_一种载体构建的新方法-重组融合PCR法

体构建。传统构建方法可能因为要避免目的片段中
已有限制性酶切位点，而不得不选择多构建中间载
体或者选择昂贵但酶切效率低的非常用限制性酶切
位点。并构建大量中间载体，经过多次连接、转化，操
作麻烦、费时费力，不但大量增加了载体构建的工作
量且实验成功得不到保证。重组融合 ＰＣＲ 法可以将
不同来源的几个目的片段仅通过一次重组、转化克
基因组学与应用生物学，２０１２ 年，第 ３１ 卷，第 ６ 期，第 ６３４－６３９ 页 Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２０１２， Ｖｏｌ．３１， Ｎｏ．６， ６３４－６３９
技术主题 Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｆｅａｔｕｒｅ
一种载体构建的新方法：重组融合 ＰＣＲ 法
邝翡婷 １，２ 袁定阳 ２ 李莉 ２ 李新奇 ２＊
1.3 重组质粒的验证
转化平板上挑取单菌落在 ５ ｍＬ 含 ５０ ｍｇ／ｍＬ 卡 那霉素的 ＬＢ 液体培养基的 １０ ｍＬ 离心管中，３７℃， ２００ ｒ／ｍｉｎ 培养 １６ ｈ。用质粒小提试剂盒提取质粒， Sal Ⅰ单酶切验证。电泳结果表明第 １ 号和第 ３ 号菌 落质粒能够切出目的条带，即泳道 １ 和泳道 ３ 中片 段大小为 ２ ８９６ ｂｐ （图 ４）条带。
图 ４ 重组质粒酶切验证结果 注： Ｍ： １ ｋｂ Ｌａｄｄｅｒ Ｍａｒｋｅｒ； １： 第 １ 号菌落 SalⅠ酶切验证结果； ２： 第 ２ 号菌落 SalⅠ酶切验证结果； ３： 第 ３ 号菌落 SalⅠ酶切 验证结果 Ｆｉｇｕｒｅ ４ Ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｎｏｔｅ： Ｍ： １ ｋｂ Ｌａｄｄｅｒ Ｍａｒｋｅｒ； １： SalⅠｐｒｏｂｅ ｏｆ ｃｌｏｎｅ １； ２： Sal Ｉ ｐｒｏｂｅ ｏｆ ｃｌｏｎｅ ２； ３： SalⅠ ｐｒｏｂｅ ｏｆ ｃｌｏｎｅ ３
1 结果与分析
1.1 目的片段扩增及重组 PCR 结果
利用 ｐ１３０－６４９ 和 ｐＣａｍｂｉａ１３０２ 分别作为 ＰＧｔ１ 和 ｍＧＦＰ－ｎｏｓ 的模板，以 Ｆ１ 和 Ｆ２，Ｆ３ 和 Ｆ４ 分别作为两 个片段的扩增引物，按照 ３．３ 的条件对目的片段 ＰＧｔ１ 和 ｍＧＦＰ－ｎｏｓ 进行扩增，并得到预计大小的 ２ 个片 段，即泳道 ２ 中片段大小为 １ ８５９ ｂｐ 和泳道 ３ 中片 段大小为 １ ０３７ ｂｐ 的片段（图 １）。
1.4 目的基因的测序验证
将第 １ 号和第 ３ 号单菌落菌株送上海博尚生物技 术有限公司测通两个单菌落中的目的片段（２ ８９６ ｂｐ）， 并与目的序列通过 ＮＣＢＩ 进行比对，结果两个菌株全 部序列均与目的序列 １００％相同。
基因组学与应用生物学 ６３６
Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ
2 讨论
实验表明，重组融合 ＰＣＲ 法是一种简便、通用、 高效的载体构建方法，此方法较其它载体构建方法 有以下优势。
2.1 酶切位点依赖程度低
此方法只需要存在可以将目的载体线性化的限
制性内切酶的酶切位点，其它部分均无需考虑限制
性酶切位点，而是依赖于高保真性的 ＰＣＲ 扩增，特
பைடு நூலகம்
别适用于目的片段中含有较多限制性酶切位点的载
Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｖｅｃｔｏｒ Ｍａｋｉｎｇ： Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲ
Ｋｕａｎｇ Ｆｅｉｔｉｎｇ １，２ Ｙｕａｎ Ｄｉｎｇｙａｎｇ ２ Ｌｉ Ｌｉ ２ Ｌｉ Ｘｉｎｑｉ ２＊
１ Ｇｒａｄｕａｔｅ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｌｏｎｇｐｉｎｇ Ｂｒａｎｃｈ， Ｃｈａｎｇｓｈａ， ４１０１２５； ２ Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｈｙｂｒｉｄ Ｒｉｃｅ， Ｈｕｎａｎ Ｈｙｂｒｉｄ Ｒｉｃｅ Ｒｅ－ ｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｃｈａｎｇｓｈａ， ４１０１２５ ＊ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ， ｘｉｎｑｉｌｉ＠１２６．ｃｏｍ ＤＯＩ： １０．３９６９／ｇａｂ．０３１．０００６３４
１ 中南大学研究生院隆平分院， 长沙， ４１０１２５； ２ 湖南杂交水稻研究中心杂交水稻国家重点实验室， 长沙， ４１０１２５ ＊ 通讯作者， ｘｉｎｑｉｌｉ＠１２６．ｃｏｍ
摘 要 本研究介绍一种多目的片段一步重组克隆的载体构建的新方法。该方法要求在 ＰＣＲ 引物设计时， 在第一个目的片段上游引物的 ５＇ 端和最后一个目的片段下游引物的 ５＇ 端各设置 １６ ｂｐ 与线性化目标载体 末端同源的序列，再在各目的片段之间的引物上各设计 ２５ ｂｐ 的重叠序列，以便进行融合 ＰＣＲ 将多片段扩 增成融合片段。此方法将融合片段与线性化骨架载体进行一步重组、转化和重组子鉴定。该方法只要求骨架 载体上有一个特异性酶切位点，特别适用于插入片段中含有较多限制性酶切位点的载体构建；该方法还可以 引入定点突变，可便捷构建分析启动子功能等需引入定点突变的载体；该构建方法还可以实现多基因的无缝 融合构建多顺反子，在构建原核基因表达载体、叶绿体表达载体、线粒体表达载体方面有着明显优势。本研 究以水稻胚乳特异性表达载体 ＰＧｔ１－ｍＧＦＰ－ｐＳＢ１３０ 为例，介绍此载体构建方法。 关键词 重组融合 ＰＣＲ， 载体构建， 定点突变， 原核表达载体
1.2 融合 PCR 产物与目的片段重组、转化
将融合 ＰＣＲ 产物 ＰＧｔ１－ｍＧＦＰ－Ｎｏｓ 和线性化载体 ｐＳＢ１３０ 按 ３．５ 所述条件进行重组反应，再将重组 产 物常规转化大肠杆菌（Ｔｏｐ１０），６ ８００ ｒ／ｍｉｎ 离心 １ ｍｉｎ， 弃 ８００ μＬ 上清，用枪头将菌液和剩余上清吸打混 匀，全部涂布于含 ５０ ｍｇ／ｍＬ 卡那霉素的固体 ＬＢ 平 板上，３７℃倒置培养 １６ ｈ 后，观察菌落（图 ３）。
将两个目的片段 ＰＧｔ１ 和 ｍＧＦＰ－Ｎｏｓ 的 ＰＣＲ 扩增 回收产物按 ３．４ 的条件进行融合 ＰＣＲ 扩增，并得到 如 ＰＧｔ１－ｍＧＦＰ－Ｎｏｓ 预计大小的片段，即泳道 ２ 中片段 大小为 ２ ８９６ ｂｐ （图 ２）。
图 ３ 重组菌落结果 Ｆｉｇｕｒｅ ３ Ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃｏｌｏｎｉｅｓ
本研究以水稻胚乳特异性荧光表 达 载 体 ＰＧｔ１－ ｍＧＦＰ－ｐＳＢ１３０ 为例，介绍一种结合同源重组（张宝中 等， ２００７）和融合 ＰＣＲ （Ｃｈａ－Ａｉｍ ｅｔ ａｌ．， ２０１２； Ｓｐｉｌｉｏｔｉｓ， ２０１２； Ｓｚｅｗｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ．， ２００７； 李敏和杨谦， ２００７）两种方 法的重组融合 ＰＣＲ 构建载体法，该方法可将多个目 的基因片段利用单个酶切位点通过一步克隆构建到 目的载体上。
载体构建是基因工程和分子生物学研究中常用 的基础技术之一，传统的载体构建方法在进行构建 多片段拼接的复杂载体时，需要精心选择酶切位点
并构建多个中间载体，操作比较麻烦，费时费力（林春 晶等， ２００８）。当目的基因中含较多常用酶切位点时， 不得不使用价格昂贵且酶切效率低的非常用限制性
基金项目：本研究由农业部转基因专项（２０１１ＺＸ０８００１－００４， ２００８ＺＸ０８００１－００１）资助
Abstract Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲ． Ｔｈｅ ｃｏｒｅ ｏｆ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉａｌ ｒｕｌｅｓ ｆｏｒ ｐｒｉｍｅｒ ｄｅｓｉｇｎ： １６ ｂｐ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ， ａｒｏｕｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｓｉｔｅｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｌｉｎｅａｒｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｖｅｃｔｏｒ， ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｂｅｆｏｒｅ ｔｈｅ ５＇ ｅｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｆ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｔａｒｇｅｔ ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｒ ｏｆ ｔｈｅ ｌａｓｔ ｔａｒｇｅｔ ｆｒａｇｍｅｎｔ． ２５ ｂｐ ｏｖｅｒ ｌａｐｐｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｃｌｏｓｉｎｇ ｔａｒｇｅｔ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｂｅｆｏｒｅ ｔｈｅ ５＇ ｅｎｄ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｐｒｉｍｅｒｓ． Ｗｉｔｈ ｔｈｉｓ ｓｐｅｃｉａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ， ｗｅ ｃａｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ａ ｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ｔｗｏ ｏｒ ｍｏｒｅ ｔａｒｇｅｔ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｏｎｅ ｓｔｅｐ ｃｌｏｎｉｎｇ． Ｗｉｔｈ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｏｎｌｙ ｏｎｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｗａｓ ｎｅｅｄｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｖｅｃｔｏｒ， ｉｔ＇ｓ ｅａｓｙ ｔｏ ｉｎｓｅｒｔ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍａｎｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｖｅｃｔｏｒ． Ｍｏｒｅｏｖｅｒ， ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｃａｎ ａｌｓｏ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｔｏ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ． Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ， ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｃａｎ ｆｕｓｉｏｎ ｓｅｖｅｒａｌ ｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｎｙ ｕｎｗａｎｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｗｏ ｔａｒｇｅｔ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ． Ｉｔ ｉｓ ａｐｐｒｏ－ ｐｒｉａｔｅ ｆｏｒ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ， ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ａｎｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎ－ ｓｔｒｕｃｔ． Ｒｉｃｅ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ， ＰＧｔ１－ｍＧＦＰ－ｐＳＢ１３０ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ａｒｔｉｃｌｅ ｔｏ ｓｈｏｗ ｔｈｅ ｄｅｔａｉｌ ｏｆ ｔｈｉｓ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ． Keywords Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ－ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲ， Ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ， Ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ， Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓ－ ｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ
隆到目的载体上，大量减少中间载体的构建，提高工 作效率和实验成功率。
2.2 可实现定点突变
定点突变技术在基因和蛋白质功能研究、生物 工程技术药物的研发以及基因克隆、载体构建等许多 领域具有广泛的应用，是分子生物学的一种常规实
图 ５ 定点突变试剂盒反应 Ｆｉｇｕｒｅ ５ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ
图 １ 目的片段 ＰＣＲ 扩增结果 注： Ｍ： Ｄ２０００ Ｍａｒｋｅｒ； １： ＰＣＲ 扩增 ＰＧｔ１ 片段 ２： ＰＣＲ 扩增 ｍＧＦＰ－ Ｎｏｓ 片段 Ｆｉｇｕｒｅ １ ＰＣＲ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｎｏｔｅ： Ｍ： Ｄ２０００ Ｍａｒｋｅｒ； １： ＰＣＲ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｆｒａｇｍｅｎｔ ＰＧｔ１； ２： ＰＣＲ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｍＧＦＰ－Ｎｏｓ
图 ２ 融合 ＰＣＲ 扩增结果 注： Ｍ： １ ｋｂ Ｌａｄｄｅｒ Ｍａｒｋｅｒ； １： 融合 ＰＣＲ 扩增 ＰＧｔ１－ｍＧＦＰ－Ｎｏｓ Ｆｉｇｕｒｅ ２ Ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲ Ｎｏｔｅ： Ｍ： １ ｋｂ Ｌａｄｄｅｒ Ｍａｒｋｅｒ； １： Ｆｒａｇｍｅｎｔ ＰＧｔ１－ｍＧＦＰ－Ｎｏｓ ｂｙ ｆｕ－ ｓｉｏｎ ＰＣＲ
一种载体构建的新方法：重组融合 ＰＣＲ 法 ６３５
Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｖｅｃｔｏｒ Ｍａｋｉｎｇ： Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲ
内切酶来构建载体，导致实验成功率大幅度降低。另 外，在进行特殊需求的载体构建时，传统的“酶 切— ——连接”方法还无法实现无缝融合构建。