第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试
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1、待检菌应是新鲜培养物。培养18~24h。 2、待检菌应是纯种培养物。 3、遵守观察反应的时间。观察结果的时间，
多为24或48小时。 4、应做必要的对照试验。 5、提高阳性检出率，至少挑取2~3待检的疑
似菌落分别进行试验。
二、糖醇ห้องสมุดไป่ตู้代谢试验
（一）糖醇类发酵试验 （二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验 （三）V-P试验 （四）甲基红（Methyl Red）试验 MR （五）七叶苷水解试验 （六）甘油品红试验
（１）奥梅拉法：
将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白 胨水培养基，于36±1 ℃培养48h， 每 1ml培养液加奥梅拉O’Meara试剂0.1ml， 摇动试管1~2min，静置于37℃恒温箱 4h ，或在48~50 ℃水浴放置2h后判定 结果。
（2）贝立脱法：
将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水 培养基，于36±1℃培养2天，每2ml培养液 先加入6%a-萘酚纯酒精溶液1ml，再加40% 氢氧化钾水溶液0.4ml，摇动2~5min，阳性 菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于 室温或36±1 ℃培养 4h ，如显现红色为阳 性，呈黄色或有类似铜色者，可判定为阴性。
3、结果观察与记录
（1）培养基变为黑色或棕黑色者，为 阳性，记录为 +
（2）培养基不变色者，为阴性，记录 为-
（六） 甘油品红试验
1、原理： 某些细菌可分解甘油成为丙酮酸，并进
一步脱羧生成乙醛，乙醛与无色品红 生成醌式化合物，呈深紫红色，以此 鉴别细菌。
2、试验方法：
取待检菌的新鲜纯培养物，接种 于甘油品红肉汤培养基中，于36±1 ℃培养8天,并用未接种的培养基在相 同条件下培养作为阴性对照，观察结 果。
2、试验方法：
用接种针或环移取纯培养物少许，接 种于糖发酵管中，若为半固体培养基， 则用接种针作穿刺接种。置36±1.0℃ 培养1~3天，每天观察结果。
3、结果观察和记录
记录： • 产酸不产气，阳性，以“+”表示 • 产酸产气，阳性，以“⊕”表示 • 不产酸产气，阴性，以“-”表示
气
泡
气
导
泡
管
（2）呈橘黄色或黄色为阴性， 记 MR -，迄至发现阴性并培养至第5 天仍为阴性，即可判定结果。
MR +
MR -
（五） 七叶苷水解试验
１、原理：七叶苷被细菌分解后， 生成葡萄糖和七叶素，七叶素与 Fe2+结合，生成黑色化合物，使 培养基呈黑色，以此鉴别细菌。
2、试验方法：
将待试纯培养物少许，接种于七 叶苷培养基，于36±1 ℃培养24h,观 察结果。
培养基变为黄色
阳性
阳性
阴性
培养基未变色、无气泡产
生
（二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验
1、原理：
细菌对葡萄糖的分解，分为氧化型和发 酵型。氧化型细菌在有氧的条件下才能 分解葡萄糖，无氧的条件下不能分解葡 萄糖；发酵型细菌在有氧无氧条件下均 可分解葡萄糖；不分解葡萄糖的细菌称 为产碱型。根据糖管的色泽变化可鉴别 细菌。
2、试验方法：
挑取新鲜的待试培养物少许，接 种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基， 于36±1 ℃或30 ℃（以30 ℃较好） 培养3~5天，从第48h起，每日取培养 液1ml，加入甲基红指示剂1~2滴，立 即观察结果。
MR-VP试验原理及照片
V-P
3、结果观察与记录
（1）呈鲜红色或橘红色为阳性，呈 淡红色为弱阳性，记MR +；
2、方法
• 取待检菌，以穿刺法接种于两管葡 萄糖半固体培养基上，在其中一管 加入一层（约1Cm）灭菌的液体石 蜡以隔绝空气，在37℃培养2~4h 天，每天观察结果。
3、结果观察与记录
封油管 发酵型 产酸（黄色）
未封油管 产酸（黄色）
氧化型 不产酸（绿色） 产酸（黄色）
产碱型 不产酸（绿色） 不产酸（绿色）
（三） V-P试验
1、原理：某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮 酸，丙酮酸经缩合、脱羧生成乙酰甲基甲 醇，后者在强碱环境下，被空气中的氧氧 化为双乙酰，在α-萘酚和肌酸的催化作用 下，双乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化 合物，称V－P（+）反应。
2、试验方法
（1）奥梅拉（O’Meara）法 （2）贝立脱（Barritt）氏法 （3）快速法
（四）甲基红试验（MR）
1、原理 细菌分解葡萄糖产生丙酮酸后， 由于代谢的途径不同，有的细菌可使丙 酮酸转化生成乳酸、琥珀酸、醋酸和甲 酸等大量酸性产物，使培养基PH值下降 至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红色， 为甲基红试验阳性 ；有的细菌使丙酮酸 脱羧后形成酮、醇类中性产物，培养液 pH＞5.4，甲基红指示剂呈桔黄色，为 甲基红试验阴性。
（3）快速法：
将0.5%肌酸溶液2滴放于小试管中， 挑取产酸反应的三糖铁琼脂斜面培养 物一接种环，乳化接种于其中，加入 5%α-萘酚3滴，40%氢氧化钠水溶液2 滴，振动后放置5min，判定结果。不 产酸的培养物不能使用。
3、结果观察与记录
（1）发酵管出现红色者，为阳性， 记 V-P +
（2）发酵管为黄色或铜绿色者，为阴 性，记 V-P -
第一节 细菌的生化试验
一、概述
（一）、什么是生化试验? 指通过利用生物化学的方法来测定
微生物的代谢产物、代谢方式和条件等 来鉴别细菌的类别、属种的试验。
（二） 检验细菌的生化试验范围
1、糖（醇）类代谢试验 2、氨基酸和蛋白质代谢试验 3、有机酸盐和铵盐的利用试验 4、呼吸酶类试验 5、毒性酶类试验
（三）生化试验的方法
1. 在培养物中加入某种底物与指示剂,经接 种、培养后,观察培养基的PH值变化。
2. 在培养物中加入试剂，观察它们同细菌 代谢产物所生成的颜色反应。
3. 根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。 4. 根据细菌对理化条件和药品的敏感性，
观察细菌的生长情况。
（四）生化试验的注意事项
（一） 糖醇类发酵试验
1.原理：不同的细菌对各种糖醇的分解能力及 所产生的代谢产物各不同，有的能分解多种 糖醇），有的只能分解1~2种糖醇 ，有的分 解糖醇能产酸产气，有的分解糖醇只产酸不 产气，根据这些特点，可鉴别细菌。
常用的糖醇
单糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠 李糖
双糖：乳糖、蔗糖、麦芽糖、蕈糖 三糖：棉子糖 多糖：菊糖、肝糖、淀粉 醇类：甘露醇、山梨醇、肌醇、卫茅醇
多为24或48小时。 4、应做必要的对照试验。 5、提高阳性检出率，至少挑取2~3待检的疑
似菌落分别进行试验。
二、糖醇ห้องสมุดไป่ตู้代谢试验
（一）糖醇类发酵试验 （二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验 （三）V-P试验 （四）甲基红（Methyl Red）试验 MR （五）七叶苷水解试验 （六）甘油品红试验
（１）奥梅拉法：
将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白 胨水培养基，于36±1 ℃培养48h， 每 1ml培养液加奥梅拉O’Meara试剂0.1ml， 摇动试管1~2min，静置于37℃恒温箱 4h ，或在48~50 ℃水浴放置2h后判定 结果。
（2）贝立脱法：
将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水 培养基，于36±1℃培养2天，每2ml培养液 先加入6%a-萘酚纯酒精溶液1ml，再加40% 氢氧化钾水溶液0.4ml，摇动2~5min，阳性 菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于 室温或36±1 ℃培养 4h ，如显现红色为阳 性，呈黄色或有类似铜色者，可判定为阴性。
3、结果观察与记录
（1）培养基变为黑色或棕黑色者，为 阳性，记录为 +
（2）培养基不变色者，为阴性，记录 为-
（六） 甘油品红试验
1、原理： 某些细菌可分解甘油成为丙酮酸，并进
一步脱羧生成乙醛，乙醛与无色品红 生成醌式化合物，呈深紫红色，以此 鉴别细菌。
2、试验方法：
取待检菌的新鲜纯培养物，接种 于甘油品红肉汤培养基中，于36±1 ℃培养8天,并用未接种的培养基在相 同条件下培养作为阴性对照，观察结 果。
2、试验方法：
用接种针或环移取纯培养物少许，接 种于糖发酵管中，若为半固体培养基， 则用接种针作穿刺接种。置36±1.0℃ 培养1~3天，每天观察结果。
3、结果观察和记录
记录： • 产酸不产气，阳性，以“+”表示 • 产酸产气，阳性，以“⊕”表示 • 不产酸产气，阴性，以“-”表示
气
泡
气
导
泡
管
（2）呈橘黄色或黄色为阴性， 记 MR -，迄至发现阴性并培养至第5 天仍为阴性，即可判定结果。
MR +
MR -
（五） 七叶苷水解试验
１、原理：七叶苷被细菌分解后， 生成葡萄糖和七叶素，七叶素与 Fe2+结合，生成黑色化合物，使 培养基呈黑色，以此鉴别细菌。
2、试验方法：
将待试纯培养物少许，接种于七 叶苷培养基，于36±1 ℃培养24h,观 察结果。
培养基变为黄色
阳性
阳性
阴性
培养基未变色、无气泡产
生
（二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验
1、原理：
细菌对葡萄糖的分解，分为氧化型和发 酵型。氧化型细菌在有氧的条件下才能 分解葡萄糖，无氧的条件下不能分解葡 萄糖；发酵型细菌在有氧无氧条件下均 可分解葡萄糖；不分解葡萄糖的细菌称 为产碱型。根据糖管的色泽变化可鉴别 细菌。
2、试验方法：
挑取新鲜的待试培养物少许，接 种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基， 于36±1 ℃或30 ℃（以30 ℃较好） 培养3~5天，从第48h起，每日取培养 液1ml，加入甲基红指示剂1~2滴，立 即观察结果。
MR-VP试验原理及照片
V-P
3、结果观察与记录
（1）呈鲜红色或橘红色为阳性，呈 淡红色为弱阳性，记MR +；
2、方法
• 取待检菌，以穿刺法接种于两管葡 萄糖半固体培养基上，在其中一管 加入一层（约1Cm）灭菌的液体石 蜡以隔绝空气，在37℃培养2~4h 天，每天观察结果。
3、结果观察与记录
封油管 发酵型 产酸（黄色）
未封油管 产酸（黄色）
氧化型 不产酸（绿色） 产酸（黄色）
产碱型 不产酸（绿色） 不产酸（绿色）
（三） V-P试验
1、原理：某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮 酸，丙酮酸经缩合、脱羧生成乙酰甲基甲 醇，后者在强碱环境下，被空气中的氧氧 化为双乙酰，在α-萘酚和肌酸的催化作用 下，双乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化 合物，称V－P（+）反应。
2、试验方法
（1）奥梅拉（O’Meara）法 （2）贝立脱（Barritt）氏法 （3）快速法
（四）甲基红试验（MR）
1、原理 细菌分解葡萄糖产生丙酮酸后， 由于代谢的途径不同，有的细菌可使丙 酮酸转化生成乳酸、琥珀酸、醋酸和甲 酸等大量酸性产物，使培养基PH值下降 至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红色， 为甲基红试验阳性 ；有的细菌使丙酮酸 脱羧后形成酮、醇类中性产物，培养液 pH＞5.4，甲基红指示剂呈桔黄色，为 甲基红试验阴性。
（3）快速法：
将0.5%肌酸溶液2滴放于小试管中， 挑取产酸反应的三糖铁琼脂斜面培养 物一接种环，乳化接种于其中，加入 5%α-萘酚3滴，40%氢氧化钠水溶液2 滴，振动后放置5min，判定结果。不 产酸的培养物不能使用。
3、结果观察与记录
（1）发酵管出现红色者，为阳性， 记 V-P +
（2）发酵管为黄色或铜绿色者，为阴 性，记 V-P -
第一节 细菌的生化试验
一、概述
（一）、什么是生化试验? 指通过利用生物化学的方法来测定
微生物的代谢产物、代谢方式和条件等 来鉴别细菌的类别、属种的试验。
（二） 检验细菌的生化试验范围
1、糖（醇）类代谢试验 2、氨基酸和蛋白质代谢试验 3、有机酸盐和铵盐的利用试验 4、呼吸酶类试验 5、毒性酶类试验
（三）生化试验的方法
1. 在培养物中加入某种底物与指示剂,经接 种、培养后,观察培养基的PH值变化。
2. 在培养物中加入试剂，观察它们同细菌 代谢产物所生成的颜色反应。
3. 根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。 4. 根据细菌对理化条件和药品的敏感性，
观察细菌的生长情况。
（四）生化试验的注意事项
（一） 糖醇类发酵试验
1.原理：不同的细菌对各种糖醇的分解能力及 所产生的代谢产物各不同，有的能分解多种 糖醇），有的只能分解1~2种糖醇 ，有的分 解糖醇能产酸产气，有的分解糖醇只产酸不 产气，根据这些特点，可鉴别细菌。
常用的糖醇
单糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠 李糖
双糖：乳糖、蔗糖、麦芽糖、蕈糖 三糖：棉子糖 多糖：菊糖、肝糖、淀粉 醇类：甘露醇、山梨醇、肌醇、卫茅醇