恒温扩增技术综述
转录介导恒温扩增技术
转录介导恒温扩增技术
1. 反转录，首先，RNA模板与逆转录酶和引物结合，形成RNA-cDNA杂交复合物。
逆转录酶将RNA模板转录成相应的cDNA。
2. 引物延伸，引物结合到cDNA上，并通过DNA聚合酶的作用
进行引物延伸，形成双链DNA。
3. 温度循环，TMA技术在恒温条件下进行，通过不同温度的循
环来完成RNA转录、DNA扩增和信号产生等步骤，无需PCR仪器。
4. 信号检测，在扩增过程中，常使用荧光探针或其他检测方法
来监测产生的DNA数量，从而实现对目标基因或病原体的检测和定量。
TMA技术具有以下优点：
高度特异性，引物设计和反转录酶的选择可以确保对目标序列
的高度特异性识别。
高灵敏度，TMA技术能够在较低的RNA或DNA浓度下进行扩增，
具有高灵敏度。
高效，由于在恒温条件下进行，TMA技术通常比PCR技术更快速、更高效。
总的来说，转录介导恒温扩增技术是一种高效、高灵敏度和高度特异性的分子生物学技术，可用于临床诊断、病原体检测和基因表达分析等领域。
恒温扩增技术在分子诊断中的应用
恒温扩增技术在分子诊断中的应用摘要：既往临床诊断中主要对聚合酶链反应（PCR）技术进行应用，但其存在一定程度的缺陷，而恒温扩增技术因为具有引物种类的多样性，所以检测方法相对多变，能够对传统PCR中存在的缺陷有效弥补，并在分子诊断工作中得到了广泛应用。
关键词：恒温扩增技术；分子诊断；应用相对于常规PCR技术，对恒温扩增技术进行应用，其不仅不需要应用专门的仪器，且更加的快速和高效。
当前广泛应用的恒温扩增技术主要包括依赖核酸序列扩增（NASBA）、转录介导扩增（TMA）、环介导等温扩增（LAMP）等多种形式，其各具优缺点，且能够在分子诊断工作之中起到不同的作用。
一、依赖核酸序列扩增（NASBA）NASBA是主要适合应用于RNA的扩增之中，针对体外特异、连续均一且引物介导的单链RNA实施恒温扩增，需要于42℃的环境中使用两个小时左右的时间，将模板RNA扩增至其109——1012倍。
对NASBA进行应用：（1）在NASBA电化学发光技术检测法方面，需要对电化学发光技术原理进行应用，针对RNA产物实施检测工作，完成扩增反应以后，使用经过生物素标记的探针与RNA产物结合形成复合物，并由寡核苷酸饱和磁珠携带至电极处，受到低电压影响，钌离子能够出现氧化还原反应并产生光子，并于三丙胺作用下再生，可见电极处的RNA产物与光信号强度具有密切关联性，二者呈正相关关系，所以可以通过电化学发光检测技术对620nm位置的发光强度进行检测并明确RNA定量；（2）核酸杂交检测法的应用，将NASBA为基础结合原位杂交技术形成原位NASBA，使用原位杂交技术探针及RNA扩增产物进行杂交，再使用紫外分光光度计对探针量进行监测，可以实现RNA产物的定量分析工作[1]。
二、环介导等温扩增（LAMP）LAMP属于一项新型的核酸扩增技术，其具有扩增效率较高的特点，其扩增效率最高能够达到普通PCR的100倍左右，同时特异性较强，并且所需的反应时间较短，一般30——60min即能够实现一次扩增反应，在临床样本量大时，可以实现快速的检测，另外，对LAMP进行应用的成本相对较低，仅需恒温器即可。
rna恒温扩增技术报告_概述说明以及解释
rna恒温扩增技术报告概述说明以及解释1. 引言1.1 概述RNA恒温扩增技术是一种重要的分子生物学工具，用于在低温环境下扩增RNA 序列。
与传统的PCR技术相比，RNA恒温扩增技术拥有更高的特异性和敏感性。
它能够通过使用适当的引物和酶，在简单的反应条件下直接从源RNA中合成大量目标RNA。
1.2 文章结构本文将首先介绍RNA恒温扩增技术的原理及其方法步骤，然后探讨其在不同领域的应用，并分析该技术的优势和局限性。
最后，通过具体实例展示RNA恒温扩增技术在医学研究中的应用，并给出结论。
1.3 目的本报告旨在全面了解和阐述RNA恒温扩增技术在生物学领域以及医学研究中的发展现状和应用价值。
深入了解该技术可以帮助我们更好地利用其优势并克服其中的局限性，进而推动该技术在相关领域的广泛应用。
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2. RNA恒温扩增技术2.1 原理介绍RNA恒温扩增技术，也被称为RT-LAMP（Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification），是一种在恒温条件下进行的RNA扩增技术。
该技术通过结合反转录和等温DNA聚合酶链式反应（LAMP）的原理，可以在简单实验室设备中高效、快速地扩增RNA分子。
具体而言，RNA恒温扩增技术利用反转录酶将RNA模板转录成相应的互补DNA。
然后，在适当的缓冲液中加入聚合酶、引物和酶切酶，使得DNA模板与特定引物结合，并产生“环状”DNA片段。
接着，使用聚合酶链式反应（LAMP）的原理，在恒温条件下利用多个特异性引物选择性地扩增目标序列。
这些引物将形成特殊结构，促进大量的目标序列复制和放大。
2.2 方法步骤RNA恒温扩增技术包含以下主要步骤：1. 反转录：首先，将待检测的RNA样本与反转录酶以及反向引物一起孵育，在适当的温度下完成反转录过程，将RNA转录成互补的DNA。
技术丨搞定恒温扩增分子诊断（RPARAA）
技术丨搞定恒温扩增分子诊断（RPARAA）展开全文2020-9-14|编辑: 归去来兮|查看: 114|评论: 0|来源: IVD学习笔记 | 作者：iAnny摘要: 分子诊断技术今日不同以往，着实借力突飞猛进，恒温扩增技术由于其扩增期间不需要特殊的仪器设备而更受瞩目。
恒温扩增方法有多种，今天就回顾RPA/RAA，让大家一文通俗搞定~~嗯啊, 如果有疑问，决定开小灶，包会！哈 ...分子诊断技术今日不同以往，着实借力突飞猛进，恒温扩增技术由于其扩增期间不需要特殊的仪器设备而更受瞩目。
恒温扩增方法有多种，今天就回顾RPA/RAA，让大家一文通俗搞定~~嗯啊, 如果有疑问，决定开小灶，包会！哈哈~~为了确保大家所认知的基本概念是一致的，请先了解以下名词解释•重组酶聚合酶扩增技术，RPA, recombinase polymerase amplification•重组酶介导的扩增技术，RAA, recombinase-aidamplification •重组酶，recombinase，同引物形成蛋白-核酸复合物，指导引物与模板结合，起到定位作用；帮助DNA 模板的解链和促使模板与引物之间发生链替换。
•单链DNA结合蛋白，SSB, single stranded DNA binding。
同置换出来的单链DNA结合，防止DAN配对两条链再次结合。
•DNA聚合酶，DNA polymerase，以DNA为模板，利用dNTP 合成子代DNA。
•核酸内切酶，endonuclease，可水解分子链内部磷酸二酯键生成寡核苷酸。
•Nfo，来源于细菌的核酸内切酶，且更倾向于作用于3′凹末端的双链DNA，参与DNA损伤修复。
RPA和RAA的工作原理相同点：•3种关键酶或蛋白：重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶；•在37℃恒温下进行核酸快速扩增；唯一不同点：酶的来源不同，推测主要时因为专利限制问题。
•RPA的重组酶来源于T4噬菌体；•RAA的重组酶来源于细菌或者真菌。
恒温扩增技术综述
摘要：恒温扩增技术是继PCR技术后成长起来的一门新型的体外核酸扩增技术。
目前主要的恒温扩增技术有：滚环核酸扩增、环介导等温扩增、链替代扩增、依赖核酸序列扩增和解链酶扩增。
它们都具有共同的特点：恒温、高效、特异、不需要特殊的仪器设备。
本文就现阶段恒温扩增技术的特点及其在植物疫病检测中的应用情况和前景做一综述。
关键词：恒温扩增；PCR引言：近年来，随着分子生物学技术的迅速成长，基于核酸检测的诊断法子已年夜量建立并广泛应用于植物疾病的实验室检测中，恒温扩增技术就是在此布景下呈现的。
与其它的核酸扩增技术相比，恒温扩增有快速、高效、特异的优点且无需专用设备。
所以它一经呈现就被许多学者认为是一种有可能与PCR 媲美的检测法子，目前主要的恒温扩增技术有：滚环核酸扩增（rolling circle amolification，RCA）、环介导等温扩增（loopmediated isothermal amplification，LAMP）、链替代扩增（strand displacement amplification，SDA）、依赖核酸序列扩增（nucleicacid sequence based amplification，NASBA）和解链酶扩增（helix dependent amplification，HAD），这些技术各有特点，这也决定了它们在植物疾病检测中的应用情况，下面就它们的原理、特点及其在植物疫病检测中的应用情况进行综述。
1滚环核酸扩增1. 1 滚环核酸扩增的原理滚环核酸扩增（rolling circleamolification, RCA）是通过借鉴病原生物体滚环复制DNA 的方法而提出的[1]，可分为线性扩增与指数扩增两种形式。
线性RCA 是引物结合到环状DNA 上后，在DNA 聚合酶作用下被延伸，产品是具有年夜量重复序列（与环状DNA 完全互补）的线状单链。
线性RCA 用于靶核酸扩增仅限于一些具有环状核酸的病毒、质粒和环状染色体，线性扩增倍数为105。
rna恒温扩增法
rna恒温扩增法
RNA恒温扩增法是一种用于扩增RNA的恒温核酸扩增技术。
相较于传统的PCR扩增技术，RNA恒温扩增无需进行多步温度循环，避免了非特异性产物的产生，提高了扩增的特异性和效率。
RNA恒温扩增法的原理是在恒温条件下，利用特定引物对RNA 进行快速、特异的扩增。
这个过程可以在42℃左右的恒温条件下进行，大大简化了实验设备的需求。
同时，该技术利用M-MLV反转录酶产生靶标核酸（RNA）的一个双链DNA拷贝，然后利用T7RNA
多聚酶从该DNA拷贝上产生多个（100~1000个）RNA拷贝。
每一个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环。
此外，RNA恒温扩增技术具有灵敏度高、检测时间短、产物不易发生污染等优点，在临床上已经得到广泛应用。
例如，该技术可用于建立7种常见致病NTM的RNA恒温扩增实时快速检测方法（SAT），通过对临床分离株和痰标本的检测，评估其临床应用价值。
酶促恒温扩增技术(ERA)在食品安全检测领域的应用
酶促恒温扩增技术（ERA）在食品安全检测领域的应用随着全球经济的发展，进口贸易的增多，食品安全检测也日趋严格。
常用于食品安全检测的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术，是目前大部分检测机构及医学实验室都在使用的常规技术。
然而该技术需要昂贵且精密的控温设备，耗费较长时间，在现场检测中不具备优势，因此，我们需要更加简便的技术来提高检测效率。
等温核酸扩增技术的问世为现场快速检测带来新的曙光。
今天给大家介绍我们先达基因的酶促恒温扩增技术(ERA)。
本文对酶促恒温核酸扩增技术及其应用进行综述。
ERA 技术全称酶促恒温核酸扩增技术，是聚合酶链式反应(PCR)的一种替代品，也是一种全新的升级，可准确、快速、便携地进行核酸检测分析。
ERA 与PCR 扩增一样具有特异性，但速度快得多，结果通常在5～10 min 生成。
而且与PCR 不同的是，ERA 反应不需要热变性，因此不需要昂贵的热循环设备。
ERA对操作温度要求并不严格，反应在37～42℃的温度下工作最优，比其他等温扩增技术需要的温度要低，能在广泛的环境温度下工作。
ERA可以在多种应用中取代PCR，如传染病诊断、食品安全检测、水产畜牧疫病检测等等，它非常适合于现场、护理点和其他设备缺乏的环境，特别是对于检测速度需求较高的情况下。
一ERA 技术介绍1、反应原理酶促恒温扩增技术（ERA技术）是先达基因公司团队研发的具有全球自主知识产权等温核酸扩增技术，将来源于细菌，病毒和噬菌体的特定工具酶进行改造突变并筛选其功能，通过不同的核酸扩增反应体系进行优化组合，从而获得核心的酶促恒温扩增体系。
模拟生物体遗传物质自身扩增复制的原理，通过蛋白定向进化、DNA与核酶亲和力成熟等技术对重组酶、核酸内切酶、DNA聚合酶等多酶体系进行改造，建立ERA扩增反应体系，使之将单分子DNA/RNA的特异性区段在5-10分钟内扩增10^9倍。
2、引物设计ERA 引物设计原则：(1) 引物长度最长是35 bp，最好为29～32bp，过短会影响重组酶活性。
era等温扩增技术原理
era等温扩增技术原理ERA（等温扩增反应）技术是一种新型的核酸扩增技术，它与传统的PCR（聚合酶链式反应）技术相比具有更高的特异性、更简单的操作流程以及更广泛的应用前景。
ERA技术的原理基于聚合酶的内切酶活性，利用酶的特性实现核酸的扩增。
ERA技术的核心是等温聚合酶反应，通过选择性的引物和酶的相互作用，实现核酸的扩增。
具体而言，ERA技术主要包括以下步骤：反应开始时，将待扩增的DNA模板与引物和聚合酶一起加入反应体系中，同时加入内切酶。
在ERA反应中，引物的设计十分关键。
引物需要具有特异性，能够特异性地与目标DNA序列结合。
一般情况下，ERA反应需要设计两对引物，一对引物用于引发反应的启动，另一对引物用于扩增目标序列。
引物的选择需要基于目标序列的特点，如GC含量、序列长度等。
在ERA反应的开始阶段，聚合酶结合到引物的末端，并开始向反向扩增。
此时，内切酶开始发挥作用。
内切酶具有切割DNA链的能力，当聚合酶合成的DNA链长度达到一定程度时，内切酶将切割DNA链，从而释放出DNA链的一部分。
被切割的DNA链片段将被聚合酶利用为新的DNA模板，进一步进行扩增。
这个过程将不断重复，直到达到所需的扩增倍增数。
与PCR技术相比，ERA技术的最大优势在于无需外加热循环装置。
ERA反应在恒温下进行，大大简化了实验的操作流程。
同时，ERA技术的特异性也更高，引物的设计更加灵活。
这使得ERA技术在临床医学、食品安全检测等领域有着广泛的应用前景。
ERA技术的应用领域十分广泛。
在临床医学中，ERA技术可以用于病原体的检测和分析，如病毒、细菌等。
在食品安全领域，ERA技术可以用于食品中致病菌的检测，如大肠杆菌、沙门氏菌等。
此外，ERA技术还可以用于环境监测、基因工程等领域。
总之，ERA技术是一种新型的核酸扩增技术，其原理基于等温聚合酶反应。
相比传统的PCR技术，ERA技术具有更高的特异性、更简单的操作流程以及更广泛的应用前景。
核酸提取及扩增技术简介(含等温扩增技术)-综述
核酸提取及扩增技术原理简介1核酸理化性质RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。
除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸都呈酸味。
DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。
DNA可达10g/L，呈黏性胶体溶液，在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。
2细胞破碎大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。
每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。
根据原理不同，细胞破碎主要包含机械破碎法，化学试剂法，酶溶解法。
1）机械方法：包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。
这些方法用机械力使细胞破碎，但机械力也可引起核酸链的断裂，因而不适用于高分子量长链核酸的分离。
有报道超声裂解法提取的核酸片段长度从< 500bp~>20kb之间，而颗粒匀浆法提取的核酸一般<10kb。
2）化学试剂法：经一定的pH 环境和变性条件下，细胞破裂，蛋白质变性沉淀，核酸被释放到水相。
上述变性条件可通过加热、加入表面活性剂（SDS、Triton X-100、Tween 20、NP-40、CTAB、sar-cosyl、Chelex-100等）或强离子剂（异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍）而获得。
而pH环境则由加入的强碱（NaOH）或缓冲液（TE、STE 等）提供。
在一定的pH环境下，表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋白质和多糖沉淀，缓冲液中的一些金属离子螯合剂（EDTA 等）螯合对核酸酶活性所必须的金属离子Mg2+ 、Ca2+ ，从而抑制核酸酶的活性，保护核酸不被降解。
3）酶解法：主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶（蛋白酶K、植物蛋白酶或链酶蛋白酶）以使细胞破裂，核酸释放。
蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸的分离。
lamp技术综述
LAMP简介环介导等温扩增法(1oop—mediated isothermal amplification，LAMP)，是由日本的荣研株式会社的Notomi日等人2000年开发出来的一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerasc)的作用下，60--65℃恒温扩增，15-60rain左右即可核酸扩增，效率可达109～10m个数量级，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。
在DNA合成时，从脱氧核酸三磷酸基质(dNTPs)中析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉淀，呈现白色。
因此，可以把浑浊度作为反应的指标，只用肉眼观察白色浑浊沉淀，就能鉴定扩增与否，而不需要繁琐的电泳和紫外观察。
由于LAMP反应不需要PCR仪和昂贵的试剂，有着广泛的应用前景。
LAMP原理利用Bst大片段DNA聚合酶和根据不同靶序列设计的两对特殊的内引物(FIP由F1C和F2组成；BIP由BIC和B2组成)、外引物(F3和B3)，特异地识别靶序列上的6个独立区域。
FIP引物的F2序列与靶DNA上互补序列配对，启动循环链置换反应。
F3引物与模板上的F3C区域互补，引起合成与模板DNA 互补的双链，从而挤掉FIP引起的DNA单链。
与此同时，BIP引物与被挤掉的这条单链杂交结合，形成的环状结构被打开，接着，B3引物在BIP外侧进行碱基配对，在聚合酶的作用下形成新的互补链。
被置换的单链DNA两端均存在互补序列，从而发生自我碱基配对，形成类似哑铃状的DNA结构。
LAMP反应以此DNA结构为起始结构，进行再循环和延伸，靶DNA序列大量交替重复产生，形成的扩增产物是有许多环的花椰菜形状的茎一环结构的DNA，在恒温条件65℃左右进行扩增，在45～60min的时间里扩增可达到109～1010数量级。
LAMP优缺点LAMP方法优点：灵敏度高（比传统的PCR方法高2～5个数量级）；反应时间短（30～60min就能完成反应）；临床使用不需要特殊的仪器（试剂盒研发阶段推荐用实时浑浊仪）；操作简单（不论是DNA还是RNA，检测步骤都是需将反应液、酶和模板混合于PCR管中，置于水浴锅或恒温箱中63℃左右保温30～60min，肉眼观察结果）。
交叉引物恒温扩增技术
交叉引物恒温扩增技术随着科学技术的不断进步，人们的实验室实践也不断得到更新发展。
其中，分子生物学领域的实验技术，也一直在不断地更新。
其中，交叉引物恒温扩增技术就是其中之一。
下面，将从实验原理、实验步骤、实验优缺点等几个方面来介绍这项技术。
一、实验原理交叉引物恒温扩增技术是利用核酸酶特异性修饰的基础上，引入两种简单补体（泛素和NEDD8）酶E1和酶E2、UbcH10和蛋白酶酶E后，在恒温条件下使两组特异性引物的3′端在一段距离的核酸序列上反向交叉形成一个中间部分，反转序列，交叉引物，形成环形序列。
整个反旋转操作在没有可识别序列的前提下自发完成。
然后，通过连续不停的自我扩增过程，在恒温的情况下进行，可以非常高效地产生大量的DNA片段。
具体细节可参见专业的实验指南。
二、实验步骤第一步：在实验过程中，首先需要准备好扩增试剂盒。
然后，按照试剂盒说明书的指示，准备好实验需要的生物样品和反应液体。
将反应液装入扩增管中，加入适当的DNA模板。
第二步：将扩增管号码标记好，并注明实验细节和样品编号。
将所有扩增管放置在扩增仪中，根据实验目的和需求，设置相应的扩增步骤和条件。
在保证实验质量的前提下，尽可能地进行扩增。
第三步：对于DNA产物的检测，可以使用琼脂糖凝胶电泳等方法进行实验。
通常，需要按注记在扩增管上的标签编号记录扩增产物的质量和产出量。
可以将扩增产物用PCR定量仪进行定量，但如果没有定量仪，则可以使用基础的测量方法进行计算。
三、实验优缺点该实验方法优点明显。
首先，实验过程简单易行，产生高效。
同时，该技术也可以用于快速分离固定目标序列和中间肿瘤基因“热点”突变基因，用于病原体基因检测和药品突变的分子生物学研究。
此外，交叉引物恒温扩增技术可以产生稳定的DNA序列，使得可扩增序列可以重复进行。
此外，该方法虽然放大的片段比较短，但可以对目标序列的特异性完美保证。
在实际使用中，交叉引物恒温扩增技术也存在一些缺陷。
首先，该方法需要充分了解DNA的基础知识，以做出正确的扩增结果。
DNA扩增试剂盒恒温扩增法
D N A扩增试剂盒恒温扩增法The pony was revised in January 2021一、技术原理1. 产品描述本公司生产的DNA扩增试剂盒可用于人源性、动植物源性病原体及其他细菌、真菌、病毒、寄生虫等核酸的快速扩增。
本试剂盒通过Bst聚合酶、四种核苷酸单体（dNTPs）、引物等成分的作用，在恒温条件下（60～65℃）快速、特异地完成核酸扩增，并可借助显色液或相关仪器直接判断结果。
2. 产品规格二、详细信息型的核酸。
反应条件反应温度：63℃；反应时间：20 ~60min；反应仪器：恒温金属浴/ESE Tube Scanner/荧光PCR仪/GenieII/浊度仪。
检测方法染料法、浊度法、荧光法产品特点 1. 方便快捷：将反应液、酶、引物等混合均匀，20~60min便可观察结果；2. 特异性高：利用多条引物扩增目的基因的特异区域，确保扩增的准确性；3. 灵敏度高：最低可检测出1个拷贝的基因。
相关实验图片展示其它图片图1荧光指示剂（钙黄绿素）颜色变化图图2荧光指示剂（钙黄绿素）检测(ESE Tube Scanner)三、相关产品产品编号产品名称产品说明规格DRSR03荧光指示剂（钙黄绿素）本产品可作为恒温荧光扩增反应中的荧光指示剂，可根据颜色变化肉眼判断结果。
24测试/盒DASR06RNA扩增试剂盒（恒温扩增法）本试剂盒为细菌、真菌、病毒、寄生虫等病原体核酸(RNA)的恒温扩增通用试剂盒，集逆转录与核酸扩增于一体，20-60 min完成整个检测过程，同时有多种检测方式。
24测试/盒。
恒温扩增技术的原理与用途探究
恒温扩增技术的原理与用途探究恒温扩增技术（Isothermal amplification technology）是近年来快速发展的一种DNA扩增技术。
与传统的PCR技术相比，恒温扩增技术无需PCR仪和温度梯度装置，可以在恒温条件下进行核酸扩增反应，因此它在实际应用中更为方便和快捷。
恒温扩增技术通常被应用于检测传染病病原体、生物复杂体系、食品安全、环境监测等领域。
本文将探究恒温扩增技术的原理与应用。
一、恒温扩增技术的原理恒温扩增技术主要有四种类型：Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)、nicking enzyme amplification reaction (NEAR)、strand displacement amplification (SDA)、和rolling circle amplification (RCA)。
虽然细节不同，但是它们的基本原理类似。
在这里我们以LAMP技术为例来解释。
1、引物的设计LAMP反应需要进行特定引物的设计，其中，两对内引物（inner primers）和两对外引物（outer primers）被设计用于扩增模板DNA。
外引物（F3、B3）主要用于筛选扩增目标区域，内引物（FIP、BIP）则用于扩增DNA序列。
FIP和BIP具有两个功能区域：核酸酶活性区域和补体区域。
核酸酶活性区域能够酶切反向链的DNA，而补体区域则耦合在酶活性区域的端部。
平均来说，LAMP反应有4个引物，但是在某些情况下，造一个最好的引物可能会超出这个限制。
2、引物的加入将LAMP反应组分（包括模板DNA、引物、酶、缓冲液等）混合到混合物中，并将混合液加入LAMP反应管中。
然后将管子放入恒温控制的恒温器中（使用水槽、温箱或便携式仪器实现），并将反应温度控制在60-65摄氏度，进行约30-60分钟的反应。
3、快速增长的DNA产品LAMP技术在恒温条件下进行，采用螺旋型DNA结构，生成多个"回路"（"loop"）。
酶切探针恒温扩增法
酶切探针恒温扩增法
接下来，让我们谈谈恒温扩增法。
恒温扩增法是一种在恒定温
度下进行的DNA扩增技术。
与传统的PCR技术不同，恒温扩增法不
需要周期性变化的温度。
这种方法通常使用一种特殊的DNA聚合酶，如Bst DNA聚合酶，它能够在较高温度下活跃。
恒温扩增法通常结
合了等温环介导扩增（LAMP）或环介导扩增（RCA）等技术，以实现
快速、灵敏的DNA扩增。
将酶切探针和恒温扩增法结合起来，可以实现对特定DNA序列
的高度特异性检测。
通过将酶切探针与恒温扩增技术相结合，可以
在恒定温度下实现对特定基因的快速检测，而无需复杂的温度变化
步骤。
这种方法在临床诊断、环境监测和食品安全等领域具有潜在
的应用前景。
总的来说，酶切探针恒温扩增法结合了酶切探针技术和恒温扩
增技术的优势，能够实现对特定DNA序列的高度特异性检测，具有
快速、灵敏和简便的特点，有望在生物医学和生命科学领域发挥重
要作用。
rna恒温扩增技术报告
rna恒温扩增技术报告全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：RNA恒温扩增技术是一种新兴的核酸扩增技术，适用于RNA的特异性扩增，其原理是通过一种特殊的酶在恒温条件下进行反复复制，实现RNA的扩增。
该技术具有操作简便、高效、灵敏度高等优点，在RNA病毒检测、基因表达检测等领域有着广泛的应用前景。
一、RNA恒温扩增技术的原理RNA恒温扩增技术是基于异氰酸酯酶（RTX）的反转录功能和DNA 聚合酶（Bst DNA聚合酶）的扩增功能，通过这两种酶的协同作用，在恒温（60-65℃）条件下完成RNA的扩增。
具体步骤为：RTX酶将RNA 逆转录成cDNA，形成RNA-DNA杂交双链结构；然后Bst DNA聚合酶在恒温条件下，以RNA-DNA杂交双链结构为模板，进行DNA的扩增，形成一个新的DNA链。
整个反应过程在一个恒定的温度下进行，避免了传统PCR技术中需要不断变化的温度环节，简化了操作流程。
二、RNA恒温扩增技术的优点1. 操作简便：RNA恒温扩增技术无需复杂的温度周期，只需将反应混合液置于恒温环境中，即可完成扩增反应，操作简单方便。
2. 高效：恒温条件下，RTX酶和Bst DNA聚合酶的协同作用，能够在短时间内完成RNA扩增，反应效率高。
3. 灵敏度高：RNA恒温扩增技术能够在低拷贝数量的目标RNA下实现扩增，对于疾病早期诊断具有重要意义。
4. 适用范围广：RNA恒温扩增技术适用于检测不同种类的RNA，包括病毒RNA、mRNA等，在疾病诊断和基因表达研究中应用广泛。
三、RNA恒温扩增技术的应用1. RNA病毒检测：RNA恒温扩增技术在临床病毒检测中具有重要意义，能够快速、准确地检测病毒RNA，如流感病毒、乙肝病毒等，为临床诊断提供有效支持。
2. 基因表达检测：RNA恒温扩增技术可以用于基因的表达分析，检测特定基因在细胞或组织中的表达水平，对于研究基因功能、疾病机制等具有重要意义。
3. 食品安全监测：RNA恒温扩增技术还可以应用于食品安全领域，检测食品中潜在的病原体或污染物，保障食品安全。
荧光定量等温扩增技术
荧光定量等温扩增技术1荧光定量等温扩增技术概述荧光定量等温扩增技术（Fluorescent Quantitative Isothermal Amplification，FQIA）是一种新型的核酸扩增技术，于近年来迅速发展并广泛应用于病毒病原体和基因检测等领域。
与传统PCR技术相似，FQIA技术可以从相对简单的样品中快速、准确地检测目标核酸，但是该技术不同于PCR技术的是，FQIA技术减少了反应的局限性，可以在非常简单的设备和高度分散的设备上实现，这使得该技术可以广泛应用于野外环境下的核酸检测。
该技术主要借助了一个特殊的酶——Bst酶，它可以在恒温下（通常为55~65℃）完成核酸扩增，不需要复杂的PCR仪器，也不需要特殊的荧光探针或糖基化探针。
该技术还具有检测速度快（20~60分钟）、敏感度高、专属性强、成本低等优点。
这些特点使得FQIA技术成为了快速、准确、高效的核酸检测方法之一。
2FQIA技术的原理FQIA技术是基于Bst聚合酶酶群进行的，使用一个双链螺旋结构的核酸为模板，通过引物引导酶的扩增，在恒定的温度下进行等温扩增。
该技术主要依靠Bst聚合酶酶群通过两个相反的引物引导扩增模板DNA。
其中，引物1是特异的，它从模板的3'端向5'端方向进行鉴别性引导，引物2是非特异的，它由3'端向5'端方向进行非限定性引导，通过引导将目标序列扩增成长链。
而本技术核心的优势就在于引入荧光，以及通过糖基化这样的特殊荧光探针，实现了定量分析。
在FQIA技术中，引物1和引物2与模板DNA特异性结合后，引物1的3'端和2'端之间的酯键被酶水解，释放出一个单核苷酸，转变为一个四碳酸盐根离子，该过程被称为LAMP PCR的初始阶段。
此后，引物2的5'端向上下游延伸，并形成一个绕式的DNA结构，该结构增强了酶的活性，使得引物1再次结合于其外部端，形成一个以3'端向外的环形结构，被称为“DNA环”。
恒温扩增技术的原理与用途探究
恒温扩增技术的原理与用途探究即通过对靶序列的特异性扩增，使其产生大量拷贝，以达到检测水平。
主要包括以下技术。
环介导等温扩增技术，又称为环媒恒温扩增技术或连环恒温扩增技术，是由Notomi等于2000年所开发的一种核酸扩增技术[7]。
LAMP的核心是具有链置换活性的Bst（Bacillusstearothermophilus）DNA聚合酶的应用以及基于靶核酸6个特异性片段（即5’端的F1、F2和F3区和3’端的B3c、B2c和B1c区，其中F2区和B2区为目的扩增片段）的4条特殊引物的设计，分别为上游内部引物（FIP，由F1c区和F2区组成）、下游内部引物（BIP，由B1c区和B2区组成）、上游外部引物（F3，由F3区组成）及下游外部引物（B3，由B3组成）。
整个扩增过程分为起始阶段和循环扩增阶段。
⑴起始阶段：FIP的F2序列首先和模板F2c结合，引领合成互补链；随后，F3与模板F3c结合，在BstDNA聚合酶的作用下启动链置换合成并释放出结合有FIP的完整互补链。
此单链5’端F1c和F1自我碱基配对形成环状结构。
以此链为模版，引物BIP和B3以相同的方式引领另一端链合成、链替换，从而形成哑铃状结构的单链。
F1c末端可自发引领补齐中间单链缺口,使哑铃状单链转化为双链茎环结构。
此产物可作为下一阶段的起始物为LAMP基因的扩增循环提供模板。
⑵循环扩增阶段：引物FIP与茎环结构结合,以双链中一条链为模板延伸,并释放出另一条链,；释出链游离3c端自身成环,引发链延伸取代并释放FIP引领合成的链,两产物均可作为下一循环的起始物。
引物BIP和FIP与上述产物的茎环结合重复以上延伸过程,使产物延长同时释放新的链成环并作为新的起始物。
其最终产物为一系列长度不同的茎环状双链DNA片段。
LAMP灵敏度高、特异性好，且操作简便、快速，结果易于判定，这些优点使得该技术自成立十余年以来在病毒、细菌、寄生虫等各类病原体的基因检测上得到了广泛应用。
等温扩增技术实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握等温扩增技术的原理和操作步骤。
2. 学习利用等温扩增技术对特定靶标进行扩增和检测。
3. 了解等温扩增技术在分子生物学研究中的应用。
二、实验原理等温扩增技术（Isothermal Amplification Technology）是一种在恒定温度下进行核酸扩增的技术。
与传统的PCR技术相比，等温扩增技术具有操作简便、快速、成本低、特异性高等优点。
其原理是利用特定设计的引物和聚合酶在恒定温度下进行核酸扩增，无需热循环，从而实现快速、高效、特异的核酸扩增。
三、实验材料1. 样本：含有靶标基因的DNA样本。
2. 引物：针对靶标基因设计的引物。
3. 聚合酶：等温扩增用聚合酶。
4. 反应体系：缓冲液、dNTPs、引物、聚合酶等。
5. 实验器材：PCR仪、离心机、电泳仪、凝胶成像系统等。
四、实验步骤1. 引物设计：根据靶标基因的序列设计引物，确保引物特异性高、Tm值相近。
2. 反应体系配置：按照实验要求，配置反应体系，包括缓冲液、dNTPs、引物、聚合酶等。
3. 反应：将配置好的反应体系加入PCR管中，放入PCR仪进行等温扩增。
反应温度根据所使用的聚合酶和引物进行优化。
4. 扩增产物检测：将扩增产物进行电泳分析，观察扩增结果。
5. 结果分析：根据电泳结果，判断靶标基因是否存在，并进行定量分析。
五、实验结果与分析1. 扩增结果：根据电泳结果，观察到扩增产物条带，说明等温扩增成功。
2. 特异性分析：通过设置阴性对照和阳性对照，验证扩增结果的特异性。
3. 定量分析：通过比较扩增产物条带的亮度，对靶标基因进行定量分析。
六、实验讨论1. 引物设计：引物设计是等温扩增技术成功的关键。
引物设计时应考虑引物长度、Tm值、GC含量等因素，以确保扩增结果的特异性。
2. 反应体系优化：反应体系中的各种成分比例对扩增结果有较大影响。
在实验过程中，应优化反应体系，以提高扩增效率和特异性。
3. 扩增温度优化：不同聚合酶对温度的敏感度不同，因此在实验过程中，需要根据所使用的聚合酶和引物优化扩增温度。
era等温扩增技术原理
era等温扩增技术原理
ERA等温扩增技术，全称为酶促重组等温扩增技术，通过模拟生物体遗传物质自身扩增复制的原理，将来源于细菌、病毒和噬菌体的特定重组酶、外切酶、聚合酶等多酶体系进行改造突变并筛选其功能，再通过不同的核酸扩增反应体系进行优化组合，从而获得核心的重组等温扩增体系。
在37-42℃恒温条件下，该技术可以将微量DNA/RNA的特异性区段在数分钟内扩增数十亿倍。
其反应原理如下：
1. 重组酶首先与上下游引物结合，寻找同源双链DNA，一旦定位发生链交换。
2. 同时SSB蛋白与亲本链绑定，阻止其与其脱离的模板链发生相互作用。
3. DNA聚合酶从上下游引物的3'端启动合成，形成两条双链DNA，如此循环重复扩增。
该技术广泛应用于公共卫生领域，针对致病微生物、动物源性成分和转基因农产品进行快速现场检测，以及农业生产领域，针对水产、畜牧养殖和宠物中各类病原，进行早期快速检测和诊断。
以上内容仅供参考，如需更多信息，建议查阅相关文献或咨询相关学者。
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摘要：恒温扩增技术是继PCR技术后发展起来的一门新型的体外核酸扩增技术。
目前主要的恒温扩增技术有：滚环核酸扩增、环介导等温扩增、链替代扩增、依赖核酸序列扩增和解链酶扩增。
它们都具有共同的特点：恒温、高效、特异、不需要特殊的仪器设备。
本文就现阶段恒温扩增技术的特点及其在动物疫病检测中的应用情况和前景做一综述。
关键词：恒温扩增；PCR引言：近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，基于核酸检测的诊断方法已大量建立并广泛应用于动物疾病的实验室检测中，恒温扩增技术就是在此背景下出现的。
与其它的核酸扩增技术相比，恒温扩增有快速、高效、特异的优点且无需专用设备。
所以它一经出现就被许多学者认为是一种有可能与PCR 媲美的检测方法，目前主要的恒温扩增技术有：滚环核酸扩增（rolling circle amolification，RCA）、环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、链替代扩增（strand displacement amplification，SDA）、依赖核酸序列扩增（nucleicacid sequence based amplification，NASBA）和解链酶扩增（helix dependent amplification，HAD），这些技术各有特点，这也决定了它们在动物疾病检测中的应用情况，下面就它们的原理、特点及其在动物疫病检测中的应用情况进行综述。
1滚环核酸扩增1. 1 滚环核酸扩增的原理滚环核酸扩增（rolling circleamolification, RCA）是通过借鉴病原生物体滚环复制DNA 的方式而提出的[1]，可分为线性扩增与指数扩增两种形式。
线性RCA 是引物结合到环状DNA 上后，在DNA 聚合酶作用下被延伸，产物是具有大量重复序列（与环状DNA 完全互补）的线状单链。
线性RCA 用于靶核酸扩增仅限于一些具有环状核酸的病毒、质粒和环状染色体，线性扩增倍数为105。
指数RCA 原理与线性RCA 相同，采用与环状DNA 序列完全一致的第二种引物，该引物与第一次线性RCA 产物结合并酶促延伸，其产物又作为第一种探针的模板，这样一来在很短的时间内（1h），产物呈指数递增。
指数RCA 可用于非环状DNA 的扩增，增倍数能达107[2]。
1. 2 滚环核酸扩增的优势与不足RCA 的优势：(1) 高灵敏度。
RCA有很强的扩增能力，线性RCA 的效率可达到l05 倍，而指数RCA 的效率可达到109 倍，这一高灵敏度特性使其能够检测到单拷贝水平[3]；(2)高序列特异性。
可以区分单一位点的不同模式；(3) 扩增产物经过磷酸化处理后可以直接用来测序。
(4)高通量。
RCA 可以在靶目标上形成闭合的环状序列，确保RCA 产生的信号集中在一点，从而实现原位扩增和载片扩增； RCA 只要保证探针的识别段序列与靶序列互补，不需要考虑靶序列的性质，因此检测RNA 时不再需要预先进行RNA 的逆转录。
RCA 的不足：（1）锁式探针常接近100bp，合成费用较高。
2000 年，Antson DO 等采用PCR 方法在实验室合成探针，可以在很大程度上降低成本；（2）信号检测时的背景问题。
在RCA 反应过程中未成环的锁式探针和未结合探针的模板DNA 或者RNA 可能产生一些背景信号。
1. 3 滚环核酸扩增在畜牧生产中的应用虽然可以通过一些方法部分克服RCA 的不足，但也进一步增加了反应成本，使得RCA 在动物疾病的临床检测中不适合被采用。
2 环介导等温扩增2. 1 环介导等温扩增的原理环介导等温扩增其扩增原理是基于DNA 在65℃左右处于动态平衡状态，任何一个引物向双链DNA 的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链，在此前提下利用4 种不同的特异性引物识别靶基因的6 个特定区域，在链置换型DNA 聚合酶的作用下，以外侧引物区段的3’末端为起点，与模板DNA 互补序列配对，启动链置换DNA合成[4]。
2. 2 环介导等温扩增的优势与不足LAMP 的优势：（1）扩增效率高，能够在1h 内有效的扩增1-10 个拷贝的目的基因，扩增效率为普通PCR的10 倍-100 倍；（2）反应时间短，特异性强，不需要特殊的设备。
LAMP 的不足：（1）对引物的要求特别高；（2）扩增产物不能用于克隆测序，只能用于判断；（3）由于其敏感性强，特别容易形成气溶胶，造成假阳性影响检测结果。
2. 3 环介导等温扩增技术在动物疾病检测中的应用LAMP 技术从诞生之日起就被认为是最有可能代替PCR 进行实验室检测的方法。
2008 年Anne-Lie B 等应用RT-LAMP建立了猪水疱病病毒(SVDV)的诊断方法[5]，该方法对血清样本的敏感性相当于实时PCR，对粪便样品的敏感性优于实时PCR。
3链置换扩增3. 1 链置换扩增的原理链置换扩增其原理是基于在靶DNA 两端带有被化学修饰的限制性核酸内切酶识别序列，核酸内切酶在其识别位点将链DNA 打开缺口，DNA 聚合酶延伸缺口3’端并替换下一条DNA 链[6]。
被替换下来的DNA 单链可与引物结合并被DNA聚合酶延伸成双链。
该过程不断反复进行，使靶序列被高效扩增。
SDA 的基本系统包括一种限制性核酸内切酶、一种具有链置换活性的DNA 聚合酶、两对引物、dNTP 以及钙、镁离子和缓冲系统。
3. 2 链置换扩增技术的优势与不足SDA 的优点：（1）扩增效率高，据Walker 等人的报道，采用SDA 扩增结核分枝杆菌总DNA 中的一段序列时，37℃反应2 小时后，可将靶序列扩增106 倍[7]；（2）反应时间短，特异性强，不需要特殊的设备。
SDA 的不足：（1）SDA 产物不均一。
在SDA 循环中总要产生一些单、双链产物，用电泳法检测时必然要出现拖尾现象。
（2）SDA 产物不可能直接用于克隆，测序和表达。
使得SDA 在基因工程方面没有优势；（3）SDA 产物的检测手段有待提高。
目前SDA 产物检测的主导方法是荧光偏振检测，但该检测方法需要特殊的检测仪器---- 荧光分光光度计，这限制了SDA 在临床的广泛应用。
3. 2 链置换扩增在动物疫病检测中的应用当前SDA 方法主要应用于分枝杆菌核酸定性检测、病毒体外进化研究[23]和芯片杂交等方面，还没有运用于动物疫病的检测。
4 依赖核酸序列扩增4. 1 依赖核酸序列扩增的原理依赖核酸序列扩增(NASBA)是在PCR 基础上发展起来的一种新技术。
是由1 对带有T7 启动子序列的引物引导的连续、等温、基于酶反应的核酸扩增技术，反应在41℃进行，可在2 h 内将模板RNA 扩增109 倍[8]，比常规PCR 法高1000 倍。
4. 2 依赖核酸序列扩增的优势与不足NASBA 技术的优势在于对RNA 病毒的检测，因为：（1）它的引物上带有T7 启动子序列，而外来双链DNA 无T7 启动子序列，不可能被扩增，因此在有DNA 污染的条件下，NASBA 技术同样具有较高的特异性和灵敏度[9]；（2）NASBA 将反转录过程直接合并到扩增反应中，缩短了反应时间。
NASBA 也存在许多缺陷：（1）反应成分比较复杂；（2）需要3 种酶使得反应成本较高；（3）对DNA 病毒的检测上NASBA 就显得不是那么适合。
4. 3 依赖核酸序列扩增在动物疫病检测中的应用NASBA 与LAMP 一样在恒温扩增技术中是相对成熟技术，现在已应用于动物疫病检测中。
我国2004 年发布的8 项禽流感系列标准中，有两项应用了NASBA 检测方法，即GB／T19439-2004~H5 亚型禽流感病毒NASBA 检测方法》和GB／Tl9440-2004《禽流感病毒NASBA 检测方法》[10]。
6 小结动物疫病的检测是一项特殊的检测工作，它一方面需要快速、准确的检测结果，另一方面对检测的成本也有着苛刻的要求。
而恒温扩增技术在很大程度上符合了它的需要，虽然说当前把恒温扩增技术运用于动物疫病的检测还有着不少的缺陷，但它的优越性也是有目共睹的，特别是其中的LAMP 和NASBA 已经逐渐开始运用到动物疫病的检测中。
我们相信通过对恒温扩增技术的不断完善，它必然会和PCR 技术一样成为动物疫病检测中不可缺少的检测手段。
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