植物细胞悬浮培养技术共27页
2018年细胞工程-第三节 植物细胞悬浮培养-医学文档
起始悬浮液的制备
转速30-150rpm 2-3cm冲程 防细胞破裂
愈伤组织
液体培养基
摇床振荡 悬浮培养
质地疏松，细胞分散程度大； 质地紧密，细胞分散程度小，不适于悬浮培养
二 、培养方法
植物细胞悬浮培养通常深层培养可分为： 分批式．流加式．半连续式．连续 式．和灌注式五种。
1、分批培养/成批培养（Batch culture）
一、细胞悬浮培养原理
植物离体培养可产生愈伤组织, 将疏松型的愈伤组织悬浮在液体培养基 中并在振荡条件下培养一段时间后，可 形成分散悬浮培养物。
细胞的悬浮培养示意图
（一）悬浮培养Suspension culture
特点 细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养； 能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。
（2）流加工艺中的营养成分主 要分为三大类
① 葡萄糖：葡萄糖是细胞的供能物质和 主要的碳源物质。 ② 谷氨酰胺：谷氨酰胺是细胞的供能物 质和主要的氮源物质。 ③ 氨基酸．维生素及其他：主要包括营 养必需氨基酸．营养非必需氨基酸．一 些特殊的氨基酸如羟脯氨酸．羧基谷氨 酸和磷酸丝氨酸；此外还包括其他营养 成分如胆碱．生长刺激因子。
流加式培养是在批式培养的基础上，采 用机械搅拌式生物反应器系统，细胞初 始接种的培养基体积一般为终体积的 1/2～1/3，在培养过程中根据细胞对营 养物质的不断消耗和需求，流加浓缩的 营养物或培养基，从而使细胞持续生长 至较高的密度。 整个培养过程没有流出或回收，通常在 细胞进入衰亡期或衰亡期后进行终止回 收整个反应体系，分离细胞和细胞碎片，
（1）流加培养特点：
第三章 植物细胞的悬浮培养
二. 操作程序
（一）选择合适的外植体 外植体的选择对以后愈伤组织的诱导很重要，选择合适的外 植体进而诱导出疏松易碎的愈伤组织对以后建立悬浮细胞系 可以起到事半功倍效果。 1. 双子叶植物中常用的外植体有：幼胚、成熟胚、下胚轴、 子叶、叶片、根等。 2. 单子叶植物中常用的外植体有：幼胚、成熟胚、幼穗、花 药等。 无论是双子叶植物还是单子叶植物、均以幼胚诱导愈伤组织 的为最佳。因为幼胚诱导的愈伤组织质量最好，分化能力强。 在某些情况下直接用幼胚、下胚轴、子叶等作外植体进行悬 浮培养，建立悬浮细胞系也可获得成功。
二. 操作程序
（八）悬浮细胞的活力和生长速度 悬浮细胞的活力和生长速度受到悬浮培养起始密度的 影响，如果培养时间过长（5～7天或更长）、细胞积 累量多时，培养基的成分和pH值均发生较大的改变， 往往造成细胞活力下降，细胞生长减慢。一般继代培 养（更换新鲜培养基）3天时的细胞活力最强，常常用 此时的细胞为材料进行原生质体游离和培养及诱变处 理等。
实例
白木香
二. 操作程序
（十）悬浮细胞的分散度、生长速度与植株再生能力之间的关 系 一般来讲，如果一个悬浮细胞系分散程度越高，生长速度越快， 在一定时间内，细胞分裂的代数也就越多，也就越易产生突变， 其分化能力也就越容易丧失，因此，悬浮细胞在继代培养过程 中，每隔一段时间（1～2个月）就应检查一下它的分化能力。 自诱导愈伤组织到建立一个良好的悬浮细胞系大约需要4～6个 月或更长的时间，因此尽量保持其分化能力极为重要。 保持其分化能力的方法有二个：超低温保存是一个极有效的方 法，经过超低温保存的悬浮细胞，不会影响其各种性质，同对 照组相同。 固体培养基上保持悬浮细胞的分化能力。
植物细胞悬浮培养技术
植物组织培养技术的过程：
离体的 脱分化 植物组 织、器 官、细 胞 愈伤 组织 再分化 丛芽、根 试 管 苗 小 植 株
鉴别培养基
微生物产生某种代谢产物，与培养基中的特殊化学物质发 生特定的化学反应，产生明显的特征变化
胚状体
细胞的全能性
生物体的细胞具有使后代细胞发育成完整 1、定义：
个体的潜能的特性。
2、原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特
有的全套遗传物质，都有发育成为完整个 体所必需的全部基因，从理论上讲，生物 体的每一个活细胞都应该具有全能性。
3、差异： 受精卵 ＞ 生殖细胞 ＞ 体细胞
植物细胞＞动物细胞
液体培养基
不加任何凝固剂
大规模工业生产及在实验室进行微生 物的基础理论和应用方面的研究
含有 途 不 同 划 分
基础培养基 加富培养基 选择培养基
在基础培养基中加入某些特殊营养 物质制成的一类营养丰富的培养基 如血液、血清、酵母浸膏、动植物 组织液等 用来将某种或某类微生物从混杂的 微生物群体中分离出来 用于鉴别不同类型微生物的培养基
机械法(研或刮） 酶解法
机械法和酶解法比较 机械法
1. 细胞不受到酶的伤害； 2. 不用质壁分离； 3. 细胞产量低； 4. 细胞易破。 1. 细胞受到酶的伤害； 2. 要质壁分离； 3. 细胞产量高； 4. 细胞不易破。
酶解法
2
由培养组织（愈伤组织）分离单细胞
材料：胡萝卜肉质根
步骤：
植物细胞的悬浮培养技术
植物细胞的悬浮培养技术将游离的植物细胞或小的细胞团置于液体培养其中进行培养和生长的一种技术，称为植物细胞悬浮培养。
它是从愈伤组织的液体培养基础上发展起来的一种新的培养技术。
从50年代起，米尔（Muir）等便对单细胞培养进行了探讨和研究，得到了万寿菊，烟草单细胞和细胞团的悬浮液。
1958年斯图尔德（F.C.Steward）等进行了胡萝卜愈伤组织的悬浮培养，并得到了完整的再生植株。
三十多年来，从试管的悬浮培养发展到大空量的发酵罐培养，从不连续培养发展到半连续和连续培养。
80年代以来，作为生物技术中的一个组成部分，正在发展成为一门新兴的产业体系。
悬浮培养技术为研究植物细胞的生理、生化、遗传和分化的机理提供实验材料，也为利用植物细胞进行次和代谢物的工业生产提供技术基础。
此外，还在育种、快速繁殖、原生质体培养，体细胞杂交以及作为基因转化的受体等方面均得到了广泛地应用。
由于植物细胞具有聚集在一起的特性，因此，在分裂后，往往不能像细菌细胞那样各自分开，而是大多以细胞团的形式存在，至今还不能培养完全是单细胞的县浮液。
要进行单细胞培养或选择细胞无性纱，需要进行平板培养，微室培养和看护培养。
本实验仅介绍最常用的县浮培养技术。
一.实验原理：植物离体培养可产生愈伤组织。
将疏松型的愈伤组织县浮在液体培养基中并在振荡条件下培养一段时间后，可形成分散县浮培养物。
良好的县浮培养物应具备以下特征：（1）主要有单细胞和小细胞团组成；（2）细胞具有量盛的生长和分裂能力，增殖速度快；（3）大多数细胞在形态上应具有分生细胞的特征，它们多呈等径形，核一质比率大，胞质浓厚，无液胞化程度较低。
要建成这样的县浮培养体系，首先需要有良好的起始培养物——迅速增殖的疏松型愈组织。
然后经过培养基成分和培养条件的选择，并经多次断代培养才能达到。
县浮培养细胞经长期继代培养后，染色体常有变异现象，细胞的再生能力也有逐渐降低的趋势，然而对于以上生产有用代谢特质为目的的大量培养，这种再生能力的降低不一定有不良影响。
悬浮细胞培养技术课件
悬浮细胞传代及细胞计数一、细胞传代实验目的：掌握悬浮细胞传代技术。
进一步掌握细胞培养的操作技术。
实验原理：培养细胞生长一定时间后，需分离再培养，否则细胞因生存空间不够，细胞密度过大，致营养不足而引起细胞衰老、停止生长甚至死亡。
为了维持细胞的存活和生长，必须进行再培养，即将原培养瓶内细胞分离、稀释、接种到新培养瓶内继续扩大培养。
实验用品：（一）仪器净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱；（二）玻璃器皿吸管（弯头、直头）、培养瓶、废液缸、（三）塑料器皿吸头、枪头、胶塞、移液管、15ml离心管、离心管架（四）其他物品微量加样枪、计数板、记号笔、移液枪（五）试剂1640培养液、PBS操作步骤：1.准备：打开培养液，PBS；取出离心管，拧开管盖，管盖倒放。
从吸管筒中依次取出吸管，装上吸头，插入离心管备用。
2.从培养箱内取出细胞，放在显微镜下观察其生长状态、密度。
3.首先观察培养板孔中培养液量。
用吸管分别吸出两个孔中的细胞连同培养液，转入离心管中。
再另取一只吸管吸取PBS，放入培养板孔中，轻轻吹打孔壁，吸出转入离心管。
4.离心，设置离心机1000转/分，4-5分钟。
5.取出离心管，轻轻吸出上清，倒入废液缸。
吸取培养液约7ML放入离心管，轻轻吹打细胞，使之均匀悬浮。
6.吸取1ML细胞悬液1ML转入EP管中，备计数用。
7.其余的细胞分别放入六个孔中，每孔约1ML。
8.吸取培养液加入板孔中至1/3孔容量。
9.镜下观察细胞是否分布均匀，放入培养箱培养。
二、细胞计数及生长曲线测定培养细胞生长过程：潜伏期→指数增生期→停滞期潜伏期(latent phase)细胞接种后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期.此时,细胞质回缩, 胞体呈圆球形.然后细胞贴附于载体表面,称贴壁,悬浮期结束. 细胞贴壁速度与细胞种类, 培养基成分,载体的理化性质等密切相关。
一般情况下，原代培养细胞贴壁速度慢,可达10-24 小时或更多, 而传代细胞系贴壁速度快, 通常10-30 分钟即可贴壁。
植物细胞悬浮培养与生长量的测定课件
的测定
植物细胞悬浮培养 技术 （Suspension culture）
概念：是指一种在受到不断摇动的液体培养 基里，培养单细胞及小细胞团的组织培养系 统。
特点： ? 细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适
于大规模培养； ? 能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生
长、分化创造方法和条件。 必须指出： 悬浮培养中既有单细胞，也有小细胞团。
3 12
1 滞后期
(lag phase)
2 指数生长期
(exponential phase)
3 直线生长期
(linear phase)
培养时间 4 减慢期
培是养极由由细细少于胞胞于细生，细有所很培胞长甚胞毒处少养分几至生的分代基裂乎开生裂长谢中长活，处始和产某期其跃于死发物和时些，停亡育的转间营细止。最积入长养胞状快细短累物数态胞取的5，质数目决，时细量已于(d迅细静期pe胞r的c在经o速e胞止gl的多e继r耗er增数a期s增少代tsii尽ov加目n时e长，p增原h逐a或s种加e)
③将已接种的培养瓶置于旋转式摇床上， 在转速 100-120rpm ，25℃下进行震荡培养。
1、起始悬浮液的制备
转速30～150rpm
愈伤组织
防细胞破裂
液体培养基 摇床振荡
悬浮培养
质地疏松，细胞分散程度大； 质地紧密，细胞分散程度小， 不适于悬浮培养
（2）培养细胞的生长量测定 ① 鲜重测定 采用直接测量法，将悬浮培养的细胞用细 胞筛过滤，过滤后用水冲洗，除去培养基， 然后离心除去水分。将获得的沉淀细胞称 量即为悬浮细胞的鲜重。
② 干重测定 将鲜重测定得到的细胞置于 60℃烘箱内烘 12～24h（因材料大小、数量多少而定） 取出，冷却后立即称量，即为悬浮细胞干 重。
植物细胞悬浮培养技术
植物细胞悬浮培养技术一、基本原理利用固体琼脂培养基对植物的离体组织进行培养的方法在某些方面还存在一些缺点，比如在培养过程中，植物的愈伤组织在生长过程中的营养成分、植物组织产生的代谢物质呈现一个梯度分布，而且琼脂本身也有一些不明的物质成分可能对培养物产生影响，从而导致植物组织生长发育过程中代谢的改变而利用液体培养基则可以克服这一缺点，当植物的组织在液体培养基中生长时，我们可以通过薄层震荡培养或向培养基中通气用以改善培养基中氧气的供应。
植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。
这些小的细胞聚合体通常来自植物的愈伤组织。
一般的操作过程是把未分化的愈伤组织转移到液体培养基中进行培养。
在培养过程中不断进行旋转震荡，一般可用100～12Or/min的速度进行。
由于液体培养基的旋转和震荡，使得愈伤组织上分裂的细胞不断游离下来。
在液体培养基中的培养物是混杂的，既有游离的单个细胞，也有较大的细胞团块，还有接种物的死细胞残渣。
在液体悬浮培养过程中应注意及时进行细胞继代培养，因为当培养物生长到一定时期将进入分裂的静止期。
对于多数悬浮培养物来说，细胞在培养到第18～25d时达到最大的密度，此时应进行第一次继代培养。
在继代培养时，应将较大的细胞团块和接种物残渣除去。
若从植物器官或组织开始建立细胞悬浮培养体系，就包括愈伤组织的诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。
目前这项技术已经广泛应用于细胞的形态、生理、遗传、凋亡等研究工作，特别是为基因工程在植物细胞水平上的操作提供了理想的材料和途径。
经过转化的植物细胞再经过诱导分化形成植株，即可获得携带有目标基因的个体。
二、器材超净工作台、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、磁力搅拌器、恒温空气摇床、镊子、锥形瓶、水稻种子三、操作步骤1．配制培养基按照培养基配方取各种药品，最后用蒸馏水定容到所需体积。
所配制的培养基经高压蒸汽灭菌后备用，固体琼脂培养基分装在250mL的锥形瓶内，每瓶约分装30mL。
植物细胞悬浮培养的方法
植物细胞悬浮培养的方法植物细胞悬浮培养是一种常用的细胞培养方法，它可以用于研究植物细胞的生长、分化和代谢等方面的问题。
本文将介绍植物细胞悬浮培养的基本原理、培养条件和应用。
一、植物细胞悬浮培养的基本原理植物细胞悬浮培养是将植物细胞从组织中分离出来，以液体培养基为基质，在适宜的温度、光照和气体条件下进行培养。
悬浮培养的优势在于可以提供细胞自由生长的环境，有利于探究植物细胞的生理和生化特性。
二、植物细胞悬浮培养的培养条件1. 培养基：植物细胞悬浮培养的基础是培养基的选择。
培养基中应含有适宜的营养物质，如碳源、氮源、无机盐和维生素等。
常用的培养基有MS培养基、B5培养基等。
2. 温度：植物细胞的适宜生长温度通常在20-25摄氏度之间，不同植物细胞可能有所差异，需要根据具体情况进行调整。
3. 光照：光照条件对植物细胞的生长和代谢有一定影响。
一般情况下，光照强度为1000-2000勒克斯，光周期为16小时光照/8小时黑暗。
4. 气体：植物细胞悬浮培养通常需要提供充足的氧气和适量的二氧化碳。
因此，培养容器应具有良好的通气性，可以使用摇床或气体通气系统进行培养。
三、植物细胞悬浮培养的应用植物细胞悬浮培养在植物生理学、生物工程和药物研发等领域具有广泛的应用价值。
1. 植物生理学研究：植物细胞悬浮培养可以用于研究植物的生长发育过程，如细胞分裂、细胞扩增和细胞器的形成等。
2. 生物工程：植物细胞悬浮培养可以用于生物工程的研究和应用，如基因转化、蛋白质表达和次生代谢产物的生产等。
3. 药物研发：植物细胞悬浮培养可以用于药物的筛选和生产，如植物次生代谢产物的提取和纯化，以及药物的生物活性和毒性测试等。
四、植物细胞悬浮培养的优缺点1. 优点：(1) 与传统的植物培养相比，悬浮培养提供了更便利的细胞生长环境，可以快速获得大量的细胞。
(2) 可以对植物细胞的生理和代谢进行深入研究。
(3) 可以为生物工程和药物研发等领域提供重要的研究手段和应用平台。
实验：植物细胞的悬浮培养技术
• • • •
三、实验器材与材料
• 器材 • 超净工作台，酒精灯，镊子，高压灭菌锅
• 材料 前面实验诱导的豇豆的愈伤组织。
四、实验方法
• 1.用镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织(注意愈 伤组织的选择)，放入试管中并轻轻夹碎。 • 接种密度：每毫升培养基接0.1克愈伤组织。以保 证最初培养物中有足够量的细胞。 • 2.将已接种的试管置于旋转式摇床上。在 100r/min，25~28℃条件下，进行振荡培养。
• 3.经6—10天培养后，若细胞明显增殖，可向培养 瓶中加新鲜培养基4ml，必要时，可用移液管将培 养物分装成两管，继续培养。 • （若细胞无明显增殖，可能是起始材料不适当， 应考虑用旺盛增殖期的愈伤组织重新接种）。可 进行第一次继代培养。
五、注意事项： 注意事项：
• 1.上述步骤均灭菌操作，培养基、用具、 器皿等要高压灭菌后方可使用。 2.如培养液混浊或呈现乳白色，表明已污 染。 • 3.实验报告每人写一份。实验讨论部分记 得首先评价自己之前培养的愈伤组织的生 长情况。
植物细胞的悬浮培养技术
一、实验目的
• 1.掌握植物悬浮细胞系建立的方法，原理。 • 2. 巩固组织与细胞培养的无菌操作技术。
二、实验原理
• • 将游离的植物细胞或小的细胞团置于液体培养其中进 行培养和生长的一种技术，称为植物细胞悬浮培养。 植物离体培养可产生愈伤组织。将疏松型的愈伤组织 县浮在液体培养基中并在振荡条件下培养一段时间后，可 形成分散县浮培养物。 良好的县浮培养物应具备以下特征： （1）主要有单细胞和小细胞团组成； （2）细胞具有量盛的生长和分裂能力，增殖速度快； （3）大多数细胞在形态上应具有分生细胞的特征，它们 多呈等径形，核质比率大，胞质浓厚，无液胞化程度较低。
实验九 植物细胞的悬浮培养
一 实验目的
1 掌握植物悬浮细胞系建立的方法、原理。 2 学会对悬浮细胞培养物进行细胞计数及 绘制细胞生长曲线。
二 实验原理
植物细胞悬浮培养：将游离的植物细胞或小的 细胞团置于液体培养基中进行培养和生长的一 种技术。 将疏松型的愈伤组织悬浮在液体培养基中并在 振荡条件下培养一段时间形成分散的悬浮培养 物，并经多次继代培养。 悬浮培养技术可应用于科研实验材料的提供、 次生代谢物的工业生产、育种、快速繁殖、原 生质体培养、体细胞杂交、基因转化受体等。
三 实验用品
1 器材：超净工作台、高压灭菌锅、 摇床、恒温培养室等。 2 材料：松软的胡萝卜愈伤组织。 3 试剂：MS培养基
四 实验方法
Байду номын сангаас
1 切取外植体上新长出的愈伤组织→ 轻轻夹碎→MS培养液 2 置于摇床→震荡培养→观察 (25-28℃，100r/m)
植物细胞悬浮培养过程图像
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植物细胞悬浮培养技术
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6、黄金时代是在我们的前面，而不在 我们的 后面。
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7、心急吃不了热汤圆。
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8、你可以很有个性，但某些时候请收 敛。
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9、只为成功找方法，不为失败找借口 (蹩脚 的工人 总是说 工具不 好)。
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10、只要下定决心克服恐惧，便几乎 能克服 任何恐 惧。因 为，请 记住， 除了在 脑海中 ，恐惧 无处藏 身。-- 戴尔． 卡耐基 。