谷胱甘肽含量测定

植物生理学模块实验指导

李玲主编科

学出版社还原型谷胱甘肽含量的测定方法（分光光度计法）

【实验目的】

了解植物组中中抗坏血酸- 谷胱甘肽循环代谢过程，学习还原型谷胱甘肽含量的测定原理和方法。

【实验原理】

谷胱甘肽是有谷氨酸（Glu ）、半胱氨酸（Gly ）组成的天然三肽，是一种含巯基（一SH）的化合物，广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。谷胱甘肽能和5,5 '-二硫代-双- （2-硝基苯甲酸）（5,5 ' -dithiobis-2- nitrobenoic acid ，DTNB反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG。2-硝基-5-巯基苯甲酸为一黄色产物，在波长412nm处具有最大光吸

收。因此，利用分光光度计法可测定样品中谷胱甘肽的含量。

【器材与试剂】

1.实验仪器与用具

研钵、高速冷冻离心机、微量移液枪、离心管、试管、水浴锅、容量瓶

（100ml、200ml、1000ml）、分光光度计

2.实验试剂

50g/L三氯乙酸（TCA溶液（含5mmol/L N^-EDTA :称取5g三氯乙酸，用蒸馏水溶解稀释至100ml。再称取186mg Na-EDTA・ 2HO,加入到100ml

50g/L 三氯乙酸溶液中溶解。

0.1mol/L磷酸钠溶液缓冲液（pH7.7）:配制方法见附录。

0.1mol/L（pH6.8）磷酸钠缓冲液:配制方法见附录。

4mmol/L 二硫代硝基苯甲酸（5,5 ' -dithiobis-2-nitrobenoic acid ,

DTNB溶液：称取15.8mg DTNB用0.1mol/L、pH6.8磷酸缓冲液溶解，定容至10ml，混匀，4C保存。现用现配。

100卩mol/L还原型谷胱甘肽标准液：称取3.1mg还原型谷胱甘肽，加入少量无水乙醇溶解，加蒸馏水定容至100ml。

3.实验材料

同抗坏血酸。

【实验步骤】

1.标准曲线制作

取6支试管，编号，按照表1加入各种试剂，混匀，25C保温反应10min 以0号管为参比调零，测定显色液在412nm处的吸光度。以吸光度为纵坐标，还原型谷胱甘肽物质的量（卩mol ）为横坐标，绘制标准曲线。

项目试管号

0 1 2 3 4 5 100卩mol/L还原型谷胱甘肽标0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水/ml 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.1mol/L pH7.7 磷酸缓冲液/ml 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 4mmol/L DTNB试剂/ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 相当于还原型谷胱甘肽物质的量0

2.提取

取材后，称取2.5g样品置于研钵中，加入5ml经4C预冷的50g/L三氯乙酸溶液（含5mmol/L Na2-EDTA ,在冰浴条件下研磨成匀浆后，于4C、12000g 离心20min。收集上清液来测定谷胱甘肽含量，测量提取液体积。

3.测定

取1支试管，依次加入1ml蒸馏水、1ml O.1mol/L 磷酸缓冲液（pH7.7）和0.5ml

4mmol/L DTNB荣毅仁，混匀，即为绘制标准曲线的0号管液。以此溶液作为参比，在波长412nm处对分光光度计进行调零。

另取2支试管，分别加入1ml上清液、1ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.7）。向一支试管加入0.5ml 4mmol/L DTNB溶液，另一支试管中加入

0.5ml 0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH6.8），将两支试管置于25C保温10min。按照制作标准曲线的方法，迅速测定显色液在波长412 nm处的吸光度，分别记作OD 和OD。重复3次。

【计算结果】

显色反应后，分别记录样品管混合液的吸光度（OD）和空白对照管反应混

合液的吸光度（OD）。根据吸光度差值，从标准曲线上查出相应的还原型谷胱甘肽量，计算还原型谷胱甘肽含量（卩mol/g ）。

n X V

还原型谷胱甘肽含量（卩mol/g）=s>t m

式中，n为由标准曲线查的的溶液中还原型谷胱甘肽物质的量（卩mol）; V为样品提取液总体积（ml）; V S为吸取样品液体积（ml）; m为样品质量（g）。

【注意事项】

1.在提取样品时，需要沉淀出去蛋白质，以方志蛋白质中所含巯基及相关

酶对测定结果的影响

2.利用本方法还可以测定样品中总谷胱甘肽（GSSG+GSH和氧化型谷胱甘

肽（GSSG的含量。在谷胱甘肽还原酶（GR作用下，将GSSGS原成GSH再进行测定和计算。

3.建议在第一次测定时先做2或3个样品本底对照，如果样品中本底对照和空白对照非常接近，则说明样品液中不存在干扰物质，可以不再检测样品本底对照。

（学习的目的是增长知识，提高能力，相信一分耕耘一分收获，努力

就一定可以获得应有的回报）