分子荧光分析法

实验技术
一、样品的制备 二、测定条件的选择
A、激发波长和发射波长的选择 B、狭缝宽度的选择
三、反应条件的选择
A、溶液酸度的选择 B、显色剂的浓度 C、温度的影响
分子荧光分光光度法的应用
荧光分析法具有灵敏度高、选择性好，重现性好、方法 简捷以及取样量少等优点，使其越来越成为分析化学工作者 必需掌握的一种重要分析方法。另外仪器设备不复杂也是其 一大优点。
（b）、有机化合物的分析
医药卫生、环境保护、 农副产品质检等。
有机化合物的荧光分析是荧光分析法研究中最活跃、应用最广泛、 发展最有前途、涉及生命科学课题最多的分析法。
B、定量测定中的应用
分子荧光分析法可用于物质的常量、微量 以及痕量分析。
定量测定的依据：
定量分析常用的基本方法 1、标准对照法; 2、标准曲线法；
1. 打开荧光光度计和计算机，预热，对荧光光度计进行仪器初始化。 2. 选择测量参数。依次在不同的激发波长下扫描发射光谱，通过叠 加的谱图确定物质的荧光发射峰。最后确定最大发射波长值。 3. 在确定的最大发射波长下做激发光谱，测量物质的最大激发波长值。 4．记录四种物质的发射光谱和激发光谱，对它们 的荧光谱图进行比较分析。 5. 数据记录。
----苯环类物质的荧光光谱分析及定量测定
一、方法原理 二、分子荧光分光光度计 分子荧光分理
荧光的激发光谱和发射光谱
如果固定荧光的发射波长（即测定波长），而不断改变 激发光（即入射光）的波长，并记录相应的荧光强度，所得 到的荧光强度对激发波长的谱图称为荧光的激发光谱（简称 激发光谱）。
如果使激发光的波长和强度保持不变，而不断改变荧光的 测定波长（即发射波长）并记录相应的荧光强度，所得到的 荧光强度对发射波长的谱图则为荧光的发射光谱(简称发射光 谱)。
分子荧光分光光度法特点
1. 灵敏度高 一般紫外−可见分光光度法的灵敏度约为10−7 g/mL。而荧光法的灵敏 度可达到10−10 g/mL~10−12 g/mL。 2. 标准曲线的线性范围宽
苯环类物质的分子荧光光谱分析 及定量测定 实验目的：
1. 掌握分子荧光分光光度法的分析原理； 2. 熟悉分子荧光分光光度计的结构及特点，掌握其使用方法; 3. 掌握使用分子荧光光谱标准曲线法定量测定物质含量的方法; 4. 了解物质分子的组成、结构等对荧光光谱的影响。
实验步骤
一、荧光分析部分 A.定性分析：绘制苯酚、苯甲酸、硝基苯及苯溶液 的荧光光谱曲线
荧光分子法的应用主要集中在两个方面：
基于分子荧光光谱的定性分析以及基于荧光强度的定量分析
A、定性鉴定中的应用
（a）、无机化合物的分析
Ca2+ 、Mg2+、K+、Na+ 等 近70种元素进行灵敏测 定，也可分析氮化物、氰 化物、硫化物以及氧、臭 氧及过氧化物等。
无机化合物的荧光分析主要依赖于待测元素与有机试剂生成的具有 荧光特性的配合物的测定。
B. 定量测定：绘制标准苯酚溶液标准曲线，测量 苯酚待测样的浓度（定量的依据）
1. 分别取5 mL 、10mL、15 mL、20 mL标准苯酚水溶液于25比色管中， 定容。计算系列标准溶液的浓度，待用。 2. 将仪器软件界面选择到定量测定的状态下，根据A中测得的苯酚水溶液 的最大发射波长和最大激发波长，设定定量测定的参数。 3. 绘制标准曲线。 4．测量待测液浓度。在同样条件下，通过标准曲线得到待测样的浓度。 5. 数据保存。
问题讨论
1. 从分析方法的原理及仪器的简单构造、结构方面阐述分子荧光分析法。 的应用特点及范围； 2. 影响荧光定量分析准确性的因素有哪些？在分析过程中应该注意哪些 问题？ 3. 解释荧光分子的最大激发波长和最大发射波长的相互关系。 4. 结合本实验的目的和要求，请谈谈你对该实验的看法。
荧光分析法定量依据与方法：
荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率 ： If = Ia 由朗-比耳定律： Ia = I0(1-10- l c ) If = I0(1-10- l c ) = I0(1-e-2.3 l c ) 浓度很低时，将括号项近似处理后： If = 2.3 I0 l c = Kc
数据处理
1. 将苯、苯甲酸、硝基苯和苯酚的荧光发射光谱图绘制在一个坐标图中， 观察谱图并对它们图谱的不同进行分析和研究。了解取代基效应对分子 荧光光谱的影响 2. 以系列标准苯酚溶液的浓度为横坐标，以它们所对应的荧光强度为 纵坐标绘制工作曲线，再根据未知溶液的荧光强度，通过标准曲线 法得到待测样浓度。
3. 选择性比吸收光谱法好
4. 应用范围不如吸收光谱法广泛
荧光分光光度计 LS-55
荧光分光光度计 RF-5301PC
荧光分光光度计基本组成
测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品 池、双单色器系统、检测器。工作原理 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图： 单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色 器； 光源：灯和高压汞灯，染 料激光器(可见与紫外区) 检测器：光电倍增管。