142、病原微生物分子诊断基础
2024版微生物与病原微生物--ppt课件可编辑全文
（组织胞浆菌 吞噬细胞功能缺陷、特殊环境、某些种族、
球囊酵母菌 激素水平、性别
副球囊酵母菌 ）
机会感染
妊娠等生理改变、外伤、广谱抗生素、免疫
（假丝酵母菌） 缺陷、吸毒、内分泌疾病、导管介入、细胞
功能缺陷、血液病、皮质激素、巨噬细胞功
能缺陷、合并其它感染、辐射、器官移植
曲霉菌
中性粒细胞减少、慢性肉芽肿病、免疫抑制 剂、器官移植
常见真菌感染的危险因素
年龄：≥65岁或≤1岁
基础疾病：如恶性肿瘤、慢性肾炎、尿毒症、 血液病、糖尿病、重症肺炎、结缔组织病等
长期大量使用广谱抗生素
长期大量使用肾上腺皮质激素 器官移植
免疫抑制剂及细胞毒药 各种留置导管
营养不良 HIV患者
不同真菌感染的主要危险 因素
致病菌感染
地区性、细胞免疫缺陷、营养不良、老年、
外生 殖器
0
0
尿道
0
+
+
+
++
++
+~+
+
0
U
0
U
0
U
0
++ 0
++ ++ ++
++ ++ +
++ +
+
+
0
+
U
阴道
++
++
+
宫颈 内膜
0
0
+
++
+
病原微生物的分子鉴定和抗菌药物筛选研究
病原微生物的分子鉴定和抗菌药物筛选研究病原微生物是引起人类疾病最主要的原因之一。
对病原微生物进行准确的分子鉴定和抗菌药物筛选研究，是控制和治疗疾病的重要手段。
一、病原微生物的分子鉴定1. PCR技术PCR技术是一种快速、准确、敏感的分子生物学技术，可以在短时间内扩增并检测微量DNA分子。
在病原微生物的分子鉴定中，PCR技术被广泛应用。
例如，在分子鉴定病原性大肠杆菌方面，PCR技术可以针对特定的肠毒素基因进行扩增和检测，以确定大肠杆菌是否属于致病性菌株。
另外，PCR技术也可以用于其他病原微生物的快速检测和鉴定，如结核分枝杆菌、霍乱弧菌等。
2. DNA条形码DNA条形码是指将标准DNA序列设计为一个短、稳定的DNA分子，用于区分物种。
DNA条形码技术可以用于病原微生物的分子鉴定和物种鉴别。
例如，在分子鉴定麻疹病毒方面，DNA条形码技术可以针对病毒的H和N基因进行扩增和检测，以确定病毒的基因型和分布区域。
另外，DNA条形码技术也可以用于其他病原微生物的物种鉴别，如肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌等。
二、抗菌药物筛选研究1. 链霉素链霉素是一种广谱抗生素，可以有效抑制许多细菌的生长。
但是，由于链霉素对人体耳毒性和肝毒性较高，因此临床应用受到限制。
最近的研究发现，链霉素可以通过调节肠道微生物群落的平衡，对抗肠道感染和过敏反应。
这一发现为链霉素在临床上的应用提供了新的思路和方法。
2. 氨糖苷类抗生素氨糖苷类抗生素是一类广泛应用于病原微生物治疗的抗生素。
然而，由于氨糖苷类抗生素的毒副作用较大，而且细菌对氨糖苷类抗生素的耐药性也在不断增强，因此研究氨糖苷类抗生素的新用途和机制十分必要。
最近的研究发现，氨糖苷类抗生素可以通过诱导肠道微生物群落的多样性和稳定性，改善肥胖症和代谢性疾病等疾病的预后。
这一发现为氨糖苷类抗生素的广泛应用开辟了新的途径和空间。
三、总结病原微生物的分子鉴定和抗菌药物筛选研究是当今生命科学的前沿领域之一。
微生物检验基础知识点总结
微生物检验基础知识点总结微生物检验是临床诊断中的重要技术手段，通过对患者样本中的微生物进行分离、鉴定和药敏试验，可以确定感染性疾病的病原体及其对药物的敏感性，为临床治疗提供重要依据。
微生物检验涉及到许多基础知识点，下面将分别从微生物分类、微生物培养、微生物鉴定和药敏试验等方面来总结微生物检验的基础知识点。
一、微生物分类微生物是一种广泛分布于自然界中的生物体，包括细菌、真菌、病毒和原生动物等。
而在临床微生物检验中，最常见的微生物主要是细菌和真菌。
下面将分别介绍细菌和真菌的分类。
1. 细菌的分类细菌是一类单细胞生物，其形态多样，包括球菌、杆菌、螺旋菌等。
从生物学特性上可分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
（1）革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌直接在植物或培养基上形成蓝、紫色颗粒。
细胞壁是由聚糖和一种特殊的脂质组成。
革兰氏阳性菌包括葡萄球菌、链球菌等。
这类细菌能在治疗性的延续性用药下适度存活。
（2）革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌则是指革兰氏润湿的时候是红色的细菌，单层数细胞壁，比革兰氏阳性菌的致病能力更强，但是也更容易受到抗菌素或药物的影响。
这类细菌包括大肠杆菌、沙门氏菌等。
2. 真菌的分类真菌是一种含有真核细胞核的微生物，包括酵母菌和菌丝菌两类。
（1）酵母菌酵母菌是一种单细胞真菌，能在酵母天然的酵母营养生长，大部分为革兰氏染色阳性，不表现形成孢子的原始生长特性。
酵母菌包括念珠菌、假丝酵母等。
（2）菌丝菌菌丝菌是一类多细胞真菌，其细胞由菌丝组成，通常由菌落分离。
它们通常是真菌，因为它们在呼吸和生长条件下形成的真菌菌丝。
菌丝菌包括白色念珠菌、曲霉菌等。
二、微生物培养微生物培养是微生物检验中的重要环节，通过在适当的培养基上提供适当的温度、湿度、氧气和营养物质，使微生物在含有以上条件的环境中进行繁殖和生长。
1. 培养基的分类与特点培养基是一种含有适量营养成分的物质，用于微生物的生长和繁殖。
根据不同的需求和用途，培养基可分为富营养基、简单基、选择基和不同温度适应基等。
分子诊断技术在病原微生物检测中的应用
分子诊断技术在病原微生物检测中的应用微生物包括细菌、病毒、衣原体、支原体、立克次体、螺旋体、放线菌和真菌以及一些小型的原生生物等在内的一大类生物群体，它们个体微小、种类繁多、与人类关系密切，广泛用于食品、医药、工农业生产、环保等诸多领域。
从医疗领域的角度来看，通过积极做好对于病原微生物的科学检测，医疗人员可以依据检测结果有效实现对于疾病的诊疗工作，这对人民群众身体健康的保障具有良好的促进作用。
一、高通量测序高通量测序技术又称“下一代”测序技术，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。
高通量测序主要分为第二代边合成边测序、第三代单分子测序以及第四代纳米孔测序等三类。
在临床领域中该技术具有较为明显的技术应用优势。
对于结核病患者而言，由于结核杆菌痰涂片菌阳率低而痰培养耗时又长并且临床用药后影响检出，严重影响了结核的诊断和治疗，而高通量测序技术的应用可以实现结核的早期诊断，对于患者后续诊疗工作具有良好的促进作用。
与此同时研究表明，该技术的合理应用有利于帮助医疗卫生部门合理实现对于流行性疾病暴发的科学防控。
高通量测序技术的应用对于操作仪器设备和操作人员的专业能力与实践经验都具有较高的要求，相信在未来应用会越来越广泛。
二、核酸适配体技术核酸适配体是一段寡核苷酸序列（DNA或RNA）。
通常是利用体外筛选技术——指数富集的配体系统进化技术，从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段。
作为病原微生物检测过程中的重要技术。
核酸适配体技术在临床工作中的应用较为广泛。
核酸适配体技术主要通过技术手段对于样本中的蛋白、酶、以及小分子物质等寡核酸片段进行获取。
该技术的应用包括扩增、调节以及分离、结合以及洗脱等五个环节。
在此过程中，作为重要的组成环节之一，分离环节可以有效实现对于适配体靶分子的合理筛选。
鉴于适配体的亲和力较强且修饰难度偏低，因此，其可以在特定蛋白的适配体中进行大面积应用。
该技术在临床过程中展现出广阔的应用前景，在未来该技术有望取代抗体检测技术。
分子诊断技术在病原微生物检测中的应用进展
分子诊断技术在病原微生物检测中的应用进展崔玉娟【摘要】医学流行性和食源性病原微生物是影响人类公共卫生安全的主要因素之一,其检测和诊断技术是疾病预防和控制的关键环节,而传统病原微生物检测方法费时费力、灵敏度和准确度低且干扰因素多.近年来,一系列基于杂交、扩增和测序的新型分子诊断技术不断涌现,既缩短了检测周期,降低了检测成本,又极大提高了病原微生物检测和诊断的准确度和灵敏度,但还没有一种单一分子诊断技术可同时满足简便快速、高灵敏、高准确度、高通量和自动化等要求.各学科交叉、多方法联用等策略,有助于病原微生物检测技术向更加简便快速、高通量和自动化方向发展.【期刊名称】《天水师范学院学报》【年(卷),期】2017(037)005【总页数】6页(P24-29)【关键词】分子诊断技术;病原微生物;基因芯片;DNA传感器;数字PCR;核酸适配体【作者】崔玉娟【作者单位】北京市延庆区疾病预防控制中心,北京 102100【正文语种】中文【中图分类】R372医学流行性和食源性病原微生物，包括原生生物、病毒和细菌等，其种类繁多且变异迅速，近年来已构成了严重的公共卫生安全隐患，给人类健康和财产安全造成了巨大威胁和损失。
针对病原微生物的快速检测技术，不仅是其有效防控的前提，也是科学用药的基础。
[1]然而传统微生物检测和鉴定方法主要依赖于病原微生物分离、培养和形态学观察、生理生化特征和血清免疫学反应等，[2]这些方法均存在诸多局限性，如微生物培养费时费力，仅能检测活菌总数；易受环境因素影响及部分病原微生物难或不可培养等；[3]大量严重耐药性菌株以及新病原微生物的不断出现等，已成为科研人员亟待解决的问题。
目前国内外病原微生物检测技术正逐渐向分子诊断、代谢组学、指纹图谱、DNA 传感器及仪器自动化等方向发展。
其中分子诊断技术是利用分子生物学方法对病原微生物核酸进行检测，不仅有效弥补了传统方法的不足，还可为研究人员提供病原微生物的耐药基因，甚至同源性分析等。
分子诊断学概论
分子诊断学概论一、分子诊断的基本概念与历史发展二、分子诊断的现状三、分子诊断的主要技术四、分子诊断的标准化与质量控制五、分子诊断的未来趋势分子诊断基本概念◆1953年，Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构模型，为揭开人类生命现象的本质奠定了基础，标志着分子生物学的开端，也使得对疾病发病机制的认识从整体、细胞水平逐渐深入到分子水平◆分子诊断学（Molecular diagnostics），是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法，研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的预防、诊断、治疗和转归提供信息和依据的一门学科◆通常所称的基因诊断，指针对DNA或RNA的分子诊断技术临床检验诊断体外诊断（IVD ）报告，影响约70%临床决策影像学诊断临床诊断疾病的检验诊断核磁共振辅助检验B 超CT体格检查病史临床检验诊断（实验室检验诊断）临床体液、血液检验临床化学检验临床免疫、血清学检验临床微生物学检验（细菌室）临床细胞分子遗传学检验CT （computed tomography ，电子计算机断层扫描）临床检验诊断发展阶段发展阶段历史时期技术类型典型特征简单划分第一代早期细胞形态学检验诊断•以疾病的表型改变为依据•非特异、滞后•难以早期诊断传统的临床检验诊断学学科第二代1950年代生物化学检验诊断第三代1960年代免疫学检验诊断第四代1970年代末基因检验诊断 (分子生物学检验诊断)•以疾病基因为探测对象•特异、敏感•早期诊断、预测新型的临床检验诊断学学科分子诊断（临床分子生物学检验诊断）分子生物学医学检验（临床检验诊断）分子生物学（molecular biology）1953年Watson&Crick发现DNA双螺旋结构模型70年代以来，成为生命科学最具活力的学科前沿分子医学（molecular medicine）、基因诊断（genetic diagnosis）分子生物学理论和技术方法被应用于临床分子生物学与医学的交叉和渗透国际首例基因诊断1970年代末美籍华裔简悦威（Yuet Wai Kan）分子杂交技术，α地中海贫血、镰状红细胞贫血我国基因诊断里程碑1984年，上海市儿童医院曾溢滔点杂交技术，α地中海贫血，发表在《Lancet》•以基因突变位点 (导致单基因遗传病) 为靶标第一代•核心技术：DNA或RNA分子杂交技术•以基因组特异性核酸序列 (DNA、RNA) 为靶标第二代•核心技术：Sanger测序技术、PCR技术•以基因组特异性核酸序列、蛋白质分子为靶标第三代•核心技术：生物芯片技术(高通量)•以基因组特异性核酸序列、蛋白质分子、代谢物为靶标第四代•核心技术：新一代测序技术、质谱技术分子诊断生物标志物◆核酸序列信息•个体差异基因：微卫星、SNP、mtDNA等•病原体基因组：病毒、细菌、真菌等•基因转录水平：mRNA、microRNA、lncRNA、circRNA、cfRNA等◆核酸序列变化•染色体变异：T21、T18、T13、CNV等•基因突变：点突变、插入/缺失突变、倒位突变、重复突变等◆核酸修饰•DNA甲基化•RNA甲基化◆蛋白质表达水平、修饰◆代谢产物、多糖链和脂质分子分子诊断学任务、特点、辨别◆任务•利用基础医学和生命科学的理论和方法，研究疾病发生和发展的分子机制•确定在疾病过程中特异的分子标志物•建立分子标志物的临床检验方法和评价体系•建立分子生物学检验的质量控制◆特点•主要是直接以疾病基因为探查对象，属于病因学诊断•对基因的检测结果不仅具有描述性，更具有准确性•可准确诊断疾病的基因型变异、基因表型异常以及由外源性基因侵入引起的疾病◆辨别•临床分子生物学检验技术=临床分子诊断技术•分子诊断VS基因诊断•分子诊断学包括：核酸诊断（DNA/RNA）、蛋白质检测诊断等分子诊断学概论一、分子诊断的基本概念与历史发展二、分子诊断的现状三、分子诊断的主要技术四、分子诊断的标准化与质量控制五、分子诊断的未来趋势医疗机构临床检验项目（2013版）临床体液、血液专业临床化学检验专业临床免疫、血清学专业临床微生物学专业临床细胞分子遗传学专业哪些专业含有基因诊断项目？临床免疫、血清学专业（摘录）序号项目名称1甲型肝炎病毒(HAV)RNA检测2乙型肝炎病毒(HBV)DNA测定3乙型肝炎病毒(HBV) YMDD变异检测4乙型肝炎病毒(HBV)前核心变异检测5乙型肝炎病毒(HBV)核心变异检测6乙型肝炎病毒(HBV)基因分型测定7丙型肝炎病毒(HCV)RNA测定8丙型肝炎病毒(HCV)分型9丁型肝炎病毒(HDV)RNA测定10庚型肝炎病毒核糖核酸定性(HGV-RNA)测定11戊型肝炎病毒(HEV)RNA测定12弓形体核酸测定13风疹病毒RNA测定14巨细胞病毒(CMV)DNA测定15水痘—带状疱疹病毒核酸测定16人乳头瘤病毒(HPV)基因检测17呼吸道合胞病毒核酸测定18流行性出血热病毒核酸测定19EB病毒核酸测定20副流感病毒核酸测定21人轮状病毒核酸测定22狂犬病毒核酸测定23乙型脑炎病毒核酸测定序号项目名称26柯萨奇病毒核酸测定27森林脑炎病毒(TBE)核酸测定28甲型流感病毒核酸测定29乙型流感病毒核酸测定30SARS冠状病毒核酸测定31BK病毒核酸测定32禽流感病毒核酸测定33埃可病毒核酸测定34西尼罗河病毒核酸测定35斑疹伤寒杆菌核酸测定36布氏杆菌核酸测定37结核分枝杆菌核酸测定38脑膜炎奈瑟菌核酸测定39幽门螺杆菌核酸测定40淋球菌核酸测定41嗜肺军团菌核酸测定42肺炎支原体核酸测定43生殖道支原体核酸测定44解脲脲原体核酸测定45肺炎衣原体核酸测定46鹦鹉热衣原体核酸测定47沙眼衣原体核酸测定48立克次体核酸测定临床细胞分子遗传学专业（摘录）序号项目名称备注1利用Southern blot分子杂交技术的白血病融合基因检查包括血友病A、血友病B、血菅性血友病、其它凝血因子缺陷症基因分析2利用Southern blot分子杂交技术的白血病融合基因检查1、 Ph染色体的分子杂交检查2、 RARA基因的分子杂交检查3、 AML1基因的分子杂交检查4、 E2A基因的分子杂交检查5、 MLL基因的分子杂交检查3利用RT-PCR或real time PCR技术的白血病融合基因检查1、Bcr-abl融合基因检查2、 AML1－EVI1融合基因检查3、 PML-RARA融合基因检查4、 DEK－CAN融合基因检查5、 AML1-MTG8融合基因检查6、 E2A－PBX1融合基因检查4单基因遗传病基因突变检查包括:1、进行性肌营养不良基因突变检查2、遗传性舞蹈病的基因突变检查3、其它5遗传性凝血因子缺陷症基因突变包括：1、血友病A的基因突变检查2、血友病B的基因突变检查3、混合型血友病的基因突变检查6α地中海贫血的基因突变检查7β地中海贫血的基因突变检查8苯丙酮尿症的基因突变检查9HLA低分辨基因分型检查10HLA高分辨基因分型检查序号项目名称备注12SRY的基因检查13P53基因的基因突变检查14K-Ras基因的基因突变检查15视网膜母细胞瘤RB1基因的基因突变检查16家族性乳腺癌基因的基因突变检查包括：1、BRCA1基因的基因突变检查2、BRCA2基因的基因突变检查3、其它17多发性内分泌腺瘤RET基因的基因突变的检查18遗传性非息肉性大肠癌的基因突变检查1、hMLH1基因的基因突变检查2、hMSH2基因的基因突变检查3、PMS1基因的基因突变检查4、PMS2基因的基因突变检查19遗传性大肠癌微卫星不稳定性(MSI)的基因检测20大肠癌易感基因的基因检测1、APC基因的基因检测2、DCC基因的基因检测21用于病毒、细菌用药指导的基因检测1、拉米夫定用药指导的基因检测2、结核病用药指导的基因检测3、肠球菌耐万古霉素用药指导的基因检测22用于化学药物用药指导的基因检测1、硝酸甘油用药指导的基因检测2、5-氟尿嘧啶用药指导的基因检测P450家族代谢酶基因的基包括CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、全国医疗服务项目技术规范（2023年版）◆检验+病理诊断项目合计1818项，增加了近60%，成为了11个大类中新增比例最高的板块实验室自建检测项目 (LDT)2022年12月《国家药监局综合司国家卫生健康委办公厅关于开展医疗机构自行研制使用体外诊断试剂试点工作的通知》，试点医疗机构包括：北京协和医院、北京医院、中日友好医院、中肿、阜外医院、北大一院等6家医院LDT（Laboratory developed test，实验室自建检测项目）感染领域：临床病原体检测方法微生物学检测：病原体培养/涂片病原体颗粒检测免疫学检测：检测血清学标志Ag、Ab分子诊断：检测DNA/RNA•耗时长•阳性率低•难培养•简便、快速•适于大规模筛查•可定性/定量检测•存在“窗口期”问题•不能早期诊断•灵敏度较低•快速、高通量•灵敏、特异•早期（缩短窗口期）•可分型•检测病原体突变•检测耐药基因•治疗监测病原体分子诊断检测病原体是否存在病原体分型（包括亚型）耐药基因检测相关的人类基因多态性检测标本类型外周血有核细胞血清血浆组织器官体液分泌物排泄物适宜分子诊断病原体类型难培养的如CT 、MG 、病毒培养较慢的如TB镜检容易弄错的如NG 、阴道毛滴虫免疫交叉反应较多的如CT 需要分型的如HPV 、HSV胞内病原体如衣原体、支原体、病毒CT （Chlamydia trachomatis ，沙眼衣原体）MG （Mycoplasma genitalium ，生殖支原体）TB （Mycobacterium tuberculosis ，结核分枝杆菌）NG （Neisseria Gonorrhoeae ，淋病奈瑟菌）HPV （human papillomavirus ，人乳头瘤病毒）遗传领域：镰状红细胞贫血症◆红血球不正常带来严重后果，问题在于血红蛋白ß链一个谷氨酸残基变成了缬氨酸残基◆常染色体隐性遗传病•基因点突变•Mst II 限制性内切酶位点改变•RFLP技术：酶切+电泳胚胎着床前分子诊断◆取1-2个囊胚期细胞进行基因诊断，从而将人类的遗传缺陷控制在最早期阶段无创产前诊断（NIPT ）19972008卢煜明发现母体外周血中存在胎儿游离DNA高通量测序分析胎儿游离DNA 用于唐氏综合征筛查2009中国开始NIPT 临床试验2011中国、美国开始NIPT 临床服务2012美国妇产科协会推荐高危人群进行NIPT 201520172016中国无创单病开始临床应用卫计委推出NIPT 临床应用指南美国多种单基因疾病NIPT 临床服务2022美国妇产科协会推荐全人群进行NIPT国家药监局发布NIPT 注册指南◆胎儿游离DNA ◆高通量测序肿瘤领域：肿瘤靶向治疗◆高通量测序为主循环肿瘤DNA（ctDNA）年份事件1948血中游离DNA的发现1965肿瘤与血中游离DNA的相关性1966-1973系统性红斑狼疮等疾病患者血中游离DNA水平增高1977血中游离DNA水平与肿瘤病程及疗效相关1989发现血中游离DNA与原发肿瘤突变相似1994-1999更多证据表明血中游离DNA与原发肿瘤基因突变的一致性1997孕妇血中胎儿DNA的发现1998移植器官核酸可称为游离核酸成分的发现2000-2010游离DNA与多种疾病的诊断和预后相关2010游离DNA致癌性的确定ctDNADNA文库构建捕获扩增DNA&质控富集效率高通量测序和数据分析个体化用药领域：药物基因组药物作用靶点相关基因药物代谢相关基因药物副作用相关基因药物相关基因◆P53：50%以上人类肿瘤会发生p53基因突变◆BRCA1和BRCA2：乳腺癌易感基因1和2◆EGFR：表皮生长因子受体，细胞增殖和信号传导功能◆细胞色素P450超家族：人体内最大的药物代谢系统分子诊断学概论一、分子诊断的基本概念与历史发展二、分子诊断的现状三、分子诊断的主要技术四、分子诊断的标准化与质量控制五、分子诊断的未来趋势DNA->RNA->蛋白质->代谢产物◆基因(产物) 修饰•甲基化•乙酰化•磷酸化◆代谢及代谢调控分子诊断主要技术1. 分子杂交技术•遗传性疾病的基因诊断2. PCR技术•感染性疾病的基因诊断3. 生物芯片技术•复杂性疾病的基因诊断4. 基因测序技术•复杂性疾病的基因诊断5. 质谱技术•核酸质谱、蛋白质组学6. 人工智能辅助•AI辅助的分子诊断（AI+）1. 分子杂交技术杂交类型检测目的及范围Southern印迹杂交经凝胶电泳分离且转移至膜上，DNA分子Northern印迹杂交经凝胶电泳分离且转移至膜上，RNA分子菌落杂交固定在膜上，经裂解从细菌释放，DNA分子斑点杂交固定在膜上，DNA或RNA分子原位杂交（FISH）细胞或组织中，DNA或RNA分子液相分子杂交在溶液中，DNA或RNA分子，引入磁珠2. PCR技术◆痕量核酸模板体外扩增，提高了检测灵敏度和反应特异性•1971年，Korana提出核酸体外扩增的设想•1985年，Mullis发明聚合酶链反应，Klenow片段•1988年，Keohanog，T4DNA聚合酶•1988年，Saiki，TaqDNA聚合酶•1993年，Mullis因聚合酶链反应技术获得诺贝尔奖荧光定量PCR 技术◆也称为real-time PCR ，实现了核酸的实时定量检测◆Log 浓度与循环数呈线性关系，根据达到阈值的循环数计算样品所含模板量•荧光染料：SYBR green•荧光探针：Taqman 、molecular beacon 、复合探针•举例：新冠病毒检测荧光强度---循环数曲线初始模板量对数---Ct 循环数标准曲线10410310610510210数字PCR技术◆dPCR，又称为单分子PCR，近年来迅速发展起来的绝对定量PCR技术◆不依赖于扩增曲线的循环阈值进行定量，不受扩增效率的影响，也不必采用看家基因和标准曲线，具有很好的准确度和重现性，可以实现绝对定量分析3. 生物芯片技术◆广义指在微小空间中能够高通量处理或分析生物相关物质的集成式技术◆狭义指微阵列芯片技术，将大量基因探针／基因片段／蛋白／多肽，按特定的排列方式固定在支持物表面上，实现高通量处理或分析功能•固相芯片（玻片、硅片、塑料等）、液相芯片（微珠）•特点：高通量、微型化、自动化微流控芯片技术◆Microfluidics 技术，指的是使用微管道（尺寸为数十到数百微米）处理或操纵微小流体（体积为微升到纳升）的系统所涉及的科学和技术，是一门涉及化学、流体物理、微电子、新材料、生物学和生物医学工程的新兴交叉学科◆也被称为芯片实验室（lab on a chip ）和微全分析系统（micro-total analytical system ），具有微型化、集成化等特征优势集成小型化与自动化样本量需求少试剂消耗少高通量污染少不足缺规范与标准技术难度不低生产成本较高开发周期较长4. 基因测序技术◆核酸测序技术，是分子诊断中基因序列确定的金标准ABI Prism310 1986年Roche 4542005年Illumina GA2006年ABI SOLiD2007年Helicos HeliScope2008年PacBio RS2010年ONT MinION2013年第一代（Sanger）第二代（NGS）第三代第四代或合称第三代（TGS）Sanger测序和NGS测序双脱氧末端终止法可逆终止、边合成边测序法单分子测序技术◆SMRT单分子实时合成测序技术，零模波导孔，荧光◆纳米孔单分子测序技术，纳米孔，电信号5. 质谱技术质量分析器离子源检测器多肽离子化 真空环境获得质谱图进样系统引入样品根据荷质比分离离子 检测记录离子信号计算机数据处理系统◆离子源•电子电离•快原子轰击离子化（FAB)•电喷雾离子化（ESI ）•基质辅助激光解析离子化（MALDI)◆质量分析器•四极杆质谱（直流电极+射频电极，共4组）•飞行时间质谱（TOF)•离子阱质谱◆离子源与质量分析器组合•MAIDL-TOF-MS （基质辅助激光解析电离飞行时间质谱）•ESI-四极杆MS •ESI-串联MS6. AI辅助分子诊断◆AI+自动化流水线（包含分子诊断）•打通从标本到检验到临床的数据通路•及时准确地将“标本信息”转化为“检验数据”•再将“检验数据”转化为“临床诊疗信息”•大幅提高实验室咨询服务能力•医学检验工作向着更精准、高效的方向发展分子诊断学概论一、分子诊断的基本概念与历史发展二、分子诊断的现状三、分子诊断的主要技术四、分子诊断的标准化与质量控制五、分子诊断的未来趋势临床分子诊断方法性能评价◆定量检测方法和程序的分析性能验证内容，至少应包括准确度、精密度、可报告范围等◆定性检测项目验证内容，至少应包括检出限及符合率等，验证结果应经过授权人审核分子诊断存在的问题及原因◆假阳性问题◆假阴性问题◆重复性问题•同一实验室不同批次间重复测定，结果存在差异•不同实验室对同一标本检测，结果存在差异◆检测对象的多态性◆标本采集◆诊断试剂方法•准确性•特异性•检测限•检测范围•重复性•稳定性◆微量反应体系◆测定操作 (人员素质)◆仪器设备的维护校准 (定期)◆数据处理及结果报告个体差异样本量差异检测平台差异样本采集差异样本保存、运输差异分子诊断技术监管◆申请获批医疗器械证，有严格的管理•项目报批：卫健委批准•实验室：通过验收，定期校验仪器与器材•试剂：国家食品药品监督管理局（NMPA）批准•工作人员：经过培训，持证上岗•质量控制：室内质量控制（IQC），室间质量评价（ EQA）◆LDT？国内正在摸索监管➢推荐“微专业-体外诊断与大数据分析”，《体外诊断产品注册与监管》，由项光新、李伟、连国军等老师授课国家如何监管医疗器械NMPA产品上市许可制度企业医疗器械生产企业许可国家机构法规生产质量管理规范规范性文件法律规章法规不良事件检测和报告医疗器械召回稽查局、法规司省和县级药监器械司、注册司质量监督机构技术审评机构分子诊断学概论一、分子诊断的基本概念与历史发展二、分子诊断的现状三、分子诊断的主要技术四、分子诊断的标准化与质量控制五、分子诊断的未来趋势将成为本世纪检验医学的主导技术◆应用面更广：扩展到复杂性疾病，检测未知病原体◆使用更便捷：自动化、智能化、普及化◆诊断更准确：致病根源、致病机制，定性->定量◆诊断更早期：早发现、早治疗，诊已病->诊未病•病原体的确认和定量、分型、耐药性检测1. 感染性疾病分子诊断•对遗传病进行确诊、分型和早期诊断2. 遗传病分子诊断•肿瘤的早期诊断、分型和伴随诊断3. 肿瘤分子诊断•药物基因组学、用药指导4. 个体化用药指导•公共卫生、器官移植、个体识别、基因治疗5. 其他领域美国《2030年全球趋势》未来分子诊断学的准确性将促使医疗体系变革基因检测方法将加速疾病诊断，同时帮助医师确定个性化最佳治疗方案感染领域：病原体检测⚫国内总体：年均非新冠的标本量约为1亿例⚫常规感染样本量：约为9000万例/年⚫危重感染样本量：约为1000万例/年，多数病原不明WHO 公布2019年全球十大健康威胁，与感染密切相关有6个：流感、耐药、埃博拉、登革热、艾滋病、疫苗犹豫临床宏基因组测序遗传领域：人类基因组临床应用Collins, FS & McKusick VA. Implications of the Human Genome Project for medical science. JAMA, 2001, 285: 540-554.单基因病无创产前筛查◆利用母体外周血中的胎儿游离DNA 的进行分子生物学检验，开展无创性性产前诊断，取代羊膜穿刺或采集绒毛进行无创性产前诊断方法8000病种多1%发病率高20%致死率高治疗方式少1%努南综合征1:2500 -1:1000Rett综合征（女性）1:23000 -1:10000Kabuki 综合征1:32000致死性骨发育不良1:10000-1:5000CHARGE 综合征1:15000 -1:8500软骨发育不全1:10000结节性硬化1:5,800马凡综合征1:10000 -1:5000单基因病占总出生缺陷的22.2%（染色体10%）复杂性疾病诊断。
简述病原微生物诊断技术
简述病原微生物诊断技术
病原微生物诊断技术是医学领域中一项重要的技术，它对于诊断和治疗传染病都起着至关重要的作用。
目前，病原微生物诊断技术主要包括以下几种:
1. 培养技术：培养技术是病原微生物诊断中最常用的方法之一。
它需要将患者的样本接种到培养基中，然后在适当的条件下培养细菌或病毒。
通过培养技术，可以确定样本中是否存在病原微生物，并可对其进行进一步的分类和鉴定。
2. 核酸检测技术：核酸检测技术是通过提取患者样本中的核酸，并使用特定的试剂盒进行核酸检测，以确定样本中是否存在病原体。
核酸检测技术通常能够快速检测出病原体，尤其是在患者症状出现后的早期。
3. 抗原检测技术：抗原检测技术是通过检测患者样本中的病原体抗原来确定是否存在病原体。
抗原检测技术通常具有较高的灵敏度和特异性，可以在患者症状出现后的早期进行诊断。
4. 抗体检测技术：抗体检测技术是通过检测患者样本中的病原体抗体来确定是否存在病原体。
抗体检测技术通常具有较高的准确性，可用于回顾性诊断。
除了上述技术外，还有一些新兴的病原微生物诊断技术，如质谱检测技术、宏基因组测序技术等。
这些技术具有较高的灵敏度和特异性，可以快速准确地诊断病原体，为临床实践提供了更为可靠的依据。
病原微生物诊断技术的不断发展和完善对于诊断和治疗传染病都具有重要意义。
随着科技的不断进步，我们相信会有更多的新技术和方法应用于病原微生物诊断中，从而更好地服务于临床实践。
微生物检验技术基础知识
由标准储备菌株以传代得到的培养物
标准储备菌株、工作菌株都应进行纯度和特性确认
A
D
B
C
工作菌株的传代次数不得超过5代（从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代）
“1代”是指将活的培养物接种到微生物生长的新鲜培养基中培养。
实验室必须建立和保存其所有菌种的进出、收集、贮藏、保存、确认试验及销毁的记录。
注意：
三、菌种
冻干粉（图P63）
22%
甘油冻存管（图P64）
40%
标准菌株：
三、菌种
CMCC 中国医学微生物菌种保藏管理中心 GIMCC 广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心 ATCC 美国典型菌种保藏中心
例： CMCC （B） 26003
菌种保藏机构 细菌 菌种编号（金黄葡萄球菌）
单击此处添加副标题内容
谢谢大家！
B
绿脓菌素：阳性
D
铜绿假单胞菌 CMCC (B) 10104
A
革兰氏染色：阴性，杆菌；
E
三、菌种
白色念珠菌 CMCC (B) 98001
沙氏葡萄糖琼脂平板上划线分纯，典型菌落乳白色，表面光滑有浓酵母气味。
革兰氏染色：阳性，菌体大，球菌。
芽管试验：阳性
三、菌种
三、菌种
3、菌种的保藏 A：甘油冷冻管保藏法 保藏温度：－30℃～80℃； 保藏菌种有效期：1～2年 优点：保存期较长，反复传代导致菌种变异的风险较小； 缺点：操作相对复杂，成本较高。 B：斜面低温保藏法 保藏温度4℃左右，保藏时间1～3个月，但铜绿假单胞菌不宜用本法保存。 优点：操作简便，成本低，比较容易掌握； 缺点：保存期比较短，反复传代有引起变异的可能。。
2
采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌（10～100cfu）应加在最后一次冲洗液中，依法操作。
微生物学中的病原体诊断方法
微生物学中的病原体诊断方法疾病的传播离不开病原体的介入，病原体的诊断是制定合理疗法和控制疾病的基础。
随着微生物学技术的不断发展，病原体的诊断方法也在不断更新迭代。
本文将详细介绍微生物学中的病原体诊断方法。
细菌学诊断细菌学诊断是病原体诊断中最常见的方法之一。
它主要通过细菌的形态、生化反应、基因序列等来确定细菌的种类和数量。
细菌学诊断主要包括直接检测和培养检测两种方法。
直接检测主要是指通过检测质、量变化、种类变化、形态变化等来确定细菌的存在，并通过显微镜观察细菌形态、结构、染色等性状。
常见的直接检测方法包括涂片法、染色法、免疫荧光法等。
培养检测是指将患者的样本培养在含有丰富营养物质的培养基上，利用细菌的代谢活动来产生一系列生化反应，通过这些反应来鉴定细菌种类。
培养检测主要包括常规培养法、快速培养法、分子诊断法等。
为了检测出微生物中的细菌，人们往往采取分离纯化的方法，即将患者样本中存在的各种微生物分离出来，让它单独生长，在易于鉴定的状态下进行鉴定。
真菌学诊断真菌学诊断是病原体诊断方法中的重要一环，主要用于真菌感染的检测。
真菌学诊断方法同样包括直接检测和培养检测两种方法。
直接检测包括光学显微学、木糖酶反应等。
光学显微学通常采用荧光染色技术对真菌进行染色，以便于观察和区分。
木糖酶反应则通过对真菌进行生化反应来鉴别真菌的种类。
培养检测方面，包括常规培养法和快速培养法。
常规培养法是指将真菌样本通过一定时间的培养获得足够的数量，进而进行鉴定；快速培养法则通过模拟真菌在体内的生长条件，使其以尽可能快的速度进行培养生长，并通过这些生长条件来进行鉴定。
病毒学诊断病毒学诊断主要是通过检测病毒抗原、病毒核酸来确定病毒的存在，并定量病毒的数量。
常见的病毒学诊断方法包括PCR、ELISA、免疫荧光法等。
PCR是一种高灵敏度、高特异性的检测方法，可检测极低浓度的病毒核酸。
该方法通过特定的引物和酶来扩增病毒核酸的复制数，从而判断病毒的存在。
病原微生物的分子识别与免疫应答机制
病原微生物的分子识别与免疫应答机制近年来，病原微生物致病机理的研究越来越受到关注。
病原微生物的分子识别与免疫应答机制是疾病防治的关键。
在本文中，我们将对病原微生物的分子识别和免疫应答机制进行探讨。
一、病原微生物的分子识别病原微生物的分子识别是免疫系统响应的第一步。
人体的免疫细胞可以识别病原微生物表面的分子。
在这些分子中，细胞壁和细胞膜中的糖类、蛋白质和脂质是免疫系统识别病原微生物的主要目标。
通常，病原微生物的免疫原性分子被称为病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）。
常见的PAMPs包括菌细胞壁的LPS（脂多糖），细菌、病毒和真菌表面的蛋白质和多糖分子。
病原微生物的分子识别根据主要的宿主细胞受体种类分为两种：切割识别和无切割识别。
切割识别依赖于胞外酶类（如蛋白酶和糖酶）和细胞内酶类（如淀粉样多糖酶和葡聚糖酶）。
无切割识别则依赖于细胞表面受体（如Toll样受体（TLRs）和核苷酸荧光氧化酶（NLRs））。
二、免疫应答机制病原微生物的分子识别是免疫应答机制的第一步，通常由抗原递呈细胞（antigen-presenting cells，APCs）完成。
一旦病原微生物被APCs识别，免疫系统开始展开攻击。
免疫系统的攻击由两个主要的细胞类型完成：B淋巴细胞和T淋巴细胞。
B淋巴细胞通过分泌抗体实现直接杀死病原微生物。
T淋巴细胞则通过多种机制发挥作用，例如Killer T细胞（CD8+ T细胞）可以直接杀死感染的细胞，而辅助T细胞（CD4+ T细胞）可以调节免疫反应的类型和强度，推动B细胞产生更多的抗体。
免疫系统的攻击涉及到许多重要的分子信号。
其中，最重要的是细胞因子家族，包括干扰素、白细胞介素、趋化因子和肿瘤坏死因子（TNF）。
这些分子信号可以促进抗病毒、抗细菌和抗真菌等多种免疫反应。
除了细胞因子，免疫应答还包括抗体和补体系统。
抗体可以和病原微生物结合，从而标记其为“捕获”的对象。
鉴定病原微生物的分子诊断技术
鉴定病原微生物的分子诊断技术近年来，随着科技的不断进步和发展，分子生物学技术被广泛应用于医学诊断领域。
其中，分子诊断技术已经成为鉴别病原微生物的重要手段之一。
本文将着重介绍鉴定病原微生物的分子诊断技术，包括PCR、实时荧光定量PCR和核酸芯片技术。
一、PCR技术聚合酶链反应（PCR）是目前最常用的分子诊断方法之一。
PCR技术利用酶的生物催化作用，通过复制和扩增病原微生物DNA特异性序列来进行诊断。
PCR技术具有高度特异性和敏感性，能够检测极少量的病原微生物，在临床诊断中应用广泛。
在PCR技术的基础上，常常结合其他方法，如电泳、序列比对等，以提高检测的准确性和鉴定的可靠性。
二、实时荧光定量PCR技术实时荧光定量PCR技术是PCR的一种改进，是在PCR扩增反应过程中实时监测PCR产物的形成。
该技术采用荧光探针，通过记录荧光信号变化来确定PCR反应产物的数量。
实时荧光定量PCR技术具有非常高的特异性和敏感性，能够检测到非常低浓度的病原微生物DNA，在临床诊断、病毒检测和基因表达等领域得到广泛应用。
三、核酸芯片技术核酸芯片技术是一种高通量分子分析方法，可以同时分析大量样品的RNA或DNA序列。
该技术采用微阵列技术，将具有不同序列的核酸探针固定在芯片上。
样品中的RNA或DNA与芯片上的核酸探针杂交后，再通过荧光或其他检测方法来检测目标基因的表达情况。
核酸芯片技术具有快速、高通量、高度自动化等优点，是用于快速鉴定病原微生物的一种重要技术。
随着分子生物学技术的不断进步和发展，分子诊断技术也得到了不断完善和提高。
诸如PCR、实时荧光定量PCR和核酸芯片技术等诊断方法的出现，使得鉴定病原微生物的精确度和灵敏度大大提高，对临床医学的发展和健康服务的提升具有极大的意义。
病原微生物检测方法 27页PPT文档
返回
11
酶联免疫技术
酶联免疫技术是根据抗原- 抗体的免疫反应与 酶的高效催化作用原理有机结合,通过酶催化 底物进而发生一系列的化学反应,使溶液呈现 出颜色变化,从而显示抗原抗体特异性反应的 存在。
可以分析得出SARS与非SARS 病人血清中的 蛋白质成分变化。该技术不是利用单独的蛋白 质峰的出现和消失来判断SARS ,而是用5 个蛋 白质峰的出现和消失来判断,好比刑侦破案中 甄别5 个手指的指纹,故此称为“指纹图谱”。
8
八，LAMP技术
环介导等温扩增(loop—mediated isothermal amplification，LAMP)技术是近年来发展出的一 种敏感、特异、方便快捷的核酸扩增技术。与传 统PCR方法相比，LAMP不需要热循环，为等温 扩增。且由于LAMP反应中产生大量的副产物一 白色焦磷酸钾沉淀，扩增产物可不经过电泳，通 过肉眼观察或浊度计即可判定结果。
2
二，血清免疫学方法
免疫学技术是利用特异性抗原抗体反应,观察和研究 组织细胞、特定抗原(抗体)的定性和定量技术。为了 显示和观察这种抗原抗体反应,需要预先将某种标记 物结合到抗体上,借标记物的荧光或酶的有色反应、 放射性或高电子密度,在光镜或电镜下进行定性、定 位或定量研究。
荧光抗体技术 酶联免疫技术
用于检测：丙型肝炎病毒(HCV) 、严重急性呼吸 综合征冠状病毒(SARS—CoV) 、乙脑病毒(JEV) 、 甲型流感病毒(AIV) 、 腮腺炎病毒(MV)等。
9
谢谢
病原微生物的分子病理与诊断
病原微生物的分子病理与诊断在我们的日常生活中，病原微生物给我们带来了很多疾病和困扰。
为了更好地了解病原微生物，我们需要理解它们的分子病理学和诊断方法。
一、病原微生物的分子病理学病原微生物的分子病理学是研究它们引起疾病的分子机制和生物学特性的科学。
通过了解病原微生物的分子病理学，我们可以更好地了解疾病的发生和发展，并找到更好的治疗方法。
1. 生长和繁殖病原微生物的生长和繁殖是导致疾病的主要原因。
它们可以在宿主体内生长并繁殖，释放大量的细胞毒素，导致宿主免疫系统受损。
了解病原微生物生长和繁殖的机制对于治疗疾病至关重要。
2. 毒素病原微生物能够释放多种不同种类的毒素，这些毒素可导致许多不同的疾病。
毒素的种类、结构和功能均对不同的细胞和组织产生不同的影响。
了解毒素的生物学特性和分子机制对于防止和治疗疾病至关重要。
3. 遗传物质病原微生物的遗传物质决定了它们的物理特性和生物学特性。
它们是疾病的形成和传播的重要因素。
了解病原微生物的遗传物质对于对疾病进行有效的诊断和治疗至关重要。
二、病原微生物的诊断正确、快速地诊断病原微生物是对疾病进行有效治疗的前提。
了解病原微生物的诊断方法对于有效治疗疾病至关重要。
1. 细菌培养和检测这是目前最常用的病原微生物诊断方法之一。
它可以通过培养和鉴定细菌，确定病原体是何种细菌，从而选择合适的药物进行治疗。
2. 血清学检测通过检测血清中的抗体，可以确定病原微生物是否存在。
这种方法可以快速、准确地检测病原体，有效地指导临床治疗。
3. 分子诊断技术分子诊断技术是一种比较新的诊断方法，可通过检测病原体的遗传物质，快速和准确地确定病原体的种类、亚型及其耐药性。
这种方法通常需要专业的仪器和操作技能，但已被广泛应用于临床实践中。
4. 其他试验方法例如生物芯片技术，在许多医院已经得到应用。
生物芯片技术可以同时检测多种病原体，减少诊断时间和复杂性。
总之，了解病原微生物的分子病理学和诊断方法对于有效治疗疾病至关重要。
微生物和病毒的分子基础和控制
微生物和病毒的分子基础和控制微生物和病毒是人类生活中不可或缺的一部分，它们既有利用价值，又可能引起疾病的发生。
因此，了解微生物和病毒的分子基础和控制，对于维护人类健康和发展具有重要意义。
微生物和病毒的分子基础微生物包括细菌、真菌、病毒等，它们都是由细胞组成的，但它们之间的结构和功能各不相同。
细菌是单细胞生物，由质膜、细胞壁、细胞质和核糖体组成，能够进行自我繁殖，具有多种代谢途径。
真菌是多细胞生物，由菌丝和孢子构成，具有分枝和吸收营养的能力，能够产生有机物和其他生物活性物质。
病毒是非细胞生物，由核酸和包膜或壳体组成，不能进行自我繁殖，必须寄生于细胞内才能进行复制和生存。
微生物和病毒的分子基础也表现在它们的遗传物质上。
细菌和真菌的遗传物质是DNA，它们可以进行DNA复制、转录和翻译，进行遗传信息的传递和表达。
病毒的遗传物质可以是DNA或RNA，它们具有种属特异性和序列多样性，能够通过复制和变异来产生新的病毒株和表型。
此外，微生物和病毒所含有的蛋白质、糖类、脂质等分子也是其功能和生命活动的重要基础。
微生物和病毒的控制微生物和病毒的控制包括预防、治疗和监测等方面。
在预防方面，主要是通过生活环境和个人卫生的控制来减少微生物和病毒的传播。
对于细菌和真菌，我们可以通过消毒、防治害虫、加强卫生检查等方式来控制其繁殖和传播。
对于病毒，我们可以通过疫苗预防、隔离治疗、卫生教育等方式来减少其感染和传播。
在治疗方面，主要是利用药物和治疗手段来控制和治愈微生物和病毒引起的疾病。
对于细菌和真菌的感染，我们可以选择使用抗生素、抗真菌药等药物进行治疗。
对于病毒的感染，因其在宿主细胞内复制和生存，因此目前常使用的治疗手段是抑制病毒复制和增强宿主免疫系统反应，例如抗病毒药物和干预独特的病毒复制途径。
在监测方面，主要是对疾病发生的情况和微生物、病毒传播的趋势进行监测和检测。
这一方面包括医疗机构对疾病的诊断、治疗及社区防疫措施的规划实施。
病原微生物鉴定及其分子机制研究
病原微生物鉴定及其分子机制研究病原微生物是人类健康的威胁，对于防治传染病和保障人民健康具有重要意义。
现代医学已经发展出了多种病原微生物诊断方法，其中鉴定方法是非常重要的一种，能够快速、准确地确定病原体种类和亚型，帮助医护人员精准地治疗疾病。
本文将从病原微生物鉴定的基本原理、研究进展和分子机制三个方面进行讲解和探讨。
一、病原微生物鉴定的基本原理病原微生物鉴定是通过多种技术手段，对病原体的生物学和生化特性进行分析，从而确定病原体种类和亚型。
目前常见的鉴定方法包括：细菌形态学观察、生理生化方法、免疫学方法、分子生物学方法等。
1. 细菌形态学观察细菌形态学观察是最早的病原微生物鉴定方法之一，其原理是通过显微镜观察病原体细胞形态、大小、排列方式等特征，从而确定其种类和亚型。
这种方法虽然简单易操作、成本低廉，但是其缺点也很明显，例如无法区分高度相似的物种、只有几种菌种可以用这种方法进行鉴定等。
2. 生理生化方法生理生化方法是指通过检测病原体代谢产物、酶活性、基因表达等特征，从而鉴定其种类和亚型。
这种方法在临床实践中较为常见，成本较低，但也存在很多缺点，例如检测结果受环境因素影响较大、测试时间较长。
3. 免疫学方法免疫学方法是指通过检测病原体抗原和抗体在体液或组织中的反应性，从而鉴定其种类和亚型。
这种方法具有检测时间短、范围广等优点，但在复杂的混合样本中有可能产生误诊。
4. 分子生物学方法分子生物学方法是指通过检测病原体核酸序列，从而快速鉴定其种类和亚型。
这种方法的典型代表是PCR（聚合酶链反应），其具有检测速度快、灵敏度高、特异性强等优点，广泛应用于临床实践中。
二、病原微生物鉴定的研究进展近年来，随着生物技术的不断发展，病原微生物鉴定方法也得到了极大地完善和提高。
下面我们来了解一下病原微生物鉴定的研究进展。
1. 新型检测技术传统的鉴定方法在一定程度上存在一些限制，例如耗时长、操作繁琐、敏感性差等，而新型的检测技术正在逐渐兴起。
病原微生物的分子识别与免疫机制
病原微生物的分子识别与免疫机制在人类抵抗病原微生物的战斗中，免疫系统起着至关重要的作用。
而在免疫系统启动之前，病原微生物与免疫系统中的免疫细胞之间的分子识别是至关重要的。
本文将介绍病原微生物的分子识别与免疫机制。
一、病原微生物的分子识别病原微生物与免疫系统中的免疫细胞之间的互动在分子层面上进行。
病原微生物的分子结构和免疫系统中免疫细胞的分子结构都非常复杂，因此它们之间的互动也变得相当复杂。
下面将介绍病原微生物分子识别的两种机制。
1. PRRs的分子识别机制PRRs（模式识别受体）是一类存在于哺乳动物体内的分子，具有识别病原微生物标志分子的功能，包括：细胞质中的NOD类蛋白，胞浆中的RIG-I样受体以及表面表达的Toll样受体（TLRs）。
病原微生物标志分子包括病毒基因组，细胞壁、纤毛、flagellin等细胞结构，以及其他与细菌生长、代谢或传递等有关的分子。
当PRRs和病原微生物标志分子结合时，会启动免疫系统的应答，在这个过程中，炎症反应启动并产生足够的免疫反应，杀死病原微生物。
2.抗体的分子识别机制在免疫系统的另一种体系中，B细胞可以合成多种能够特异性结合到病原微生物表面抗原的抗体分子。
与病原微生物表面的抗原相结合后，抗体激活了免疫系统的另一组体系，包括NK细胞、T细胞等等。
这些细胞将协同作用、一起杀死感染的病原微生物。
二、免疫系统的工作机制当免疫系统识别到病原微生物和它产生的毒素时，会启动一系列的免疫反应，也被称为炎症反应。
炎症反应是一种有益的反应，它帮助免疫系统杀死病原微生物。
但是，如果免疫系统反应过度，炎症反应也会导致一些伤害。
因此，免疫系统必须细心谋求平衡。
这就意味着，在杀死病原微生物的同时，免疫系统也必须限制炎症反应的程度。
具体来说，这个过程包括以下几个方面：1.调节细胞的杀伤能力B细胞产生抗体，并将它们与病原微生物结合在一起，然后让其他细胞参与杀死感染的细胞。
2.保护其他人体组织并防止伤害免疫细胞必须努力抵消炎症反应，保护对自身没有威胁的组织。
病原微生物识别和免疫抗原的发现
病原微生物识别和免疫抗原的发现病原微生物是指能够引起疾病的微小生物，包括细菌、病毒、真菌和寄生虫等。
识别病原微生物是诊断和治疗疾病的基础，免疫抗原则是对抗病原微生物的主要手段之一。
病原微生物的识别是通过检测微生物存在的标志物，如细菌的细胞壁、病毒的核酸和蛋白质等，来确定病原微生物的种类和数量。
其中，细菌的细胞壁是一个重要的标志物，因为它具有多种结构和化学成分，可以作为细菌种类鉴定的依据。
例如，革兰氏染色法可以根据细菌细胞壁的结构分为革兰阳性菌和革兰阴性菌两类，从而缩小鉴定范围。
此外，不同种类的病毒在细胞中的生长特点也是一种重要的鉴定方法。
例如，乙型肝炎病毒需要在细胞核内才能复制，因此可以通过检测血清中的乙肝表面抗原来确认感染乙肝病毒。
除了通过病原微生物的标志物来识别病原微生物外，还可以通过分离和培养微生物来鉴定其种类。
这种方法非常常见于细菌的鉴定，利用培养基来创造有利的条件，让微生物生长和繁殖。
通过观察微生物的形态、色素、生长速度等特征，可以初步确定其种类。
然而，这种方法的局限性在于，有些微生物很难培养出来，有些微生物需要较长的时间才能够生长出来，而这些时间对于紧急情况下的诊断和治疗来说显然是不合适的。
在病原微生物识别的基础上，免疫抗原的发现成为了对抗病原微生物的一项主要策略。
免疫抗原是指可以引起机体免疫反应的物质，包括多糖、蛋白质、脂质等。
当机体感染了病原微生物时，免疫抗原会被机体免疫系统识别并作出相应的免疫反应，从而侵略和清除病原微生物。
因此，对免疫抗原的识别和开发成为了疾病诊断和治疗的主要手段之一。
免疫抗原的开发需要先了解病原微生物的免疫特性。
例如，有些病原微生物的表面覆盖着非常独特的多糖分子，可以在机体中产生高度特异性的抗体反应。
这些多糖可以用作疫苗的免疫原材料，通过注射多糖可以刺激机体产生相应的抗体，从而达到预防感染的效果。
此外，病原微生物的蛋白质也是免疫抗原的重要来源。
有些蛋白质在感染过程中具有重要的生物学功能，例如细菌的毒素、外毒素、胞内蛋白等，可以被机体识别为抗原并引起相应的免疫反应。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2015‐06‐032015年1月，奥巴马在国情咨文中宣布了一个预算为2.15 亿美元的精准医 学计划（Precision Medicine Initiative）。
循证医学(Evidence-based Medicine, EBM，1992) “慎重、准确和明智地应用目前可获取的最佳研究证据，同时结合临床医师个人的专业技能和长期临床 经验，考虑患者的价值观和意愿，完美地将三者结合 在一起，制定出具体的治疗方案”。
转化医学（Translational Medicine,2003） 是指一类医学研究，能够很好地将基础研究与解决患者实际问题结合起来，将基础研究的成果“转化”为实际患者 的疾病预防、诊断和治疗及预后评价。
其基本特征是多学科交叉合作，针对临床提出的问题，深 入开展基础研究，研究成果得到快速应用。
实现从“实验 室到床边”的转化(bench to bedside translation)，又 从临床应用中提出新的问题回到实验室(bedside to bench)，为实验室研究提出新的研究思路 个体化医学（Personalized Medicine ，2011） 个体化医疗，是以每个患者的信息为基础决定治疗方针，从基因组成或表达变化的差异把握治疗效果或毒副作用等 应答的个性，对每个患者进行最适宜药物疗法的治疗。
基因分析是个体化医疗的前提，基因测序技术的发展在驱 动着个体化医疗的进程。
12015‐06‐03 2011年，美国科学院、美国工程院、美国国立卫生研究院 及美国科学委员会共同发出“迈向精准医学”的倡议。
实现精准医学的基础是对疾病进行重新分类，要改变目前 沿用的以症状、部位、器官为要素命名疾病的传统方法。
• 精准医学 (Precision Medicine), 是指以个人基因组信息为基础,结合蛋白质组,代谢组 等相关内环境信息,为病人量身设计出最佳治疗方案,以期 达到治疗效果最大化和副作用最小化的一门定制医疗模式。
精准医疗的成功有赖于建立一个框架来调控、搜集和解释 生物技术时代涌入的大量信息，利用人类基因组学、蛋白 组学、信号传导学、细胞生物学、微生物学，结合环境及 临床数据，建立个体数据港，实施全球合作及数据共享， 在精准的疾病分类及诊断基础上，对有相同病因、共同发 病机制的病人亚群实现精准的评估、治疗和预防。
相较传统医疗,精准医学具有针对性、高效性及预防性等 特征,将开启医疗新时代。
22015‐06‐03分子诊断：应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质 的结构或表达水平的变化而做出诊断的技术，称为分子 诊断。
基因诊断：又称DNA诊断或分子诊断，通过分子生物学 和分子遗传学的技术，直接检测出分子结构水平和表达 水平是否异常，从而对疾病做出判断。
分子生物学：从分子水平上研究生命现象物质基础的学 科。
研究细胞成分的物理、化学的性质和变化以及这些 性质和变化与生命现象的关系，如遗传信息的传递，基 因的结构、复制、转录、翻译、表达调控和表达产物的 生理功能，以及细胞信号的转导等。
根据目的基因是否被放大分类扩增法 杂交法根据被测基因的核酸类型分类DNA、RNA、DNA/RNA ( Southern印迹用于检测DNA；Northern印迹用于检测RNA； 斑点印迹或称斑点杂交，既可检测DNA也可检测RNA)根据诊断目的或要求定性诊断、定量诊断和半定量诊断，以及序列分析等根据分子之间的作用形式杂交、扩增、测序32015‐06‐03核酸化学研究发展简史1868年， 分离出核酸（nucleic acid）。
1944年，揭示核酸生物学功能（DNA是遗传物质）。
1946年，Chargaff 法则 不 同 种 生 物 DNA 分 子 中 的 核 苷 酸 排 列 顺 序 不 同 (有种族特异性) 同种生物不同组织器官细胞中DNA分子的核苷酸 排列顺序相同 (无组织器官特异性) 某 一 特 定 生 物 ， 其 DNA 碱 基 组 成 恒 定 任 何 生 物 DNA碱基组成都符合 A=T， G=C， A+G=T+C1953年， Watson和Crick 提出DNA结构的双螺旋模型； 建立半保留复制假说。
(1962年获诺贝尔生理学奖 )60年代 提出“中心法则”（ Crick ，1958）和 操纵子学说，并成功破译遗传密码70年代 建立 DNA 重组技术。
80年代, 分子生物学、分子遗传学等突飞猛进发展中心法则PCR技术的诞生与发展1985年 美国PE-cetus公司人类遗传研究 室的Kary mullis发明了PCR技术 1988年 美国PE-cetus公司推出世界上第 一台PCR热循环仪，从而使PCR反应自动化 1993年 Kary Mullis因发明PCR技术获得 诺贝尔化学奖 1995年 定量PCR仪诞生，使定量研究DNA 靶序列成为现实（一）DNA的体外复制的步骤： 变性（denaturation） 退火（annealing） 延伸（extension）（二）PCR基本组成：模板DNA 引物 4种脱氧核糖核苷酸 DNA聚合酶 其他232442015‐06‐03靶序列 靶序列 温度循环式的扩增技术 常规（conventional PCR） 实时PCR（real time PCR，RT-PCR）为主， 等温方式的扩增技术 核酸序列扩增法（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA） 转录介导的扩增（Transcription-mediated amplification， TMA） 环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification， LAMP） 常规PCR：在扩增反应结束后对产物进行电泳或杂交等 方式的分析 常规PCR衍生方法 PCR结合限制性长度多态性分析（PCR-RFLP） CR结合特异性寡合苷酸探针斑点杂交（PCR-ASO） PCR结合变性梯度凝胶（PCR-DGGE） PCR结合的单链构象多态性（PCR-SSCP）名称 简并引物扩增法巢式PCR多重PCR反向PCR单一特异引物PCR 单侧引物PCR 原位PCR 锚定PCR主要用途 扩增未知基因片断 提高pcr敏感性、特异性，分 析突变 同时检测多个突变或病原 扩增已知序列两侧的未知序 列，致产物突变 扩增未知基因组DNA 通过已知序列扩增未知cDNA 研究基因表达 分析具备不同末端的序列 依赖于核酸序列的扩增技术（NASAB） 转录介导的扩增（TMA） 环介导等温扩增技术（LAMP） 链替代扩增技术（SDA） 滚环扩增技术（RCA）5a.AMV逆转录酶将RNA转 录成cDNAb.生成的RNA-DNAc.产物被RnaseH分解为 单链DNAd.引物2结合DNA，再在 逆转录酶作用下合成双 链DNA，e.双链DNA上引物携带 的T7RNA聚合酶的启动 子序列将DNA转录成RNAf.RNA又可以生成DNAg.反应循环发生； 优点. 操作简便,不需特殊仪器,不需温度循环,循环次数少,忠实性高,特异性 好,扩增效率高于标准PCR2015‐06‐03 基于DNA或RNA扩增技术，具有很高灵敏度，特异性 PCR技术可以准确的定量感染性疾病病原体 真菌、细菌和病毒以及寄生虫 同时同一种病原体可以开发多种扩增原理的检测试剂； 在sFDA注册的应用PCR方法的体外诊断试剂已达到190余种，成为病原体和基因表达与突变检测的最主要的试剂。
可以预见PCR技术仍将主导临床实验室感染性病原体的检测，细菌的耐药基因检测，肿瘤个体化治疗的主要检测工具。
分子杂交 （molecular hybridization） 两条同源核酸分子 （DNA或RNA）可以在碱基互补的原则下形成异质双链是遗传物 质最重要的化学特征，这一过程亦被称为分子杂交。
分子杂交是所有分子生物学技术的基础 印迹杂交（southern Blot和northern Blot） 实时PCR（real time PCR） 基因芯片 高通量DNA测序技术 ——广义的分子杂交技术是指以核酸、蛋白、糖基以及细 胞、代谢物等分子的相互作用所建立的分析方法。
分子杂交技术的类型 原位杂交 通过特异性的标记探针检测细胞内的核酸物质； 生物芯片 通过探针检测从细胞内提取的核酸、蛋白等物质。
荧光原位杂交 （Fluorescent in situ hybridiztion，FISH） 应用特异性的探针检测细胞内的核酸需要标记分子显示杂交信号， 最初采用放射性核素标记，信号检测程序复杂且可能存在放射性 污染，而荧光物质标记可以通过显微镜直接观察实验结果，因此 荧光标记的原位杂交技术一经出现立刻取代了放射性标记的技术， 成为应用最广泛的分子杂交技术。
FISH技术特点：可视化检测，定量，定位 FISH四个步骤：核酸变性、探针变性、杂交及信号检测。
衍生技术：单色FITC——多色FISH技术，五种染料 （Rhodamine, Texas-red, Cy5, FITC, and Cy5.5）6Journal of Cell Science 2003；116 （14）2015‐06‐03在病原微生物鉴定与耐药基因检测方面军团菌、幽门螺旋杆菌和结核杆菌等较难培养鉴定的细菌， 在快速诊断上显示了很好的应用前景。
在产前诊断方面用于染色体数目异常的诊断在血液肿瘤的诊断方面用于染色体异位的融合基因检测、基因缺失检测、微小残留 病灶监测、骨髓移植监测等。
在实体肿瘤诊断治疗应用于肺癌、乳腺癌、膀胱癌、宫颈癌等实体肿瘤的肿瘤的 辅助诊断，疗效检测、个体化治疗和预后判断。
FISH用于药物靶向性基因表达状态的检测。
在乳腺癌治疗药物曲妥珠单抗(赫赛汀)治疗有效性患者筛选 中，FISH被认为是检测HER2基因表达状态的金标准。
生物芯片（Biochip）将大量特定序列的寡合苷酸片段、抗原/抗体，甚至细胞或组织 等生物大分子，按照矩阵方式高密度的固定或直接合成在固相 支持物上，成为探针。
固化的探针分子与荧光标记的相应样本 进行杂交，通过荧光检测系统扫描分析及计算机软件分析，达 到高通量分析生物信息的目的。
生物芯片技术分类微阵列芯片（Microarray chip）微流控芯片（Microfluidics）芯片实验室（LAB-on-chip, LOC）。
72015‐06‐03基因芯片发展历史Southern & Northern Blot Dot Blot Macroarray Microarray支持物的预处理实性材料：硅芯片、玻片和瓷片 需进行预处理，使其表面衍生出羟基、氨基活 性基团。
膜性材料：聚丙烯膜、尼龙膜、硝酸纤维膜 通常包被氨基硅烷或多聚赖氨酸DNA微集阵列的制备 方式：预先合成DNA或制备基因探针然后打印到芯片上 1.探针的制备已克隆的基因片段 PCR，RT-PCR扩增的基因片段 人工合成的DNA片段 单链、双链、DNA或RNA 均可作为探针 2. 打印 喷墨打印（非接触式点样） 针式打印（接触式点样） 3. 探针的固化 打印探针后，需要将其固定在支持物表面，同时也要封闭支持物上未打印区域以防止核酸样品的非 特异性固定分子杂交 样品与DNA芯片上的探针阵列进行杂交与经典分子杂交的区别： 杂交时间短，30分钟内完成 可同时平行检测许多基因序列影响杂交反应的因素： 盐浓度、温度、反应时间、DNA二级结构结果分析 1. 激光激发使含荧光标记的DNA片段发射荧光 2. 激光扫描仪或激光共聚焦显微镜采集各杂交点的信号 3. 软件进行进行图象分析和数据处理8基因芯片的优点1. 高通量 2. 大规模 3. 高度平行性 4. 快速高效 5. 高灵敏度 6. 高度自动化2015‐06‐03 生物芯片临床应用 病原体快速检测、亚型及耐药性检测； 肿瘤的分类、分期与筛查； 遗传性疾病的诊断于筛查； 自身免疫性疾病的诊断等等 国外生物芯片开发较早，许多成熟生物芯 片的检测平台已逐渐应用于临床 高通量自动化测序仪第二代基因测序技术主要平台第三代基因测序技术主要平台9应用范围全基因组测序 （Complete genome resequencing）约化表示测序法 （Reduced representation sequencing）靶向再测序（Targeted genomic resequencing）末端配对测序（Paired end sequencing）环境基因组测序（Metagenomic sequencing）转录组测序（Metagenomic sequencing）小RNA测序（Small RNA sequencing） 酸性亚硫酸盐标记DNA测序 （Sequencing of bisulfite-treated DNA）染色质免疫沉淀测序（ChIP-Seq）核酶片段及测序 （Nuclease fragmentation and sequencing）分子条码（Molecular barcoding）应用举例人类个体基因组多态性及突变的全面检测大规模多态性检测 靶向多态性及突变检测 遗传及获得性结构变异检测 传染性及共生菌群检测 定量基因表达及选择性剪切；转录注释；转录 SNPs或体细胞突变检测 microRNA表达谱 基因组DNA中胞嘧啶甲基化模式的测定全基因组蛋白质与DNA相互作用图谱核小体定位多个体来源样品的多通路测序Matrix-assisted laser desorption ionization–time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)Bruker BiotyperVitek MS572015‐06‐0310。