142、病原微生物分子诊断基础

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2015年1月，奥巴马在国情咨文中宣布了一个预算为2.15 亿美元的精准医 学计划（Precision Medicine Initiative）。
循证医学(Evidence-based Medicine, EBM，1992) “慎重、准确和明智地应用目前可获取的最佳研究
证据，同时结合临床医师个人的专业技能和长期临床 经验，考虑患者的价值观和意愿，完美地将三者结合 在一起，制定出具体的治疗方案”。
转化医学（Translational Medicine,2003） 是指一类医学研究，能够很好地将基础研究与解决患者实
际问题结合起来，将基础研究的成果“转化”为实际患者 的疾病预防、诊断和治疗及预后评价。
其基本特征是多学科交叉合作，针对临床提出的问题，深 入开展基础研究，研究成果得到快速应用。实现从“实验 室到床边”的转化(bench to bedside translation)，又 从临床应用中提出新的问题回到实验室(bedside to bench)，为实验室研究提出新的研究思路
个体化医学（Personalized Medicine ，2011） 个体化医疗，是以每个患者的信息为基础决定治疗方针，
从基因组成或表达变化的差异把握治疗效果或毒副作用等 应答的个性，对每个患者进行最适宜药物疗法的治疗。
基因分析是个体化医疗的前提，基因测序技术的发展在驱 动着个体化医疗的进程。
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2011年，美国科学院、美国工程院、美国国立卫生研究院 及美国科学委员会共同发出“迈向精准医学”的倡议。
实现精准医学的基础是对疾病进行重新分类，要改变目前 沿用的以症状、部位、器官为要素命名疾病的传统方法。
• 精准医学 (Precision Medicine),
是指以个人基因组信息为基础,结合蛋白质组,代谢组 等相关内环境信息,为病人量身设计出最佳治疗方案,以期 达到治疗效果最大化和副作用最小化的一门定制医疗模式。
精准医疗的成功有赖于建立一个框架来调控、搜集和解释 生物技术时代涌入的大量信息，利用人类基因组学、蛋白 组学、信号传导学、细胞生物学、微生物学，结合环境及 临床数据，建立个体数据港，实施全球合作及数据共享， 在精准的疾病分类及诊断基础上，对有相同病因、共同发 病机制的病人亚群实现精准的评估、治疗和预防。
相较传统医疗,精准医学具有针对性、高效性及预防性等 特征,将开启医疗新时代。
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分子诊断：应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质 的结构或表达水平的变化而做出诊断的技术，称为分子 诊断。 基因诊断：又称DNA诊断或分子诊断，通过分子生物学 和分子遗传学的技术，直接检测出分子结构水平和表达 水平是否异常，从而对疾病做出判断。 分子生物学：从分子水平上研究生命现象物质基础的学 科。研究细胞成分的物理、化学的性质和变化以及这些 性质和变化与生命现象的关系，如遗传信息的传递，基 因的结构、复制、转录、翻译、表达调控和表达产物的 生理功能，以及细胞信号的转导等。
根据目的基因是否被放大分类
扩增法 杂交法
根据被测基因的核酸类型分类
DNA、RNA、DNA/RNA ( Southern印迹用于检测DNA；Northern印迹用于检测RNA； 斑点印迹或称斑点杂交，既可检测DNA也可检测RNA)
根据诊断目的或要求
定性诊断、定量诊断和半定量诊断，以及序列分析等
根据分子之间的作用形式
杂交、扩增、测序
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核酸化学研究发展简史
1868年， 分离出核酸（nucleic acid）。
1944年，揭示核酸生物学功能（DNA是遗传物质）。
1946年，Chargaff 法则 不 同 种 生 物 DNA 分 子 中 的 核 苷 酸 排 列 顺 序 不 同 (有种族特异性) 同种生物不同组织器官细胞中DNA分子的核苷酸 排列顺序相同 (无组织器官特异性) 某 一 特 定 生 物 ， 其 DNA 碱 基 组 成 恒 定 任 何 生 物 DNA碱基组成都符合 A=T， G=C， A+G=T+C
1953年， Watson和Crick 提出DNA结构的双螺旋模型； 建立半保留复制假说。(1962年获诺贝尔生理学奖 )
60年代 提出“中心法则”（ Crick ，1958）和 操纵子学说，并成功破译遗传密码
70年代 建立 DNA 重组技术。 80年代, 分子生物学、分子遗传学等突飞猛进发展
中心法则
PCR技术的诞生与发展
1985年 美国PE-cetus公司人类遗传研究 室的Kary mullis发明了PCR技术 1988年 美国PE-cetus公司推出世界上第 一台PCR热循环仪，从而使PCR反应自动化 1993年 Kary Mullis因发明PCR技术获得 诺贝尔化学奖 1995年 定量PCR仪诞生，使定量研究DNA 靶序列成为现实
（一）DNA的体外复制的步骤：
变性（denaturation） 退火（annealing） 延伸（extension）
（二）PCR基本组成：
模板DNA 引物 4种脱氧核糖核苷酸 DNA聚合酶 其他
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靶序列 靶序列
温度循环式的扩增技术
常规（conventional PCR） 实时PCR（real time PCR，RT-PCR）为主，
等温方式的扩增技术
核酸序列扩增法（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）
转录介导的扩增（Transcription-mediated amplification， TMA）
环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification， LAMP）
常规PCR：在扩增反应结束后对产物进行电泳或杂交等 方式的分析
常规PCR衍生方法
PCR结合限制性长度多态性分析（PCR-RFLP） CR结合特异性寡合苷酸探针斑点杂交（PCR-ASO） PCR结合变性梯度凝胶（PCR-DGGE） PCR结合的单链构象多态性（PCR-SSCP）
名称 简并引物扩增法
巢式PCR
多重PCR
反向PCR
单一特异引物PCR 单侧引物PCR 原位PCR 锚定PCR
主要用途 扩增未知基因片断 提高pcr敏感性、特异性，分 析突变 同时检测多个突变或病原 扩增已知序列两侧的未知序 列，致产物突变 扩增未知基因组DNA 通过已知序列扩增未知cDNA 研究基因表达 分析具备不同末端的序列
依赖于核酸序列的扩增技术（NASAB） 转录介导的扩增（TMA） 环介导等温扩增技术（LAMP） 链替代扩增技术（SDA） 滚环扩增技术（RCA）
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