植物细胞悬浮培养及次生代谢产物生产.pptx
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植物细胞工程课件第六章植物细胞次生产物生产
centrifuge isolation 80rpm
subculture
成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件：
• 悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在 30～50个细胞以下，在实际培养中很少有完全由 单细胞组成的植物细胞悬浮系。
• 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬 浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮， 细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。
6.1.1 次生产物的主要类型
• 按照用途主要分为色素、香精、药物和 酶等；
• 按照分子结构包括生物碱、类黄酮、香 豆素、蒽醌、萜类、甾体、蛋白质和多 肽等化合物。
• 已知的植物次生代谢产物大约有100 000 种， 并且每年大约还有4 000 种新的化合物被发现。
• 植物次生代谢物质中含有许多药用成分，现代 药物中大约有25 %来自于植物。
饥饿法：饥饿也是调整细胞同步化的方法之一。 在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧 失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在 某一分裂时期，当在培养基中加入所缺乏的成分 或者将饥饿细胞转入完整培养基中继代培养时， 则细胞分裂又可重新恢复。
饥饿导致的细胞分裂受阻常常是使细胞不能合 成DNA，即不能进入S期，或细胞分裂不能进行，即 不能进入M期。因此，通过饥饿法可以获得处于G1和 G2期的同步化细胞。
物质产合物成合的成植在物细细胞胞生，长托停品止类以生后物。碱如类紫合草成 的植宁物的细合胞成等。属于此类型；
植物细胞生长于次生产物积累的相关性（引自Endress R，1994 ）
I组 II组 III组
IV组
培养植物种属
单冠毛菊 玫瑰 曼陀罗属、莨菪属 穿心莲属 巴戟天属
杨属 胡萝卜属
长春花属 烟草属 藜属、商陆属 唐松草属 薯蓣属 白屈菜属 药鼠李
subculture
成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件：
• 悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在 30～50个细胞以下，在实际培养中很少有完全由 单细胞组成的植物细胞悬浮系。
• 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬 浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮， 细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。
6.1.1 次生产物的主要类型
• 按照用途主要分为色素、香精、药物和 酶等；
• 按照分子结构包括生物碱、类黄酮、香 豆素、蒽醌、萜类、甾体、蛋白质和多 肽等化合物。
• 已知的植物次生代谢产物大约有100 000 种， 并且每年大约还有4 000 种新的化合物被发现。
• 植物次生代谢物质中含有许多药用成分，现代 药物中大约有25 %来自于植物。
饥饿法：饥饿也是调整细胞同步化的方法之一。 在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧 失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在 某一分裂时期，当在培养基中加入所缺乏的成分 或者将饥饿细胞转入完整培养基中继代培养时， 则细胞分裂又可重新恢复。
饥饿导致的细胞分裂受阻常常是使细胞不能合 成DNA，即不能进入S期，或细胞分裂不能进行，即 不能进入M期。因此，通过饥饿法可以获得处于G1和 G2期的同步化细胞。
物质产合物成合的成植在物细细胞胞生，长托停品止类以生后物。碱如类紫合草成 的植宁物的细合胞成等。属于此类型；
植物细胞生长于次生产物积累的相关性（引自Endress R，1994 ）
I组 II组 III组
IV组
培养植物种属
单冠毛菊 玫瑰 曼陀罗属、莨菪属 穿心莲属 巴戟天属
杨属 胡萝卜属
长春花属 烟草属 藜属、商陆属 唐松草属 薯蓣属 白屈菜属 药鼠李
植物细胞悬浮培养及次生代谢产物生产
1.1 植物代谢产物 （1）初生代谢：为维持植物正常的生长发育所必
须的代谢。初生代谢过程中形成的各种产物为初 生代谢产物。初生代谢产物不稳定，在体内容易 发生转化。
（2）次生代谢：建立在初生代谢基础上，对于植
物的正常生长发育非必需的代谢，其代谢产物为 次生代谢产物，次生代谢产物是末端代谢产物， 比较稳定，可以在体内积累。
次生代谢产物的应用：色素、香料、药物、添加 剂、工业原料等。
紫杉醇简介
• 紫杉醇：二萜类化合物 • 最早由太平洋红豆杉Taxus brevifolia的树皮中分
离 • 广泛用于治疗卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌
等十几种癌症 • 目前主要来源于红豆杉属植物
市场需求
抗癌一线用药
销售额年增长率5亿美元
480 350
1000 780
620
200
0 2000年
2002年
2004年
需求量
图1：国际紫杉醇原料药需求走势图（单位：公斤）
药源问题
• 红豆杉
主要原料植物 国家一级保护野生植物，全球十大濒危物 种之一
• 生长缓慢 分布有限 Taxol含量低
树皮中Taxol含量:0.00001-0.069% 3000棵树=10吨树皮=1kg Taxol=500病人
理论需求量
2g /人, 500万人/年 1000kg/年
实际销量
350 kg/年
紫杉醇供需相差十分悬殊
30
25 5
12
10 6.6
5
3.4
0.8
0
1992 1994 1995 1998 1999 2000 2001 2002
图2：国际紫杉醇销售额（亿美元）
1000 800 600 400 300
植物细胞培养与次生产物代谢生产PPT讲稿
悬浮培养不能对某一细胞进行定点观 察和分析，也就不能进行定点选择。因此 ，在进行细胞株（种子细胞）选择和需要 对细胞活动跟踪观察的情况下，必须进行 真正意义上的单细胞培养。由于植物细胞 的团聚性，单细胞培养还比较困难。
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1、细胞平板培养
平板培养(plate culture)：将一定密度的悬浮细
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生物反应器
当前你正在浏览到的事第三十三页PPTT，共八十页。ห้องสมุดไป่ตู้
Stirred Tank Bioreactors
An external motor is used to
agitate the growth medium with impellers. Sterile air or combinations of gases can be introduced (sparkling)
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3、微室培养 它可对单细胞进行活体连续
观察。这一方法也可用于原
生质体培养观察细胞壁的再
生和细胞分裂过程。
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4、双层滤纸培养
Horsch等（1980）将平板培养与饲养层培
养技术相结合，建立了双层滤纸植板培养方法 。
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植物细胞培养具有周期长、细胞抗剪切能力 弱、易团聚等特点。同时，植物细胞规模培养 的目的是生产天然产物，所以，植物细胞培养 反应器的设计不仅要考虑有利于细胞生长，还 要考虑有利于产物的积累和分离。
总体上，适合植物细胞培养的反应器应具 有适宜的氧传递、良好的流动性和较低的剪切 力。
植物细胞培养与次生产物生产
第三节 植物细胞规模化培养
概述
规模化培养体系建立
生物反应器
规模化培养的技术问题
一、 概 述
在植物生物技术中，应用培养细胞系统合成有用的 天然产物，很可能发展成为一个广义的化学工业的 一个组成部分。长期以来，植物一直是许多化学品 的主要资源，特别在制药和食品加工业中更是不可 缺少。据不完全统计，至少有20％左右的药物是由 植物衍生而来的，而且每年都可发现许多植物来源 的新化合物。
大规模培养体系建立
种子细胞选择
外植体选择
高产细胞选择
植物类型：植物细胞的遗传基础是天然产物生产的基本 影响因素，不同植物产生的天然产物种类之所以不同， 从根本上来说是因为它们具有不同的遗传基础。在确定 生产某一种化合物以后，首先必须准确选择那些能够产 生目的化合物的植物种类及其品种或单株。
组织器官：由于天然产物一般为次生代谢产物，而植物 次生代谢产物的积累具有组织器官特异性，因此，在起 始细胞培养时应尽量选择自然状态下产生天然产物的器 官、组织为外植体。
悬浮培养与固体培养比较有三个优点：
一是增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养 供应；
二是在振荡条件下可避免细胞代谢产生的有害物 质在局部积累而对细胞自身产生毒害；
三是振荡培养可以适当改善气体的交换。
愈伤组织诱导
悬浮系的建立与继代培养
悬浮细胞的生长动态 悬浮细胞同步化
一. 愈伤组织诱导
愈伤组织的要求：松散性好、增殖快、再生能力强。其 外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状， 疏松易碎。
单细胞的分离：通过过滤出去大的细胞团，小细胞团一般采用酶分离法，小细胞团不能 超过6个细胞，因此过滤时网筛的网眼要选择合适。
单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗涤2次以后，调整密度为
次生代谢产物 PPT
植物细胞培养 之次生代谢产物生产
大家好
1
植物次生代谢产物的概述 研究现状 植物细胞大规模培养生产次生代谢
产物的基本程序 提高次生代谢物生产效率的途径与
方法 应用实例 前景展望
大家好
2
植物次生代谢产物是指植物中一大类并 非植物生长发育所必需的小分子有机化 合物，其产生和分布通常有种属、器官 组织和生长发育期的特异性。
大家好
22
pH：培养基的pH值与细胞生长繁殖以及次生 代谢产物的生产关系密切，与培养温度相似， 细胞的生长繁殖与次生代谢产物合成时所需 的pH值通常并不一致，需要在不同的阶段控 制不同的pH值。
电场：膜周电泳学说认为对细胞施加稳定的 电场能够导致膜中带电物质的重新分配，最 终导致原生质体生长和分化效应。
大家好
21
合适的培养条件
物理因素：
温度：植物细胞培养的最适温度一般为 25℃，但不同的植物种类略有差异，而 且植物细胞生长和次生代谢产物的合成 所需的温度并不一致，因此选择合理的 培养温度并进行相应的调控对于细胞生 长以及产物合成十分关键。
光照：光强、光质和光照时间对细胞的 生长和次生代谢产物的合成都具有一定 的影响。不同的光照情况要根据不同的 植物细胞来设定。
大家好
16
因此充分利用基因工程的手段，筛选高 产细胞系，深入研究特定代谢产物的生 物合成途径，对培养条件进行优化，研 究和开发适合植物细胞培养的生物反应 器是解决这些问题的根本途径。
大家好
17
提高次生代谢产物生产效 率的途径和方法：
选择合适的外植体 筛选得到高产细胞系（株） 寻求合适的培养条件和培养技术
大家好
10
植物次生代谢产品的市场潜能
大家好
大家好
1
植物次生代谢产物的概述 研究现状 植物细胞大规模培养生产次生代谢
产物的基本程序 提高次生代谢物生产效率的途径与
方法 应用实例 前景展望
大家好
2
植物次生代谢产物是指植物中一大类并 非植物生长发育所必需的小分子有机化 合物，其产生和分布通常有种属、器官 组织和生长发育期的特异性。
大家好
22
pH：培养基的pH值与细胞生长繁殖以及次生 代谢产物的生产关系密切，与培养温度相似， 细胞的生长繁殖与次生代谢产物合成时所需 的pH值通常并不一致，需要在不同的阶段控 制不同的pH值。
电场：膜周电泳学说认为对细胞施加稳定的 电场能够导致膜中带电物质的重新分配，最 终导致原生质体生长和分化效应。
大家好
21
合适的培养条件
物理因素：
温度：植物细胞培养的最适温度一般为 25℃，但不同的植物种类略有差异，而 且植物细胞生长和次生代谢产物的合成 所需的温度并不一致，因此选择合理的 培养温度并进行相应的调控对于细胞生 长以及产物合成十分关键。
光照：光强、光质和光照时间对细胞的 生长和次生代谢产物的合成都具有一定 的影响。不同的光照情况要根据不同的 植物细胞来设定。
大家好
16
因此充分利用基因工程的手段，筛选高 产细胞系，深入研究特定代谢产物的生 物合成途径，对培养条件进行优化，研 究和开发适合植物细胞培养的生物反应 器是解决这些问题的根本途径。
大家好
17
提高次生代谢产物生产效 率的途径和方法：
选择合适的外植体 筛选得到高产细胞系（株） 寻求合适的培养条件和培养技术
大家好
10
植物次生代谢产品的市场潜能
大家好
植物次生代谢产物生产.ppt
诱导子能增强细胞的呼吸作用, 提供产生次生代谢产物的 能量, 使细胞结构发生变化, 利于代谢物的形成、运输和积累。 目前应用最广、研究最多的是真菌诱导子, 如张长平等在红 豆杉细胞悬浮培养体系中加入真菌诱导子, 结果发现, 紫杉醇 的合成被加强, 产量得到了显著提高。 除真菌诱导子外, 目前在提高植物次生代谢产物方面研究得 较多的还包括寡糖素、茉莉酸类、金属离子和紫外光等.金属 离子作为诱导子主要有Cu2+ 、Ca2+ 、Mg2+等。 孙彬贤等以南方红豆杉悬浮细胞为材料, 在悬浮细胞中加入 茉莉酸甲酯, 紫杉醇含量提高了10倍。
产次生代谢产物时, 对光质和光量的要求是不同的, 如玫 瑰茄悬浮细胞合成花青素时, 蓝光是促进玫瑰茄细胞产生 花青素的最有效单色光, 产量为416 mg/ L, 和全色光差 不多, 红光和橙光无效, 其他单色光随其波长接近蓝光, 正 效应增强。
pH值：植物细胞培养的最适宜pH 值在5-6 之间,但也存在
4.3 前体饲喂
前体指处于目标代谢物代谢途径中上游的物质。上游化合 物作为酶的底物，其浓度高低决定了催化反应速度的大小 ，浓度高则反应速度大。加入前体可以消除关键酶的阻碍 或阻断内源性中间体的分隔和有效贮存，利于次生代谢物 的生产。
• 向银杏培养基中添加异戊二烯等前体物质, 有效地提高了 银杏内酯B 的产量.
• 解决植物细胞培养生产次生代谢物含量低的最有效的手段之一是 筛选高产细胞株。用来筛选的细胞来源可以是有足够生理和形态 异质性的细胞群，也可以是通过物理或化学因子诱变处理产生的 突变体群。
• 筛选方法:目测法,放射免疫法、酶联免疫法、流动细胞测定法、 琼脂小块法等。
3. 物理因素
光照：对次生代谢产物的合成有重要影响. 不同植物细胞生
药用植物细胞悬浮培养生产次生代谢产物的研究
1.2.4.愈伤组织的诱导
• 选择适宜的外植体：幼胚、下胚轴、子叶。 • 选择适宜的培养基：较高激素浓度；必要的附加 物质
• 要求：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观一般 是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松 易碎
1.2.5.悬浮系的建立与培养
悬浮培养的基本形式
1.分批培养：将愈伤组织培养在一定容积 的密闭容器中，最后一次收获的培养方 式。 2.连续培养：将愈伤组织培养在一个恒定 容积的流动系统中，以使培养系统中的 细胞数量和营养状态保持稳定。【3】 --流动系统：一方面以一定速率不断地加 入新的培养基，另一方面又以相同的速 率流出培养物(菌体和代谢产物)
但要进行下一批培养，则生长一定时间
后，需要继代转移。
开放式和封闭式区别
封闭式中：排出液中的细胞用机械方法 （离心）收集后，又放入原培养基，所 以其培养细胞数目不断增加
开放式中：在注入新鲜培养基的同时， 培养细胞随同培养液一起流出，培养细 胞数目保持恒定
通过调节流入和流出的速度，使培养
物的生长速度永远保持接近最高值的恒 定水平上
• 培养方式：摇瓶，反应器（气动式、搅拌 式）；分批培养，半连续培养和连续培养 • 温度： 最适25℃ • 继代周期
–指具有一定起始密度的细胞,从开始培 养到细胞数目和总重量增长停止的一个 过程。 –培养周期的长短是由起始细胞密度、延 迟期的长短、生长速率等决定。 –继代培养（Subculture）：继初代培养 之后的连续数代的扩繁殖培养过程。
• 1.2.1.悬浮培养的特点
(1). 培养细胞可不断增殖，且生长速
度快。 (2). 液体状态下便于细胞和营养物质 的充分接触和交换，细胞状态可以相对 保持一致。
第五章 植物细胞培养及次生代谢产物生产
产物含量％干重表示：产物占愈伤组织干 重的百分比。
产物产量：每升培养基生产的产物量（mg)。
悬浮培养细胞的同步化
1、分选法 梯度离心；Ficoll；流式细胞仪 2、饥饿法 3、抑制剂法 FdU，HU 4、低温处理 低温处理抑制细胞分裂，再把温度提高到正常的
培养温度，也可达到部分同步化。
第二节 单细胞培养
1、平板培养（plating culture)：将一定密度 悬浮细胞接种到一薄层固体培养基中进 行培养的技术。
2、看护培养（nurse culture) 3、微室培养（micro-chamber culture) 4、其它：饲养层培养技术、双层滤纸植板
培养技术
第三节 植物细胞的规模培养
20%左右的药物由植物衍生 已有30多种化合物在培养物中积累接近或超
前体及诱导子的作用
• 前体作用：细胞培养物中加入前体，可 减弱限速酶作用，促进次生代谢物生产。
• 诱导子（elicitor):一类能引起植物细胞代 谢强度改变或代谢途径改变的物质，主 要指生物来源的化合物，如寡糖、多糖 等。
常用诱导子：真菌诱导子、茉莉酸及其甲 酯、水杨酸等。
培养物最佳转移时间和采收时间
20世纪50年代—— 德、美、英、加拿大 由烟草、蔬菜细胞培养开始，80年代后集 中于药用植物的组培、药用成分的研究。
日本：80年代末，Nitto Denko公司在20kl生物反 应器中实现紫草和人参的大规模细胞培养，以 获得紫草素和人参皂苷，首先作为天然食品添 加剂进入市场。
国内研究成果
国内研究集中于药用植物 20世纪60年代，罗士韦首先开展人参的组培。 1980年起，植物所叶和春主持国家攻关植物
悬浮细胞系的建立
成功的悬浮细胞系： 1、悬浮培养物分散性良好，细胞团较小。 2、均一性好：细胞形状和细胞团大小大致
产物产量：每升培养基生产的产物量（mg)。
悬浮培养细胞的同步化
1、分选法 梯度离心；Ficoll；流式细胞仪 2、饥饿法 3、抑制剂法 FdU，HU 4、低温处理 低温处理抑制细胞分裂，再把温度提高到正常的
培养温度，也可达到部分同步化。
第二节 单细胞培养
1、平板培养（plating culture)：将一定密度 悬浮细胞接种到一薄层固体培养基中进 行培养的技术。
2、看护培养（nurse culture) 3、微室培养（micro-chamber culture) 4、其它：饲养层培养技术、双层滤纸植板
培养技术
第三节 植物细胞的规模培养
20%左右的药物由植物衍生 已有30多种化合物在培养物中积累接近或超
前体及诱导子的作用
• 前体作用：细胞培养物中加入前体，可 减弱限速酶作用，促进次生代谢物生产。
• 诱导子（elicitor):一类能引起植物细胞代 谢强度改变或代谢途径改变的物质，主 要指生物来源的化合物，如寡糖、多糖 等。
常用诱导子：真菌诱导子、茉莉酸及其甲 酯、水杨酸等。
培养物最佳转移时间和采收时间
20世纪50年代—— 德、美、英、加拿大 由烟草、蔬菜细胞培养开始，80年代后集 中于药用植物的组培、药用成分的研究。
日本：80年代末，Nitto Denko公司在20kl生物反 应器中实现紫草和人参的大规模细胞培养，以 获得紫草素和人参皂苷，首先作为天然食品添 加剂进入市场。
国内研究成果
国内研究集中于药用植物 20世纪60年代，罗士韦首先开展人参的组培。 1980年起，植物所叶和春主持国家攻关植物
悬浮细胞系的建立
成功的悬浮细胞系： 1、悬浮培养物分散性良好，细胞团较小。 2、均一性好：细胞形状和细胞团大小大致
植物细胞培养和次生产物制备PPT讲稿
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1、愈伤组织诱导
要求：松散性好，增殖快，再生能力强。其外观一 般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，松散易碎。
适于悬浮培养
适于再生植株
现在您浏览的位置是第十六页，共七十六页。
如何获得符合要求的愈伤组织？
1、选择适宜的外植体：胚、胚轴、子叶
是最常用的外植体，特别是幼胚。
➢ 发根农杆菌感染双子夜植物，RI质粒诱导产生毛状根。 ➢ 形态方面：Ri质粒诱导快速生长的、非定向性、高分支的
毛状根的形成
➢代谢方面：Ri质粒转化根能合成与原植物相同或相
似的次生代谢物，并且发根合成次生代谢物具有遗 传稳定性。
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➢ 毛状根生长快速和次级代谢产物含量高，特别适用于从
现在您浏览的位置是第十八页，共七十六页。
成功的悬浮细胞培养体系必须满足3个条件： 1、浮悬培养物分散性良好，细胞团较小，一
般在 30～50个细胞以下，在实际培养中 很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系 。
2、均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相
同，悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养 基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡 黄色。 3、细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般 2～3天甚至更短时间便可增加1倍。
稳定期：细胞数稳定。细胞高液泡化，极度脆弱，高
度分化及有机化合物的高浓度。
现在您浏览的位置是第三页，共七十六页。
➢ （1）植物细胞有独特的培养时间及特征：重量的增加在
对数期，次生代谢产物在稳定期积累
➢ （2）植物细胞很少单一细胞生长，对数生长后期分泌量
蛋白和粘多糖，以非均相集合的细胞团悬浮生长。
➢ （3）植物细胞好气，培养过程中需供气及搅拌，但
1、愈伤组织诱导
要求：松散性好，增殖快，再生能力强。其外观一 般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，松散易碎。
适于悬浮培养
适于再生植株
现在您浏览的位置是第十六页，共七十六页。
如何获得符合要求的愈伤组织？
1、选择适宜的外植体：胚、胚轴、子叶
是最常用的外植体，特别是幼胚。
➢ 发根农杆菌感染双子夜植物，RI质粒诱导产生毛状根。 ➢ 形态方面：Ri质粒诱导快速生长的、非定向性、高分支的
毛状根的形成
➢代谢方面：Ri质粒转化根能合成与原植物相同或相
似的次生代谢物，并且发根合成次生代谢物具有遗 传稳定性。
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➢ 毛状根生长快速和次级代谢产物含量高，特别适用于从
现在您浏览的位置是第十八页，共七十六页。
成功的悬浮细胞培养体系必须满足3个条件： 1、浮悬培养物分散性良好，细胞团较小，一
般在 30～50个细胞以下，在实际培养中 很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系 。
2、均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相
同，悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养 基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡 黄色。 3、细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般 2～3天甚至更短时间便可增加1倍。
稳定期：细胞数稳定。细胞高液泡化，极度脆弱，高
度分化及有机化合物的高浓度。
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➢ （1）植物细胞有独特的培养时间及特征：重量的增加在
对数期，次生代谢产物在稳定期积累
➢ （2）植物细胞很少单一细胞生长，对数生长后期分泌量
蛋白和粘多糖，以非均相集合的细胞团悬浮生长。
➢ （3）植物细胞好气，培养过程中需供气及搅拌，但
修改第七章细胞培养及次生代谢物生产ppt课件
悬浮细胞的继代与选择方法: 方法1---将培养物摇匀，静止片刻，用吸管吸取培养基中
部的培养物。 方法2---通过过滤收集到小细胞团进行继代培养。 另外，在更换培养基时，弃去底部的愈伤组织块和大细胞
团，只保留小细胞团在瓶内，加入新鲜培养基。
4. 悬浮细胞的同步化 经过多次继代和筛选得到的悬浮细胞系均一性是相对的，需要
（2）抑制法 通过使用DNA合成抑制剂如 5一氨基尿嘧啶、氟脱氧尿核
苷（FUdR）、羟基脲和胸腺嘧啶脱氧核苷等使培养细胞同步化。 细胞受到这些抑制剂处理后，细胞周期被阻断在G1期，细胞都 滞留在G1期和S期。去掉抑制剂后，细胞即进人同步分裂和生 长。
5. 影响细胞悬浮的因素 （1） 培养材料 1、用于诱导愈伤组织的外植体类型和基因型以及用于悬浮培 养的初始愈伤组织材料均对细胞悬浮体系的建立均有较大影响。 2、外植体的类型及生理状况对愈伤组织的诱导十分关键。植 物常用的外植体幼幼胚、成熟胚、下胚轴、子叶、叶片、幼穗 和花药等。
第三节 植物细胞的规模培养
利用植物细胞大规模培养技术为植物有用代谢产物的生 产提供了有效途径和生产方法。主要集中在制药工业中一些价 格高、产量低、需求量大的化合物上如紫杉醇、长春碱、青蒿 素等 。植物大规模细胞培养技术已在农业、医药、食品、化 妆品、香料等领域广泛用于生产有价值的产品。人类迄今通过 植物细胞培养获得的生物碱、维生素、色素、抗生素以及抗肿 瘤药物不下50多个大类。
1、悬浮培养物分散性良好;细胞团较小。 2、均一性好,细胞形状和细胞团大小大致相同。 3、生长迅速，细胞分裂旺盛一般在2-3d其生长量就能增加一 倍。
1. 疏松愈伤组织的诱导 不同的培养基可以使愈伤组织具有不同的生长速度,结构可
松可紧,利用这些特性可使之分散成为单细胞或很小的细胞团。诱 导出松散易碎的愈伤组织对后来建立悬浮细胞系可以起到事半功倍 的效果。
高中生物精品资源第四章 植物细胞培养与次生代谢产物的生产课件高中生物竞赛
•世界现代制药工业起步于第二次世界大战后的国际经济复兴。 •药品的巨大的社会效益和经济效益，刺激了制药工业在50-70年代以较高
的速度蓬勃发展。
药用植物及其制成保健食品、化妆品等每年进,药用植物细胞大量培养技术正成为 国际上名贵珍稀天然药物开发的新目标,目前已经从400多种植物建立了组 织和细胞培养体系,从中分离出600多种代谢产物,其中40多种化合物在数量 上超过或等于原植物
玫瑰鲜花在清晨摘下后24小时内即取出黄褐色的玫瑰精油，大约五吨 重的花朵只能提炼出两磅的玫瑰油，所以是全世界最贵的精油之一
茉莉精油被称为“精油之王”。茉莉精油产量 极少因而十分昂贵，其具有高雅气味，可舒缓 郁闷情绪、振奋精神、提升自信心，同时可护 理和善肌肤干燥、缺水、过油及敏感的状况， 淡化妊娠纹与疤痕，增加皮肤弹性，让肌肤倍 感柔嫩。
悬浮培养基本分为：分批式、流加式、连续式、半连续式培养
1)分批培养(batch culture) 是指在培养过程中，既不向系统中补加培养基， 也不从系统中排出培养物（包括培养基和细胞），也就是说一次性加入培养 基，在一定条件下培养一段时间后，一次性收获。
国内外细胞培养的研究进展
1）重点放在细胞培养上（过去） 细胞培养的优点是生物量生长快，但也有次生代谢产物的含量不稳定
和不易与大田栽培接轨等明显的缺点。
2）植物组织和器官培养具有更重要的意义。
初级代谢物、次生代谢物对细胞、植物的意义 植物合成次生代谢产物的目的是其自身生理代谢的需要，在细胞阶段，往往不 需要合成，但到了组织和器官阶段，合成的需要就会加强。因此，培养药用植 物的组织和器官，更容易获得次生代谢产物。
第四章 植物组织培养生产次生代谢产物
一、植物组织培养生产次生代谢物质的目的意义 二、植物细胞培养生产次生代谢产物
的速度蓬勃发展。
药用植物及其制成保健食品、化妆品等每年进,药用植物细胞大量培养技术正成为 国际上名贵珍稀天然药物开发的新目标,目前已经从400多种植物建立了组 织和细胞培养体系,从中分离出600多种代谢产物,其中40多种化合物在数量 上超过或等于原植物
玫瑰鲜花在清晨摘下后24小时内即取出黄褐色的玫瑰精油，大约五吨 重的花朵只能提炼出两磅的玫瑰油，所以是全世界最贵的精油之一
茉莉精油被称为“精油之王”。茉莉精油产量 极少因而十分昂贵，其具有高雅气味，可舒缓 郁闷情绪、振奋精神、提升自信心，同时可护 理和善肌肤干燥、缺水、过油及敏感的状况， 淡化妊娠纹与疤痕，增加皮肤弹性，让肌肤倍 感柔嫩。
悬浮培养基本分为：分批式、流加式、连续式、半连续式培养
1)分批培养(batch culture) 是指在培养过程中，既不向系统中补加培养基， 也不从系统中排出培养物（包括培养基和细胞），也就是说一次性加入培养 基，在一定条件下培养一段时间后，一次性收获。
国内外细胞培养的研究进展
1）重点放在细胞培养上（过去） 细胞培养的优点是生物量生长快，但也有次生代谢产物的含量不稳定
和不易与大田栽培接轨等明显的缺点。
2）植物组织和器官培养具有更重要的意义。
初级代谢物、次生代谢物对细胞、植物的意义 植物合成次生代谢产物的目的是其自身生理代谢的需要，在细胞阶段，往往不 需要合成，但到了组织和器官阶段，合成的需要就会加强。因此，培养药用植 物的组织和器官，更容易获得次生代谢产物。
第四章 植物组织培养生产次生代谢产物
一、植物组织培养生产次生代谢物质的目的意义 二、植物细胞培养生产次生代谢产物
植物细胞工程植物细胞次生产物生产PPT共122页
文 家 。汉 族 ，东 晋 浔阳 柴桑 人 （今 江西 九江 ） 。曾 做过 几 年小 官， 后辞 官 回家 ，从 此 隐居 ，田 园生 活 是陶 渊明 诗 的主 要题 材， 相 关作 品有 《饮 酒 》 、 《 归 园 田 居 》 、 《 桃花 源 记 》 、 《 五 柳先 生 传 》 、 《 归 去来 兮 辞 》 等 。
1
0
、
倚
南
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易
安
。
31、只有永远躺在泥坑里的人，才不会再掉进坑里。——黑格尔 32、希望的灯一旦熄灭，生活刹那间变成了一片黑暗。——普列姆昌德 33、希望是人生的乳母。——科策布 34、形成天才的决定因素应该是勤奋。——郭沫若 35、学到很多东西的诀窍，就是一下子不要学很多。——洛克
植物细胞工程植物细胞次生产物生产
6
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无Leabharlann 游氛，天
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风
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7、翩翩新 来燕，双双入我庐 ，先巢故尚在，相 将还旧居。
8
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9、 陶渊 明（ 约 365年 —427年 ），字 元亮， （又 一说名 潜，字 渊明 ）号五 柳先生 ，私 谥“靖 节”， 东晋 末期南 朝宋初 期诗 人、文 学家、 辞赋 家、散
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有效成分含量高。 次生产物的产量=细胞量*细胞次生代谢产物的产率
可控
遗传因素决定
植物细胞培养具有周期长、细胞抗剪切能 力弱、易聚团等特点。
植物细胞培养反应器的设计不仅要考虑有 利于细胞生长，还要考虑有利于产物的积累 和分离。
适合植物细胞培养的反应器应具有适宜 的氧传递、良好的流动性和较低的剪切力。
2. 诱导疏松愈伤组织；
培养基 愈伤组织的异质性； 继代培养
3. 选择适宜的培养基；
基本培养基+CTK/AUX+天然复合物
eg:SH+NAA3.0+BA1.0+CM/YE
培养基的PH
李忠光，龚明. 2006.7
4. 悬浮培养初期的控制 转速，光，温度
5. 悬浮细胞的继代与选择 继代中收集小的细胞团 条件培养基：新鲜培养基
3 高产细胞系的筛选(P113)
3.1高产细胞系 筛选的整体思路
外植体
愈伤组织的诱导筛选
悬浮培养细胞
高产细胞系筛选
高产细胞系的建立
高产细胞株系的特点
• 培养细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定 的产物
• 细胞生长及产物合成的速度快，在较短的时间内 能得到较高产量的终产物
• 代谢产物要在细胞中积累，而不被迅速分解，最 好能将其释放到培养基中
高产细胞系的筛选过程
⑴选定特定起始材料
①准确选择能够产生目的代谢产物的植物种类、品种或单株 ②应尽量选择自然状态下产生天然产物的组织或器官为外植体
⑵诱导愈伤组织，并获得单细胞悬浮液 ⑶诱变处理细胞悬浮液，筛选目的突变细胞 ⑷通过单细胞培养突变细胞，获得突变细胞无性系
次生代谢产物的应用：色素、香料、药物、添加 剂、工业原料等。
紫杉醇简介
• 紫杉醇：二萜类化合物 • 最早由太平洋红豆杉Taxus brevifolia的树皮中分
离 • 广泛用于治疗卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌
等十几种癌症 • 目前主要来源于红豆杉属植物
市场需求
▪ 抗癌一线用药
物生产
• 1983年，日本三井石油化学工业公司在世界 上首次成功地采用紫草细胞培养工业化生产 紫草宁。
1 植物次生代谢产物概述 2 细胞的初代培养 3 高产细胞系的筛选 4 植物细胞悬浮培养方法 5 植物次生代谢物质生产
1.1 植物代谢产物 （1）初生代谢：为维持植物正常的生长发育所必
▪ 理论需求量
2g /人, 500万人/年 1000kg/年
▪ 实际销量
350 kg/年
紫杉醇供需相差十分悬殊
30
25 25
20
20
18.2
14.8 15
12
10 6.6
5
3.4
0.8
0
1992 1994 1995 1998 1999 2000 2001 2002
图2：国际紫杉醇销售额（亿美元）
1000 800 600 400 300
醌 简单酚类
紫草宁 香豆素
抗菌、抗炎、抗病毒、止血 香料，抗菌消炎
萜
类
生物碱
紫杉醇 青蒿素
长春新碱 奎宁
抗癌 抗疟疾
抗癌 抗疟疾
长春碱： ＄ 2 million/kg 长春新碱： ＄ 15million/kg
• 李时珍在《本草纲目》中所开列的1892种药物 绝大多数是植物药物，目前仍有约25％的法定 药品来自植物。其药物的有效成分均为次生产 物。天然的次生代谢产物已经超过2万种。
1.3 植物细胞悬浮培养：即是将植物细胞或小 的细胞团在液体培养基中进行大规模培养
的技术。
成功的悬浮细胞培养体系必须满足3个条件：
分散性良好，细胞团较小，一般在 30～50个细胞以下，在实 际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。
细胞分裂快，均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同，悬 浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈 鲜艳的乳白或淡黄色。
700岁的红豆杉惨遭剥皮
药源问题解决办法（一）
– 人工栽培
采用种子繁殖、扦插等无性繁殖方法快速、大面积人工繁育红豆杉 幼苗
– 寻找红豆衫的替代物
从红豆杉非树皮部位提取 产紫杉醇的非红豆杉植物
药源问题解决办法（二）
– 化学合成 • 全合成
1994年获得成功 现有六种途径
• 半合成
以10-DABⅢ和Baccatin Ⅲ作为半合成原料获得紫杉醇
2 细胞的初始培养
实验中获得适宜于悬浮培养的细胞系的过程 称为细胞的初始培养。
2.1建立悬浮系
获取悬浮培养的细胞
酶解法 愈伤组织培养法
细胞的振荡培养
使细胞团分散 促进气体交换
培养方式：
搅拌培养； 旋转振荡培养； 旋转培养
2.2 建立良好的悬浮系的关键环节
1. 选择适宜的外植体
双子叶植物：幼胚、成熟胚、下胚轴、叶片 单子叶植物：幼胚、成熟胚、幼穗、花药等
自然植物和细胞培养的紫草宁含量比较
生产方式
生产周期
紫草宁含量（％干重）
完整植物
2～3年
1～2
植物细胞培养
3周
14
• 细胞培养是生产次生代谢产物的理想途径： ①缩短周期，提高生产效率
植物细胞培养生产周期为15-30d；而完整植株生长短则几个月， 长则数年，如木瓜8个月，而紫草为5年
②易于管理，减轻劳动强度 ③培养在无菌条件下进行，可排除病虫害干扰 ④可探索新的合成路线，获得新的有用物质
480 350
1000 780
620
200
0 2000年
2002年
2004年
需求量
图1：国际紫杉醇原料药需求走势图（单位：公斤）
药源问题
• 红豆杉
主要原料植物 国家一级保护野生植物，全球十大濒危物 种之一
• 生长缓慢 分布有限 Taxol含量低
树皮中Taxol含量:0.00001-0.069% 3000棵树=10吨树皮=1kg Taxol=500病人
须的代谢。初生代谢过程中形成的各种产物为初 生代谢产物。初生代谢产物不稳定，在体内容易 发生转化。
（2）次生代谢：建立在初生代谢基础上，对于植
物的正常生长发育非必需的代谢，其代谢产物为 次生代谢产物，次生代谢产物是末端代谢产物， 比较稳定，可以在体内积累。
酚类化合物
类别
黄酮
次生代谢产物 用途
银杏黄酮，大豆黄酮 治疗心血管疾病
药源问题解决办法（三）
– 生物方法
• 组织和细胞培养
• 微生物发酵
• 生物合成
研究阶段
红豆杉生物合成途径基本明确 10种相关酶基因被克隆表达 利用基因工程手段改造红豆杉提高紫杉醇产量
1.2 获得植物次生代谢产物的方法
从植物中提取 化学合成
植物细胞大规模培养生产次生代谢产物
植物细胞具有形态全能性，化学全能性 （在离体的条件下可以合成整株植物能合成的物质）