囊体膜结合在一起的，天然状态无活性，但将组织匀浆或损伤后PPO被活化，从而表现出活性。
在果蔬细胞组织中，PPO存在的位置因原料的种类、品种及成熟度的不同而有差异，绿叶中PPO活性大部分存在于叶绿体内[7]；马铃薯块茎中几乎所有的亚细胞部分都含有PPO，含量大约与蛋白质部分相同[8]；在茶叶中的PPO 分为游离态和束缚态，前者主要存在于细胞液中属可溶态PPO，而后者则主要存在于叶绿体、线粒体等细胞器中，与这些细胞器的膜系统或其他特异部位结合呈不溶态[9]，ThanarajS.N.(1990)研究了茶树新梢中PPO活性及多酚含量对红茶品质的影响，发现PPO活性强，多酚含量高，对红茶品质有利，相反则利于绿茶的生产[10]；新鲜的苹果中，多酚氧化酶几乎全部存在于叶绿体和线粒体中。
多酚氧化酶特性研究
多酚氧化酶特性研究摘要: 采用分光光度法, 对板栗仁多酚氧化酶( PPO) 的催化特性、最适波长、最适反应时间、最适温度、最适pH 值、热稳定性等性质进行了研究, 同时研究了Vc、EDTA、NaCl、柠檬酸4种添加剂对板栗仁多酚氧化酶活性的影响。
结果表明: 板栗仁多酚氧化酶催化氧化产物的最大吸收波长为410nm, 最佳反应时间为3min, 最适反应温度为30℃ , 最适pH 值为6. 0, 米氏常数Km = 0.0694mo l/L, Vmax = 3.918OD/min。
95℃水浴处理5min该酶已基本失活, 其中V c和EDTA对板栗仁多酚氧化酶酶促褐变有很好的抑制效果。
关键词: 板栗; 多酚氧化酶; 褐变; 抑制多酚氧化酶( Polyphenolox idase, PPO ) 是由核基因编码的铜金属酶, 其酶促褐变机制是: 内源性酚类物质在多酚氧化酶的催化下氧化生成醌, 醌再相互作用生成高分子聚合物, 从而导致褐色素的生成。
它能催化两类不同的反应, 可以使一元酚羟基化, 生成相应的邻二羟基化合物;也可以氧化邻苯二酚生成醌[ 1]。
而酚类物质是果疏组织褐变的物质基础, 不同植物、同一植物的不同组织, 同一植物的不同品种、生长环境以及不同的发育期, 其褐变的主要酚类物质均有所不同, 导致酶褐变活性也有所差异。
云南富产板栗, 但对板栗仁PPO 的活性及影响活性因素的研究则未见报道。
1材料与方法1.1材料板栗市场购外观良好, 无病虫害, 无机械损伤新鲜的云南板栗。
1.2试剂与仪器主要试剂: 聚乙烯吡咯烷酮( PVPP)、邻苯二酚、乙酸钠、冰乙酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、甲醇、乙醛、盐酸、维生素C ( V c)、EDTA、柠檬酸、氯化钠等, 均为国产分析纯。
主要试验仪器: TGL - 16G 高速台式冷冻离心机、722W 型分光光度计、HH - 4型数显恒温水浴锅、冰箱等。
1.3试验方法1.3.1粗酶液的制备酶液提取参照文献[ 2] 的方法, 有所改进。
实验二 细胞破碎及多酚氧化酶制备
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多酚氧化酶的催化作用：
酶液 邻苯二 水
试
酚
管
号
观察颜色变化
1 15滴 15滴 －
2 15滴 － 15滴
3
－ 15滴 15滴
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思考题：
• 酶的分离提取过程中要注意哪些事项？ • 在酶制备过程中加入硫酸铵的目的是什么？
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• 改变PPO基因的表达 利用反义RNA技术反向表达PPO基因，修饰转基 因植株中多酚氧化酶基因的表达，从而控制酶促 褐变。
• 目前已成功利用该技术得到了无褐变的马铃薯品 系。除了对苹果、梨、茶叶、小麦等作物的报道 外，而且对于其它食品中的多酚氧化酶的研究也 日渐丰富起来。
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• ⑶酶、氧及邻二酚形成的复合物与二个氢离子在氧桥上结 合，并释放出苯醌。
• ⑷间氧型酶与第二个邻二酚分子结合，结合位点与第一步 相同， 但两个铜原子之间的一个OH基与氢离子结合，生 成一分子水和一个氢离子。
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• ⑸间氧型酶与邻二酚的复合物与另一个H+ 结合（即两个铜原子之间的另一个OH基与 结合），生成一分子水，同时释放出第二 分子的苯醌，但氧化前后二个邻二酚的变 化并不完全相同。
溶液，混合均匀。 • 管2：加入15滴酶抽提液和15滴水，混合均匀。 • 管3：加入15滴0.01mol/L的邻苯二酚溶液和15滴水，
混合。 • 3、把3只试管放于37℃水浴中。 • 4、每隔5min震荡试管并观察每管中溶液颜色的变化，共
反应25min。 • 5、观察现象并记录实验数据。
多酚氧化酶
简介
多酚氧化酶(polyphenol oxidase， 简称PPO）是一类广泛存在于植 物体内的含铜金属酶类.由于其与 果蔬加工、品质等密切相关,人们 很早就开始对它进行深入细致的 研究.
• 铜是酶的活性中心，从蛋白质中除 去一部分或全部铜，将引起酶活性 下降或完全失活，若添加铜的话， 酶活又能恢复。不同果蔬中的PPO铜 辅基的数量会有所不同，如蘑菇中 PPO含4个铜原子，而扁豆的PPO含1 个铜原子。
琼酯糖凝胶
已装柱好的苯基琼脂糖 PenlysepharoseCL4B柱,用高盐缓冲 液A预平衡, 酶液借助梯级蠕动泵加 在柱上,洗脱液以一定流速,从高盐缓 冲液A减弱至低盐缓冲液B,最后以 50%的乙二醇进行洗脱 。由紫外监 控器(280nm)监控，调节分级收集器 流速收集。
酶活性测定 测定波长视底物而定,测定 温度为25℃,反应液由pH4的柠檬 磷酸缓冲液、测定底物和酶液组 成,一个酶活力单位为测定条件下, 每分钟引起光密度改变0.001所需 的酶量。
葡聚糖凝胶
文献报道植物组织中PPO分子量一般 介于40-70K之间，根据葡聚糖凝胶分离大 分子的原理，葡聚糖凝胶分离PPO与杂蛋白。 不同型号凝胶的分离范围是根据球形蛋白 理论模型确定的，而实际分离蛋白的结构 与理论模型常有较大差异，因此在纯化PPO 时，采用不同型号的葡聚糖凝胶进 行分离效果的比较。
包括Sepharose和Bio-gel A等。 Sepharose与2,3二溴丙醇反应，形Sepharose CL型凝胶（CL-2B ~4B），分离特性基本没变，
琼脂糖是从琼提高，可以在更
广泛的pH范围内应用。
琼脂糖凝胶稳定性要超过一般的葡聚糖 凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶对样 品的吸附作用很小。琼脂糖凝胶的机械强 度和孔穴的稳定性都很好，一般好于前两 种凝胶，使用琼脂糖凝胶时洗脱速度可以 比较快。 琼脂糖凝胶的排阻极限很大，分离范 围很广，适合于分离大分子物质，但分辨 率较低。琼脂糖凝胶不耐高温。
多酚氧化酶制备与性质
多酚氧化酶制备与性质多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）是存在于多种植物、真菌和动物体内的一种酶类。
它主要参与生物体内多酚类物质的氧化反应，是一种铜酶，催化氧化物质依靠两种配位的单核铜中心。
多酚氧化酶具有高度的催化活性和种类多样的底物适应性，常用于食品产业、医药业和环境污染治理等方面。
多酚氧化酶分离、纯化和制备是开展其相关研究和应用的前提。
其制备方法可分为传统分离、分子生物学技术和重组工程等三种方法。
传统分离方法是采用离心、滤纸剖分、离子交换层析、凝胶过滤层析或超滤等方法，通过化学检测和活性检测手段获得多酚氧化酶。
但这种方法存在着操作麻烦、纯化度低、产率不高等缺点。
分子生物学技术则是利用基因克隆和表达工具，从源头上获得多酚氧化酶基因序列进行提取和纯化。
目前研究中常用的是PCR扩增、应用大肠杆菌或酵母菌实现异源表达等方法。
重组工程方法是指将多酚氧化酶基因定向插入宿主细胞中，结合合理培养条件，利用重组合成技术得到具有高活性和高特异性的多酚氧化酶。
这种方法的优势在于产量高、纯度高且结构相对稳定。
多酚氧化酶性质的主要特点包括多酚类物质的高效氧化反应、菌落变色和储存特性。
多酚类物质的高效氧化反应：多酚氧化酶主要针对多酚类物质进行高效氧化反应。
例如，多酚氧化酶可以催化咖啡因氧化成黑色物质，其颜色变化的过程符合米氏方程（Michaelis-Menten equation），表现出一定的反应速率和反应程度。
菌落变色特性：多酚氧化酶具有天然菌落颜色的变色特性，这是因为多酚氧化酶可以催化多酚类物质氧化成黑色色素，从而产生的颜色变化可以用于分析检测和实验研究。
储存特性：多酚氧化酶可以保存在含钾的磷酸盐缓冲液中，并且可以在冷藏条件下保持其催化活性和稳定性。
但是为了避免酶的降解和变性，一般应该避免恶劣的环境和条件。
综上，多酚氧化酶是一种广泛存在于生物体内的酶类，具有高效催化和底物适应性等优势。
其制备方法包括传统分离、分子生物学技术和重组工程等三种方法。
草莓多酚氧化酶实验报告
一、实验目的1. 掌握多酚氧化酶（PPO）的提取方法；2. 了解多酚氧化酶的活性测定原理及操作方法；3. 探讨草莓多酚氧化酶的活性与温度、pH值等因素的关系。
二、实验原理多酚氧化酶（PPO）是一种含铜的酶，主要存在于植物组织中，参与植物组织的褐变过程。
本实验通过提取草莓中的多酚氧化酶，测定其活性，并探讨其活性与温度、pH值等因素的关系。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜草莓、无水乙醇、蒸馏水、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠、硫酸铜、铁氰化钾等。
2. 实验仪器：离心机、分光光度计、恒温水浴锅、研钵、天平等。
四、实验方法1. 多酚氧化酶提取（1）将新鲜草莓洗净，用组织捣碎机捣碎，取适量匀浆；（2）加入适量的无水乙醇，搅拌均匀，室温下放置30分钟；（3）将匀浆转入离心管中，以3000r/min离心10分钟；（4）取上清液，加入适量的硫酸铜和铁氰化钾，室温下放置30分钟；（5）将反应液转入离心管中，以3000r/min离心10分钟；（6）取上清液即为多酚氧化酶提取液。
2. 多酚氧化酶活性测定（1）取一定量的多酚氧化酶提取液，加入适量的磷酸缓冲液（pH值6.8）；（2）将反应液置于分光光度计中，在470nm波长下测定吸光度；（3）以磷酸缓冲液为空白，计算多酚氧化酶活性。
3. 温度对多酚氧化酶活性的影响（1）将多酚氧化酶提取液分别置于不同温度（20℃、30℃、40℃、50℃、60℃）的水浴锅中；（2）每5分钟测定一次酶活性，共测定30分钟；（3）比较不同温度下酶活性的变化。
4. pH值对多酚氧化酶活性的影响（1）将多酚氧化酶提取液分别置于不同pH值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）的磷酸缓冲液中；（2）每5分钟测定一次酶活性，共测定30分钟；（3）比较不同pH值下酶活性的变化。
五、实验结果与分析1. 多酚氧化酶提取通过实验，成功提取了草莓中的多酚氧化酶，提取液呈现蓝色。
2. 多酚氧化酶活性测定通过测定，得到草莓多酚氧化酶的活性为（以每分钟吸光度变化表示）。
多酚氧化酶的配置与性质研究
0.2mol.L-1
二：多酚氧化酶的制备 1.取50g去皮切丁的土豆与60ml丙酮混合， 粉碎，抽滤滤渣，用-20℃的丙酮酸冲洗至白 色，室温下晾干。2.取5g土豆干粉与40ml粗 酶提取液混合。搅拌、离心与1500r/min的离 心机上，静置，取上清液。3.加入等体积的 饱和（NH4）2SO4溶解离心、静置、取沉淀 物。4.加入磷酸缓冲液（ＰＨ＝６．０） 15ml溶解，再次离心精置，取上清液，即为 多酚氧化酶。
二：ｐｈ对多酚氧化酶的影响 配置磷酸缓冲液ＰＨ＝５．８、６．０、６．４、 ６．５、６．６、７．０、７．５一系列不同Ｐ Ｈ值的缓冲液，先将１ｍｌ０．２ｍｏｌ／Ｌ的 领苯二酚溶液加入１ｃｍ的玻璃比色皿中，在将 ２ｍｌ粗酶液与４ｍｌ０．２ｍｏｌ／Ｌ不同ｐ ｈ值的磷酸缓冲液混合。然后取出１．５ｍｌ迅 速加入到已加了的邻苯二酚比色皿中，在室温下， 于４２０ｎｍ处测定ＯＤ值，蒸馏水作为空白对 照，加入酶夜后开始计时，记录ＯＤ值的时间间 隔为30″，以最初直线的斜率（△ＯＤ／△ｔ）计 算酶活力。每分钟引起吸光度改变０．００１所 需的酶量为一个酶活力单位。即可得到最适ｐｈ 值。以OD值为纵坐标，以不同PH值为横坐标， 在坐标纸上绘制标准曲线。
多酚氧化酶的配置与性质研究
小组成员：张海兵（1002011012） 李 杰(1002011011) 黄平飞（1002011034 ） 徐２０型）、高 速离心机 • 43gＮａ２ＨＰＯ４．２Ｈ２Ｏ，16gＮａＨ ２ＰＯ４ ．２Ｈ２Ｏ，50g土豆，0.22g领 苯二酚。 邻苯二酚溶液的配置 将0.22g领苯二酚溶于10ml水溶液中，即可得 到0.2mol.L-1的领苯二酚溶液。
试剂的配置
缓冲液的配置：Ｎａ２ＨＰＯ４．２Ｈ２Ｏ相对分子质量＝１７８，0.2mol.L-1溶液为８５．６１ ｇ．Ｌ－１；ＮａＨ２ＰＯ４ ．２Ｈ２Ｏ相对分子质量＝１５６， 0.2mol.L-1溶液为３１．２１ｇ．Ｌ－.
多酚氧化酶的实验报告
1. 了解多酚氧化酶的活性测定原理及方法。
2. 掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的操作技术。
3. 通过实验，分析影响多酚氧化酶活性的因素。
二、实验原理多酚氧化酶（PPO）是一种含铜的氧化酶，广泛存在于植物组织中。
在适宜的条件下，PPO催化酚类物质氧化形成醌类物质，使植物组织发生褐变。
本实验采用分光光度法测定多酚氧化酶活性，以邻苯二酚为底物，通过测定反应过程中吸光度的变化来计算酶活性。
三、实验材料与试剂1. 材料：新鲜马铃薯、0.1mol/L邻苯二酚溶液、pH6.8磷酸盐缓冲液、NaF溶液、5%三氯乙酸溶液、硫脲、0.01mol/L间苯二酚、蒸馏水。
2. 仪器：分光光度计、匀浆机、离心机、恒温水浴、移液器、试管等。
四、实验步骤1. 酶液的制备：取新鲜马铃薯150g，洗净后切块，加入150mL NaF溶液，匀浆后用四层纱布过滤。
取滤液50mL，于3500r/min离心5-10min，取上清液。
2. 酶活性测定：取3支试管，分别编号为A、B、C。
向A、B、C三管中加入0.1mol/L邻苯二酚溶液1mL、pH6.8磷酸盐缓冲液2mL，向A、B管中加入酶液0.5mL，C管不加。
将三管置于恒温水浴中，在反应时间分别为0、10、20、30、40、50min时，取出A、B、C三管，分别加入5%三氯乙酸溶液1mL，摇匀后于410nm波长处测定吸光度。
3. 数据处理：以邻苯二酚为标准曲线，计算酶活性。
五、结果与分析1. 标准曲线的绘制：以邻苯二酚浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 酶活性计算：根据标准曲线，计算不同反应时间下的酶活性。
3. 影响酶活性的因素分析：通过实验，分析温度、pH、底物浓度、酶浓度等对酶活性的影响。
1. 成功掌握了分光光度法测定多酚氧化酶活性的原理及操作技术。
2. 通过实验，分析了影响多酚氧化酶活性的因素，为后续研究提供了依据。
七、实验讨论1. 在实验过程中，发现温度对酶活性有显著影响。
实验四、多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质
实验四、多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质多酚氧化酶（Polyphenol oxidase, PPO）是一种广泛存在于植物、菌类和动物体内的酶，主要催化化学反应为将多酚氧化成醛或酮。
本实验旨在通过测定PPO的活性来了解酶的基本特性及其酶学性质。
一、实验材料1、经过离心沉淀的香蕉、苹果、洋葱原汁。
2、6%聚乙烯醇（PVA）溶液。
3、明胶溶液（1%）。
4、酚酞指示剂。
5、75mM bicine缓冲液（pH 8.5）。
6、0.05% 过氧化氢溶液。
7、1% 多巴胺溶液。
8、分光光度计。
二、实验原理多酚氧化酶是一种铜单子酶，催化剂的过程时首先将基质中的酚乙酸类化合物与氧气反应形成间醌，然后间醌的氧化、聚合，形成花青素、黑色素等产物。
本实验采用的基质是多巴胺（L-dopa），媒介是酚酞指示剂，测定体系的光学吸收度。
酶的活性按单位时间内反应的基质质量而计算。
三、实验步骤1、提取PPO将香蕉、苹果、洋葱各取50g，切碎，加入200ml 0.1M盐酸溶液，搅拌后放在4℃冷库20-30min，滤去上清液。
将残渣加入100ml冷水，搅拌，离心至沉淀物无明显色泽，取上清液后pH调节至8.5，保存于冷库。
2、测定PPO的活性（1）制备基质溶液：10mg多巴胺溶于2ml 0.1M的硫酸钠溶液中，用1M的NaOH溶液调节pH至8.5，加入12ml0.75M缓冲液，加水至50ml。
（2）制备酚酞指示剂溶液：2mg的酚酞溶于100ml的乙醇中，加水至1L，制成0.2%的酚酞溶液。
（3）测定反应系统：将基质溶液、酚酞指示剂溶液和一定量提取液混合，在25℃下恒温反应5min。
（4）实验对照：在上述条件下，仅加入基质溶液和酚酞指示剂溶液，无提取液作为实验对照。
（5）催化反应停止：加入0.5ml 的聚乙烯醇溶液。
（6）光度计测量：在650nm处上述反应体系产生的色素的吸光度。
4、结果计算将吸收度计算为1cm光程曲线的峰高比，用表格法计算多酚氧化酶活性反应速率以μmol/min为单位。
生物化学实验
五、操作方法
1.多酚氧化酶的制备 1.多酚氧化酶的制备
每三个小组一起，称取150g马铃薯（新马铃薯可以不去皮）， 切块后放入匀浆机，加入150mLNaF溶液，匀浆后用四层纱 布过滤。 各组分别量取50mL滤液置离心管中，于3500转/min离心5～ 10min，取上清夜，加入固体硫酸铵16g，溶解，于4℃放置 30min，于3500转/min离心15min，倒掉上清液，沉淀用 15mL pH6.8的磷酸盐缓冲液溶解，即为粗酶液，含有马铃 薯多酚氧化酶。
1
2
3
4
5
37℃保温5min，观察颜色变化,确定最适pH值
表2 多酚氧化酶的化学性质
试管号 酶液 5％三氯乙酸 硫脲 振荡混匀后分 别加入邻苯二 酚15滴，于 37℃保温 10min，观察 颜色变化
1
15滴
－
－
2
15滴
15滴
－
3
15滴
15滴
少许
4．底物专一性
按表3加入各试剂，观察反应现象并记录 和分析原因。
表3 多酚氧化酶的底物专一性
试管号 1 2 3
试管号 酶液 邻苯二酚 水 混匀后37℃ 保温2min， 观察颜色变 化
1 2
15滴 5滴
15滴 15滴
_ 14滴
7.氢离子浓度的影响
按表6加入各试剂，观察反应现象并记录和分析 原因。
按表6加入各试剂，观察反应现象并记录和分析 按表6加入各试剂， 原因。 原因。
管号
0.8% HCl 0.3% 乳酸 0.2% 乳酸 0.01%碳酸钠 0.5%碳酸钠 邻苯二酚 酶液 混合后pH值
多酚氧化酶制备及性质研究实验 设计
一、实验目的
学习从组织细胞中制备酶的方法。 掌握多酚氧化酶的作用及各种因素对其作用化酶是一种含铜的酶，其最适pH值为6～7。由多 酚氧化酶催化的反应，如以邻苯二酚为底物，可以被氧化形 成邻苯二醌。由多酚氧化酶催化的氧化还原反应可通过溶液 的颜色的变化鉴定，这个反应在自然界中是常见的，如去皮 的马铃薯和水果变成褐色就是由于该酶作用的结果。多酚氧 化酶的最适底物是邻苯二酚（儿茶酚）。间苯二酚和对苯二 酚与邻苯二酚的结构相似，它们也可以被氧化为各种有色物 质。 2、 酶是生物催化剂，其催化活性易受各种因素的影响， 如温度、pH、底物种类、底物浓度、酶浓度以及抑制剂和蛋 白质变性剂等都会改变其生物催化活性。
多酚氧化酶的性质及其在茶叶加工中的研究进展
多酚氧化酶（Polyphenol oxidase ，PPO ）广泛存在于植物、动物、真菌体内，属于氧化还原酶，在广义上根据催化底物酚羟基数量的不同，可分为三大类[1]：单酚氧化酶（酪氨酸酶，EC 1.14.18.1）、双酚氧化酶（儿茶酚氧化酶，EC 1.10.3.1）和漆酶（EC 1.10.3.2）。
植物中的PPO 主要是儿茶酚氧化酶，能够在有氧条件下催化多酚类物质生成对应的醌类。
PPO 在茶叶加工中具有重要作用，通过不同加工工序或工艺抑制或提升PPO 活性，可制备出风味迥异的各类茶。
本文对多酚氧化酶的性质及其在茶叶加工中的研究现状进行了综述，展望其未来的研究方向，以期为深入研究和应用多酚氧化酶提供参考。
多酚氧化酶的性质及其在茶叶加工中的研究进展邹纯，尹军峰*中国农业科学院茶叶研究所，浙江杭州310008摘要：多酚氧化酶是茶叶加工中一类重要的氧化还原酶。
文章归纳了多酚氧化酶的结构性质和酶学性质，重点阐述了其在红茶、绿茶、乌龙茶和黑茶加工中的研究现状，并展望了其未来的研究方向，以期为深入研究和应用多酚氧化酶提供参考。
关键词：多酚氧化酶；茶叶加工；结构性质；酶学性质；应用基金项目：国家自然科学基金青年基金（32002094）、中国农业科学院茶叶研究所基本科研业务费项目（1610212018014）。
作者简介：邹纯，男，助理研究员，主要从事茶深加工与多元化利用研究。
*通讯作者，E-mail ：*****************。
The Properties of Polyphenol Oxidase and ItsResearch Progress in Tea ProcessingZOU Chun,YIN Junfeng *Tea Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou 310008,ChinaAbstract:Polyphenol oxidase is an important oxidoreductase in tea processing.This paper summarized the structural and enzymatic properties of polyphenol oxidase,emphasized its research status in the processing of black tea,green tea,oolong tea and dark tea,and prospected its future research directions,in order to provide a reference for in-depth research and application of polyphenol oxidase.Keywords:polyphenol oxidase,tea processing,structural properties,enzymatic properties,application一、PPO 的结构与性质1.PPO 的结构（1）蛋白结构植物PPO 通常先以无活性的前体形式存在，其典型结构主要分为3个部分：N-末端转移肽、中间铜离子结合区、C-末端疏水区（图1）[2]。
实验五多酚氧化酶的制备和性质研究
实验五多酚氧化酶的制备和性质研究一、目的⒈学习从组织细胞中制备酶的一般方法⒉学习多酚氧化酶的作用特性及影响多酚氧化酶作用的因素二、原理多氧化物酶是一种含铜的酶，广泛存在于各种组织如鲜蘑菇、土豆和水果中。
土豆、水果去皮后表面变成褐色就是由于该酶作用的结果。
由多酚氧化酶催化的反应（以邻苯二酚为例）可用下式表示：多酚氧化酶作用的最适pH为6～7，最适底物是邻苯二酚（儿茶酚）；间苯二酚和对苯二酚与邻苯二酚的结构相似，他们也可被氧化为相应的醌类化合物。
因此，由多酚氧化酶催化的氧化还原反应可通过溶液颜色的变化鉴定。
细胞环境中的各种因素直接影响酶的催化活性，因为酶是生物催化剂。
要研究某一种因素对于酶催化反应的影响时，仅在被研究的因素呈变化的情况下，测定它对于反应速度的影响，而其他的实验条件应保持一致。
三、材料1）土豆2）高速组织捣碎机3）烧杯（100mL）4）平纹布或纱布5）试管及试管架6）恒温水浴7）小刀8）移液管（2mL、5mL、10mL）四、试剂⑴0.1mol/L的氟化钠（NaF）溶液：把4.2gNaF溶于1000mL水中。
⑵0.01mol/L的邻苯二酚溶液：将1.1g邻苯二酚溶解于1000mL水中，用1％的氢氧化钠调节溶液的pH为6.0 。
新鲜配制，并储存于棕色瓶中。
⑶柠檬酸缓冲液（0.05mol/L,Ph4.8）⑷5%的三氯乙酸溶液⑸苯硫脲（结晶）⑹0.01mol/L的间苯二酚溶液⑺0.01mol/L的对苯二酚溶液⑻饱和硫酸铵溶液⑼0.96％的盐酸：把9.6mL浓盐酸加水稀释至1L⑽0.1%的乳酸溶液（100mL水中含有0.1mL的乳酸）⑾0.5％的碳酸钠溶液⑿0.01％的碳酸钠溶液五、操作步骤⒈多酚氧化酶的制备⑴拿一块土豆，洗去上面的泥土⑵把土豆削皮后切成小块⑶称取100g小块土豆，立即加入氟化钠溶液100mL，放入组织捣碎机中研磨30s，（此步最好6个同学一起做，上述用量乘6）⑷把匀浆物通过几层纱布过滤⑸取50mL滤液（注：滤液应无色，若为红色应重新匀浆提取），加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混合后于4℃放置30min，可见有白色沉淀产生。
多酚氧化酶的制备和性质研究
多酚氧化酶的制备与性质研究10级生物工程（2）第二组1002012025姜文能 1002012022鲍仕伟 1002012011杜敏 1002012002张强 1002012039肖辉摘要：多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）是自然界中分布极广的一种金属蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性。
关键字：多酚氧化酶系统、提取、性质研究多酚氧化酶的简介多酚氧化酶是一种蛋白体，在茶树生命活动和茶叶加工过程中参与一系列由酶促活动而引起的化学变化，故又被称为生物催化剂。
茶叶中的酶较为复杂，种类很多，包括氧化还原酶、水解酶、裂解酶、磷酸化酶、移换酶和同工异构酶等几大类。
酶蛋白具有一般蛋白质的特性，在高温或低温条件下有易变性失活的特点。
各类酶均有其活性的最适温度范围，一般在30C～50℃范围内酶活性最强。
酶若失活、变性，则就丧失了催化能力。
酶的催化作用具有专一性，如多酚氧化酶，只能使茶多酚物质氧化，聚合成茶多酚的氧化产物茶黄素、茶红素和茶褐素等；蛋白酶只能促使蛋白质分解为氨基酸。
茶叶加工就是利用酶具有的这种特性，用技术手段钝化或激发酶的活性，使其沿着茶类所需的要求发生酶促反应而获得各类茶特有的色香味。
如绿茶加工过程中的杀青就是利用高温钝化酶的活性，在短时间内制止由酶引起的一系列化学变化，形成绿叶绿汤的品质特点。
红茶加工过程中的发酵就是激化酶的活性，促使茶多酚物质在多酚氧化酶的催化下发生氧化聚合反应，生成茶黄素、茶红素等氧化产物，形成红茶红叶红汤的品质特点。
多酚氧化酶的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌。
在广义上，多酚氧化酶可分为三大类：单酚单氧化酶(酪氨酸酶tyrosinase,EC.1.14.18.1)、双酚氧化酶(儿茶酚氧化酶catechol oxidse,EC.1.10.3.2)和漆酶(laccase,EC.1.10.3.1)。
马铃薯多酚氧化酶的分离纯化及酶学特性研究
马铃薯多酚氧化酶的分离纯化及酶学特性研究作者：洪丽萍汪文华何恩铭张文惠来源：《福建农业科技》2023年第12期洪丽萍，汪文华，何恩铭，等.马铃薯多酚氧化酶的分离纯化及酶学特性研究［J］.福建农业科技，2023，54（12）：54-61.收稿日期：2023-11-02作者简介：洪丽萍，女，1969年生，助理研究员，主要从事植物生理及农产品保鲜研究。
*通信作者：汪文华，男，1985年生，副研究员，主要从事植物逆境生理研究（E-mail：**********************）。
基金项目：厦门市重大科技计划项目（3502Z20211004）；厦门市科技扶贫项目（3502Z20194509、3502Z20204504-2、3502Z20204501-3）。
摘要：为控制马铃薯在贮藏和加工过程发生的酶促褐变，对马铃薯多酚氧化酶进行分离纯化，并研究其酶学特性。
采用缓冲液提取、低温离心得到马铃薯多酚氧化酶（PPO）粗酶液，粗酶液经硫酸铵分级盐析、Sephadex G-25分子凝胶柱层析脱盐处理、DEAE Sepharose Fast Flow 阴离子交换柱层析和Sephadex G-75分子筛凝胶过滤层析分离纯化得到马铃薯PPO，进一步对其部分酶学特性进行研究。
结果显示：纯化后的马铃薯PPO其比活力为 283.0 U·mg-1，回收率为16.8% ，纯化倍数为18.6倍；该酶最适反应温度为30℃，最适反应pH为6.5；以邻苯二酚为底物时，最适底物浓度为50 mmol·L-1。
该酶对焦性没食子酸、间苯二酚的底物亲和性较强，对4-甲基儿茶酚、咖啡酸、没食子酸、对苯二酚、邻苯二酚、绿原酸的底物亲和性较低，对N-BOC-酪胺、愈创木酚亲和性很低。
关键词：马铃薯；多酚氧化酶；纯化；酶学特性中图分类号：S 532 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2023）12-0054-08DOI： 10.13651/ki.fjnykj.2023.12.008Study on the Separation and Purification of Polyphenol Oxidase from Potatoand Its Enzymatic PropertiesHONG Li-ping， WANG Wen-hua*， HE En-ming， ZHANG Wen-hui（Fujian Key Laboratory of Subtropical Plant Physiology and Biochemistry， Fujian Institute ofSubtropical Botany， Xiamen， Fujian 361006， China）Abstract： In order to control the enzymatic browning of potato during the storage and processing， the potato polyphenol oxidase was isolated and purified， and its enzymatic properties were studied. The crude enzyme fluid of potato polyphenol oxidase （PPO） was obtained by the extraction of buffer solution and centrifugation at low temperature. Then， the crude enzyme fluid was separated and purified through the ammonium sulfate salt fractionation， Sephadex G-25 molecular gel column chromatography desalination treatment， DEAE Sepharose Fast Flow anion exchange column chromatography and Sephadex G-75 molecular sieve gel filtration chromatography to obtain the potato polyphenol oxidase， and some of its enzymatic properties were further studied. The results showed that： the specific activity of purified PPO was 283.0 U·mg-1， the recovery rate was 16.8%， and the purification fold was 18.6 times. The optimum reaction temperature and pH of the enzyme were 30℃ and 6.5， respectively. When catechol was used as the substrate， the optimal concentration of substrate was 50 mmol·L-1. The enzyme had strong substrate affinity for pyrogallic acid and resorcinol， and had low substrate affinity for 4-methylcatechol， caffeic acid， gallic acid， hydroquinone， catechol and chlorogenic acid， while having low affinity for N-BOC-tyramine and guaiacol.Key words： Potato； Polyphenol oxidase； Purification； Enzymatic properties马铃薯Solanum tuberosum L.是除小麦、大米和玉米之外，世界上消费量最大的食物之一，含有丰富的碳水化合物、膳食纤维、类胡萝卜素、花青素和微量营养素（如维生素C、维生素B6、钾、叶酸、铁、硫胺、核黄素和烟酸），生产周期相对较短且产量很高，可以用各种方式烹饪用于不同的菜肴，如土豆泥、土豆面包、薯条、土豆片和土豆沙拉等，深受消费者喜爱。
烟草多酚氧化酶的分离提纯及性质研究
烟草多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)是一类多元酶，具有重要的生理功能，主要参与烟草叶片的组织分解和代谢，并能促进烟草的发酵和贮藏过程。
最近，烟草多酚氧化酶的分离提纯及性质研究受到了广泛的关注。
烟草多酚氧化酶的分离提纯主要采用离子交换法、硅胶纤维素纤维素结合法、极性振荡法、水解技术和其他复杂的分离技术。
其中，离子交换法是分离提纯烟草多酚氧化酶最常用的技术，它能有效地去除蛋白质和非多酚氧化酶的物质。
其次，硅胶纤维素纤维素结合法也被广泛应用，它能够有效地分离出活性烟草多酚氧化酶，而无需冷冻保存和高温激活。
此外，极性振荡法、水解技术和其他复杂的分离技术也被广泛应用，它们能够有效地提高多酚氧化酶的活性、纯度和稳定性。
烟草多酚氧化酶的性质研究主要围绕烟草多酚氧化酶的结构、活性、稳定性、反应机理等方面展开。
研究表明，烟草多酚氧化酶主要由三个结构域组成，分别为膜结构域、转化域和结合域，每个结构域都具有独特的功能。
此外，烟草多酚氧化酶的活性主要受pH和温度的影响。
例如，在pH4.0-6.0的环境下，烟草多酚氧化酶的活性最高，而在温度为25℃-35℃时，其活性也最高。
此外，烟草多酚氧化酶的稳定性也受pH和温度的影响，在pH2.0-7.0和温度为4℃-45℃的环境下，烟草多酚氧化酶的稳定性较好。
此外，烟草多酚氧化酶的反应机理也有所不同，它可以将多酚氧化物转化为对其有利的酚类物质。
综上所述，烟草多酚氧化酶的分离提纯及性质研究受到了广泛的关注，采用的技术包括离子交换法、硅胶纤维素纤维素结合法、极性振荡法、水解技术等，并且能够有效地提高多酚氧化酶的活性、纯度和稳定性。
同时，研究表明，烟草多酚氧化酶的结构、活性、稳定性和反应机理均受到pH和温度的影响，因此，要想提高烟草多酚氧化酶的性能，就必须在合适的pH和温度条件下进行分离提纯和性质研究。
马铃薯多酚氧化酶制备及性质实验
马铃薯多酚氧化酶制备及性质实验结果：1. 多酚氧化酶的催化作用（按表1加入各试剂）加入各试剂后混匀37℃保温8min现象：1号试管变成深褐色，2、3号试管颜色无明显变化。
结论：有底物和酶同时存在的情况下才发生反应。
2. 多酚氧化酶的化学性质（按表2加入各试剂）加入各试剂后混匀37℃保温10min现象：1号试管变成深褐色，2号试管颜色无明显变化。
结论：5%三氯乙酸很明显的降低了多酚氧化酶的活性，为抑制剂。
3. 底物的专一性（按表3加入各试剂）加入各试剂后混匀37℃保温9min现象：1号试管变成深褐色，2号试管无明显变化。
结论：多酚氧化酶对邻二苯酚有专一性。
1 2 3 1 21 2 1 21 2 1 2 34.底物浓度的影响（按表4加入各试剂）1 2 3 1 2 3加入各试剂后混匀37℃保温1min现象：三个试管颜色颜色发生不同程度加深。
1号试管颜色最浅，其次是2号，3号试管颜色最深。
结论：底物浓度的大小影响多酚氧化酶的催化速率，底物浓度越高，催化速率越快。
5.酶浓度的影响（按表5加入各试剂）1 2 1 2加入各试剂后混匀37℃保温2min现象：1号试管褐色比2号试管深结论：酶底物浓度的大小影响多酚氧化酶的催化速率，在一定范围内，酶浓度越大，催化速率越大6.氢离子浓度的影响1 2 3 4 5 1 2 3 4 5加入各试剂后混匀37℃保温5min注释：1、2、3、4、5号管的pH分别为1、3、5、7、9现象：1、2、3号试管，颜色依次加深，4号试管颜色最深，5号试管次之。
结论：pH小于最适pH时，pH越大，酶活性越高；pH等于最适pH时活性最大；超过最适pH时，酶活性又开始降低。
此多酚氧化酶的最适pH在7.0左右。
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多酚氧化酶的制备和性质研究
一、实验目的
学习从组织细胞中制备酶的方法，掌握多酚氧化酶的作用和化学性质
二、原理
多酚氧化酶是一种含铜的酶，最适pH为6~7，它催化的氧化还原反应可以通过溶液颜色的变化来鉴定。
它的最适底物是邻苯二酚，间苯二酚和对苯二酚与邻苯二酚的结构相似，也可以被氧化成各种有色的物质。
许多因素都影响酶的催化活性，如温度、pH、底物浓度、酶浓度等。
要测定这些因素对于酶反应的影响，一般是测定不同条件下酶的反应速度。
三、试剂
0.01M邻苯二酚溶液
柠檬酸缓冲液（pH 4.8，0.05M）饱和硫酸铵溶液
四、操作方法
（一）酶抽提物制备
1、取土豆匀浆液15ml，加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混合后4℃放置30分钟
2、6000转/分离心20分钟（注意离心前配平），倒掉上清。
3、将沉淀物用约8ml柠檬酸缓冲液溶解，即得到酶粗制品。
（二）多酚氧化酶的作用
1、取三支干净的试管编号为1、
2、3。
2、按下面要求制备各管
管1：加15滴酶抽提液和15滴0.01M邻苯二酚管2：加15滴酶抽提液和15滴水，混合均匀管3：加15滴0.01M的邻苯二酚，15滴水，混合均匀
3、将三支试管放于37℃水浴上。
4、每隔5分钟震荡试管并观察每管中溶液颜色的变化并记录。
什么是生物大分子？ 生物大分子:
蛋白质、核酸、脂类、糖类。
特点：
1.生物活性和在新陈代谢中的作用；
2.由简单的结构组合而成
生物大分子的制备
蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是
探求生命奥秘
生物大分子结构与功能
生物大分子的制备
生物大分子制备的总体思路
1、材料的选择和预处理
2、细胞的破碎
3、提取
4、分离纯化
5、干燥与保存
一、生物大分子制备——生物材料的选择与预处理
选择适当的生物材料。
选择的材料应含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低，尽可能保持新鲜，尽快加工处理。
动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎后在适当的溶剂中提取，如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。
植物要先去壳、除脂。
微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。
生物材料如暂不提取，应冰冻保存。
动物材料则需深度冷冻保存。
二、生物大分子制备——细胞的破碎
：
细胞的破碎：
(1)机械法：研磨：将组织置于研钵或匀浆
器；组织捣碎器
(2)物理法：
1) 反复冻融法：
2) 超声波处理法：
3) 压榨法：
4) 冷热交替法：
(3)化学与生物化学方法：
1) 自溶法：
2) 溶胀法：
3) 酶解法：
4) 有机溶剂处理法：
5) 碱处理
三、生物大分子制备——生物大分子的提取
影响提取的因素主要有：
目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小；
由固相扩散到液相的难易；
溶剂的pH值和提取时间等。
⑴水溶液提取：
蛋白质和酶的提取一般以水溶液为主。
稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的稳定性好，溶解度大，是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。
⑵有机溶剂提取
四、生物大分子制备——分离纯化
常用的分离纯化方法和技术有：
（1）根据蛋白质溶解度不同——沉淀法盐析
有机溶剂沉淀
等电点沉淀
（2）根据蛋白质分子大小的差别
透析、超滤、凝胶过滤
（3）根据蛋白质带电性质不同
电泳、离子交换层析
（4）根据配体特异性的分离方法
亲和层析
五、生物大分子制备——样品的样品的干干燥和燥和保存保存
冰冻干燥
保存保存（（以保存蛋白质和酶为例以保存蛋白质和酶为例）：）：
⑴低温保存：
⑵制成干粉或结晶保存：
⑶在保护剂下保存：
分析测定
要了解的生物大分子的物理要了解的生物大分子的物理、、化学性质主要有化学性质主要有：：①在水和各种有机溶剂中的溶解性。
②在不同温度、pH 值和各种缓冲液中的稳定性。
③固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。
④各种物理性质：
⑤其他化学性质：
⑥对其他生物分子的特殊亲和力。
分析测定方法
方法主要有两类：
即生物学和物理、化学的测定方法。
生物学的测定法主要有：
酶的各种测活方法
蛋白质含量
免疫化学方法
放射性同位素示踪法
物理、化学方法主要有：
比色法
气相色谱和液相色谱法
光谱法
电泳法
核磁共振等。