流式细胞仪 ppt课件
合集下载
流式细胞仪培训(ppt42张)
PMT用于检测较弱的SSC信号和荧光信号 ，光电二
极管用于检测较强的FSC信号
阈值
阈值：信号放大过程会产生不需要的脉冲信号，通常
来自于碎片。通过设定某一信号的最低强度值，可将 不需要的脉冲信号去除，这一设定值称为阈值。
荧光补偿
采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差
荧光补偿
补偿调整的实验过程
流式细胞仪的检测对象
藻类细胞
染色体
血细胞
原生动物细胞
任何存在于悬液中的直径为0.2-50微米的粒子或细胞都适用于流式分析
流式细胞仪工作原理示意图
流式的基本组 成： 1.流动室和 液流系统 2.光路系统 3.电系统
流式细胞仪可提供的信息
物理信息：通过散射光信号反映
相对细胞大小 相对细胞颗粒密度和内部复杂度
流式细胞仪原理与应用
陈玉婵
提
要
流式细胞仪简介 流式细胞仪工作原理 流式实验流程 流式细胞术的应用
流式细胞术的发展史
1930s~1950s:开始出现自动细胞分析技术（细 胞的计数，是通过光电仪记录流过一根毛细管 的细胞,用结合了荧光素的抗体去标记细胞内 的特定蛋白，应用分层鞘流原理，成功的设计 红细胞光学自动计数器。） 1960s晚期发展：荧光检测细胞计 、细胞分选 器检测细胞的荧光信号 、单克隆抗体技术 1973年，BD公司与美国斯坦福大学合作，研制 开发并生产了世界第一台商用流式细胞仪FACS I。
DNA含量分析-PI染色
细胞凋亡
细胞膜分析-PS外翻
PS（磷脂酰丝氨酸）正常暴露在胞膜的内表 面，凋亡时，PS外翻向细胞外表面。重组蛋白 Annexin-V可与PS结合
流式细胞仪介绍 ppt课件
Source
Forward Light
Detector
Cell Surface
Area
相对荧光强度（FL） (需探针标记)
是细胞或细胞上的荧光染料被激光激发后发射出
的荧光，不同的荧光染料其发射波长不同。
区分阴阳性：通过荧光强度可将同一个细胞群体
中的有荧光标记的细胞与无荧光标记的细胞区分
开来。
区分阳性强弱：也可以将阳性细胞中的高FL的细
非常节省细胞，对于科研珍贵标本尤为重要！
绝对的细胞计数，无需计数微珠，细胞培养后往往需要细
胞计数仪，可以完全代替细胞计数仪。
自动标记，自动进样，自动清洗，节省时间。
自动补偿，对多色分析自动生成补偿数值
小巧的台式机设计,低噪，低热
非加压系统进样
(25)
34
仪器的竞争分析
BD的各种机型（一）
无加压系统
溶液瓶附着在仪器上
仪器状态能够通过溶液瓶的不同颜色来指示
软件基本特征
12‘’触摸屏（内嵌）
Live support 远程网络服务，德国工程师进
行远程在线检修机器
VGA 接口 (连接第二个显示器或者代替的显示
器)
功能强大、易于操作
——直观的操作界面 (用于仪器控制, 数据获取和数据
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Belgium
Canada
China
France
Germany
Forward Light
Detector
Cell Surface
Area
相对荧光强度（FL） (需探针标记)
是细胞或细胞上的荧光染料被激光激发后发射出
的荧光，不同的荧光染料其发射波长不同。
区分阴阳性：通过荧光强度可将同一个细胞群体
中的有荧光标记的细胞与无荧光标记的细胞区分
开来。
区分阳性强弱：也可以将阳性细胞中的高FL的细
非常节省细胞，对于科研珍贵标本尤为重要！
绝对的细胞计数，无需计数微珠，细胞培养后往往需要细
胞计数仪，可以完全代替细胞计数仪。
自动标记，自动进样，自动清洗，节省时间。
自动补偿，对多色分析自动生成补偿数值
小巧的台式机设计,低噪，低热
非加压系统进样
(25)
34
仪器的竞争分析
BD的各种机型（一）
无加压系统
溶液瓶附着在仪器上
仪器状态能够通过溶液瓶的不同颜色来指示
软件基本特征
12‘’触摸屏（内嵌）
Live support 远程网络服务，德国工程师进
行远程在线检修机器
VGA 接口 (连接第二个显示器或者代替的显示
器)
功能强大、易于操作
——直观的操作界面 (用于仪器控制, 数据获取和数据
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Belgium
Canada
China
France
Germany
流式细胞术实验技巧及数据分析ppt课件
FITC+T red
488
568
FITC+PeCy5 488
FITC+ ECD
488
F+P +PeCy5
488
F+ ECD +PeCy5 488
F+P +PeCy5 +APC 488
633
525 、575
绿色、橙色
525
绿色
615
红色
525、 675
绿色、 红色
525、 625
绿色、橙红色
525、575、675
17
流式细胞术操作流程：
培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋
单细胞悬液 制备
荧光抗体标记
上机检测
表型测定 细胞分选
统 计 学 分 析
FISH PCR
继 续 培 养
18
单 分 散 细 胞
19
FSC
FSC信号的强弱与细胞的大小和活力相关
20
SSC
SSC信号的强弱与细胞内颗粒多少相关
21
细胞散色光信号
22
排除双联体细胞
27
细胞阻滞在G2M期
28
双 克 隆 细 胞 周 期 分 析
29
BrdUrd和DNA双标记染色
溴脱氧尿嘧啶核苷( Bromodeoxyuridine， BrdUrd )是胸苷的一种类似物。它可以替代
胸腺嘧啶掺入到细胞新合成的DNA分子中，成为S 期细胞的一种标记物。流式细胞术采用抗BrdUrd 单克隆抗体免疫荧光和PI双参数检测细胞，不仅 可检测一个细胞群体的动力学参数和DNA含量，同
层流是液体稳定流动的必要条件,管道中层流 的形成要满足雷诺数
流式细胞术原理及应用新课件PPT全
流式细胞术是20世纪70年代发展起来的一种技术，有人将流式细胞仪比喻成高级的荧光显微镜。 HLA-B27: 强直性脊柱炎 细胞功能检测：细胞周期、凋亡
Flow Sorting 直方图适用于：单参数分析
SORTING（细胞分选） CD16+56 NK细胞 可利用FCM进行细胞周期分析，适当选择周期特异性药物或非周期特异性药物。
巨血小板
• 细胞凋亡与坏死的区别 一般只测一个参数、不能分选
5、DNA含量分析法（晚晚期）
2F时LO必W需C停Y用TO免M疫E抑TR制Y剂。虽然凋亡与坏死的最终结果极为相似，但
凋亡检测
每一步都有检测它试剂盒们的过程与表现却有很大差别。
光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握,适合
坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理 流式细胞分析在人类基因组计划中发挥了重要作用，流式细胞技术的应用也适用于植物，目前这个技术应用范围包括流式核型分析，
目前，该技术以广泛用于生物及医 学基础研究与临床检测，在分子生物学、 免疫学、遗传学、血液学、肿瘤学等领 域内发挥着重要作用。
流式细胞仪
荧光显微镜
Flow Cytometry
控制 一般只测一个参数、不能分选
电脑
人脑
其细胞及组织的变化与坏死有明显的不同。
可利用FCM进行细胞周期分析，适当选择周期特异性药物或非周期特异性药物。
• 空白对照：ALL 应用领域将不断开拓，成为科研与临床不可或缺的重要工具。
随着白细胞分化抗原意义的确认以及单克隆抗体技术的发展，随着人们创新意识的加强，结合计算机技术和其他技术，流式细胞仪的 应用领域将不断开拓，成为科研与临床不可或缺的重要工具。 坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。
流式细胞术在临床血液学ppt课件
*
*
*
AML-M4/M5
两型表型相似，但M4较M5表达更多的CD34（＋），CD45-SSC图上，不成熟细胞出现在单核区，重要的表型为CD13、CD33、HLA-DR、CD14和CD15，CD33可表达强于CD13。
*
*
*
AML-M6
特征不明显，HLA-DR，CD34、CD13、CD33、CD19、CD22、CD5、CD7等均阴性，CD45－SSC图显示主要为CD45阴性区域为红系成份，高表达CD71。
*
*
AML-M2
M2与M1的主要区别是成熟度增加，原始细胞减少，CD15表达较M1显著，CD34弱于M1。 CD45-SSC图显示从髓系blast区至成熟骨髓细胞区的连续细胞带，CD45－SSC图有助于确定blasts比例。
*
*
AML-M3
高颗粒性，表现为较高的SSC，多数情况HLA-DR阴性或表达很少，CD34少于M2、一般CD13弱于CD33，大多表达CD117。 M3v低颗粒性，表现为较低的SSC。
CD80 CD86
CD80、CD86表达率（%）
*
对照组B淋巴细胞MHC-Ⅰ与MHC-Ⅱ表达
*
CpG2006诱导B淋巴细胞MHC-Ⅰ与MHC-Ⅱ表达
*
CpG2216诱导B淋巴细胞MHC-Ⅰ与MHC-Ⅱ表达
*
CpG诱导B淋巴细胞MHC分子表达
MHC-Ⅰ MHC-Ⅱ
*
流式细胞仪基本工作原理
光路系统 液路系统 电路系统
*
流式细胞仪光路图
*
外周血FSC-SSC点图
*
荧光信号（FL1、FL2、FL3）
*
滤光片
*
CD8-CD28+
*
*
AML-M4/M5
两型表型相似，但M4较M5表达更多的CD34（＋），CD45-SSC图上，不成熟细胞出现在单核区，重要的表型为CD13、CD33、HLA-DR、CD14和CD15，CD33可表达强于CD13。
*
*
*
AML-M6
特征不明显，HLA-DR，CD34、CD13、CD33、CD19、CD22、CD5、CD7等均阴性，CD45－SSC图显示主要为CD45阴性区域为红系成份，高表达CD71。
*
*
AML-M2
M2与M1的主要区别是成熟度增加，原始细胞减少，CD15表达较M1显著，CD34弱于M1。 CD45-SSC图显示从髓系blast区至成熟骨髓细胞区的连续细胞带，CD45－SSC图有助于确定blasts比例。
*
*
AML-M3
高颗粒性，表现为较高的SSC，多数情况HLA-DR阴性或表达很少，CD34少于M2、一般CD13弱于CD33，大多表达CD117。 M3v低颗粒性，表现为较低的SSC。
CD80 CD86
CD80、CD86表达率（%）
*
对照组B淋巴细胞MHC-Ⅰ与MHC-Ⅱ表达
*
CpG2006诱导B淋巴细胞MHC-Ⅰ与MHC-Ⅱ表达
*
CpG2216诱导B淋巴细胞MHC-Ⅰ与MHC-Ⅱ表达
*
CpG诱导B淋巴细胞MHC分子表达
MHC-Ⅰ MHC-Ⅱ
*
流式细胞仪基本工作原理
光路系统 液路系统 电路系统
*
流式细胞仪光路图
*
外周血FSC-SSC点图
*
荧光信号（FL1、FL2、FL3）
*
滤光片
*
CD8-CD28+
《流式细胞仪》课件
便携式设备的应用
将流式细胞仪的设备体积继续缩小， 大量应用于生物界的基础研究以及 医学检测和移动采样等领域。
流式细胞仪的市场前景评估
1 市场规模
2 主要厂商
3 市场推动因素
流式细胞仪市场规模呈自上 世纪六十年代发明起逐年扩 大的趋势，预计到2027年达 到40亿美金。
Becton, Dickinson and Company、Beckman Coulter、 Merck Millipore等公司产品 市场占领率较高。
灯源
氙气灯、汞灯、钨丝灯等不同的光源都可以被用作流式细胞仪的光源，不同灯源在功率、波 长、寿命等方面存在差异。
探测器的选择
1
荧光检测器
是流式细胞仪检测系统的关键组成部分，不同的检测器可以检测不同的荧光参数， 如细胞大小、细胞形态、细胞核酸含量等。
2
散射检测器
散射检测器可检测颗粒的大小和光密度信息，如侧散射检测器用于检测细胞的大 小和形态，前散射检测器检测颗粒的光密度信息。
3 准确记录
记录样品来源、批号和实验日期等信息，并保证实验室干净卫生。
样本的处理与染色
细胞损伤
避免长时间的离心和过滤，防止 细胞的膜破坏和凋亡。
细胞处理
使用重组蛋白等方法对细胞进行 特定功能标记的处理。
荧光染色
使用专门的生物染料与细胞反应 后，在流动细胞仪中检测荧光信 号。
流式细胞仪的参数设置
软件设置
流式细胞仪最早由韦斯利·莱恩和墨菲博士等人于1965年开发。自此以后，它经历了巨大的 技术发展和应用范围的扩大。
用途
流式细胞仪可应用于人类疾病的研究、药物开发、医学诊断、基因工程、环境监测等领域。
流式细胞仪的原理
流式细胞仪检测凋亡和细胞周期等应用PPT
Quad UL UR LL LR
Eve nts % Ga te d X Mean Y Mean 254 2.40 37.47 461 .3 6
106 7 10.08 816 .8 6 468 .8 9 529 1 49.98 19.57 4.41 397 5 37.55 418 .8 0 9.87
图 Annexin V/PI双标记分析细胞凋亡和坏死
二）肿瘤诊断与抗肿瘤药物研究
1. 肿瘤诊断
DNA异倍体的出现是癌变的一个重要标志 细胞的增殖能力的大小也可反映肿瘤的生物
学特征 利用流式细胞仪进行细胞周期分析和DNA
倍性分析，辅助肿瘤诊断，包括监测癌前病 变、肿瘤的早期诊断和肿瘤细胞学诊断。
肿瘤组织中的各种DNA倍体
2倍体
异倍体
4倍体
FCM分析白血病免疫表型, 快速、特异、 准确，重复性好，能区分细胞起源、划 分其分化发育阶段等，对白血病的诊断 与分型、治疗方案选择与预后判断、发 病机理研究等有重要价值。
五） 细胞内蛋白的分析：
细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分 进行荧光标记，用流式细胞仪进行测量 分析，同表型分析一样，可以测量出这 种阳性细胞的数量和这种蛋白的相对含 量。荧光探针多为FITC。
51
FCM检测胞内钙离子、 膜电位和线粒体功能
M1阴性界限划分完全是根据阴性对照！如下图：红色部分代表阴性对照，即： 所检测的物质在阴性组中的基础表达量，可以理解为背景、静息状态下、基础 水平、未受刺激时等。蓝色部分即阳性组，也就是接受刺激后，功能状态下、 药物作用后等。
六. 分选：
用荧光探针标记的细胞，可被有效地分离出来， 用于分选的效率较高的仪器国内较少，台式机
Date acquired: 14-Jan-03 File: 7Gy 4hr.001 Source: dongbo DIPLOID: 100.00 % Dip G0-G1: 73.12 % at 48.16 Dip G2-M: 9.59 % at 96.33 Dip S: 17.29 % G2/G1: 2.00 Dip %CV: 6.04
流式细胞术的原理及应用ppt课件
➢可把感兴趣细胞分 选到特定培养孔或板 上（4路和24孔板）
➢适用于高速分选和 多色分析
6
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
流式细胞仪检测范围
细胞大小
细胞粒度
细 细胞表面面积
胞 结
核浆比例
构 DNA含量与细胞周期
18
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
散射光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同 类型的细胞群加以区分
FSC（小角散射光)它反 应细胞的相对大小和截 面积的大小
SSC (90度角散射光)代 表细胞的颗粒度和精细 结构的变化
1.液流系统： 细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液
(sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成单细 胞悬液。
10
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
2.光学系统： 激光是较常用的光源, 稳定性好、单色性好。 散射光和荧光信号被收集、处理转化为数字信号。
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： ➢多数字化 ➢适用于各类细胞分选 ➢4路分选
5
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
FACSAria
科研型
特点： ➢分辨率高
➢选配多种波长和类 型激光器
成,将产生的光信号引导至检测器
➢适用于高速分选和 多色分析
6
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
流式细胞仪检测范围
细胞大小
细胞粒度
细 细胞表面面积
胞 结
核浆比例
构 DNA含量与细胞周期
18
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
散射光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同 类型的细胞群加以区分
FSC（小角散射光)它反 应细胞的相对大小和截 面积的大小
SSC (90度角散射光)代 表细胞的颗粒度和精细 结构的变化
1.液流系统： 细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液
(sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成单细 胞悬液。
10
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
2.光学系统： 激光是较常用的光源, 稳定性好、单色性好。 散射光和荧光信号被收集、处理转化为数字信号。
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： ➢多数字化 ➢适用于各类细胞分选 ➢4路分选
5
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
FACSAria
科研型
特点： ➢分辨率高
➢选配多种波长和类 型激光器
成,将产生的光信号引导至检测器
流式细胞仪分析技术及应用PPT课件
49
（四）石蜡包埋组织单细胞悬液制备 该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应
用范围，有利于进行临床回顾性研究和利 用。 常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂 脱蜡法和甲氧-双氧水处理法。 对石蜡切片的要求较严格。
50
（五）活检标本单细胞悬液制备 活检标本及各种内镜取材标本也克制备成
能对于处在快速直线流动状态 中的细胞或生物颗粒同时进行 多参数、快速定量分析和分选
5
一、流式细胞仪分析的工作原理
荧光显微镜技术
激发光源改为激光
单克隆抗体与 荧光染料技术
计算机技术 处理光信号
提高检测灵敏度 和特异性
提高检测速度和 统计分析精确性
6
（一）流式细胞仪基本结构
液流系统
1
包括流动室（flow chamber）和液流驱动系统 作用：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区 理想状态：细胞逐个传送到激光束的中心，而且
侧向散射光检测器
在激光束的垂直方 向，又称90°散射
SSC信号的强弱与 细胞内颗粒结构的 质量成正比，用于 检测细胞内部结构 属性
28
前向散射光示意图
细胞大小
29
结构复杂程度
侧向散射光示意图
30
当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过 激光束时，染料吸收光子跃迁到激发态，返 回基态时，染料释放出能量，大部分以光的 形式释放。
分选的方式有捕获式分选和电荷式分选，目前应 用最多的是电荷式分选。
21
电荷式分选1
当单细胞悬液形成液柱通过 流动室时，液柱被分割成一 连串均匀的液滴。
根据设定的被分选细胞的某 个参数由逻辑电路判断是否 被分选。
22
电荷式分选2
充电电路对选定细胞液滴充 电，使其带正电荷或负电荷， 未被设定分选参数的细胞液 滴则不带电荷。
（四）石蜡包埋组织单细胞悬液制备 该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应
用范围，有利于进行临床回顾性研究和利 用。 常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂 脱蜡法和甲氧-双氧水处理法。 对石蜡切片的要求较严格。
50
（五）活检标本单细胞悬液制备 活检标本及各种内镜取材标本也克制备成
能对于处在快速直线流动状态 中的细胞或生物颗粒同时进行 多参数、快速定量分析和分选
5
一、流式细胞仪分析的工作原理
荧光显微镜技术
激发光源改为激光
单克隆抗体与 荧光染料技术
计算机技术 处理光信号
提高检测灵敏度 和特异性
提高检测速度和 统计分析精确性
6
（一）流式细胞仪基本结构
液流系统
1
包括流动室（flow chamber）和液流驱动系统 作用：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区 理想状态：细胞逐个传送到激光束的中心，而且
侧向散射光检测器
在激光束的垂直方 向，又称90°散射
SSC信号的强弱与 细胞内颗粒结构的 质量成正比，用于 检测细胞内部结构 属性
28
前向散射光示意图
细胞大小
29
结构复杂程度
侧向散射光示意图
30
当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过 激光束时，染料吸收光子跃迁到激发态，返 回基态时，染料释放出能量，大部分以光的 形式释放。
分选的方式有捕获式分选和电荷式分选，目前应 用最多的是电荷式分选。
21
电荷式分选1
当单细胞悬液形成液柱通过 流动室时，液柱被分割成一 连串均匀的液滴。
根据设定的被分选细胞的某 个参数由逻辑电路判断是否 被分选。
22
电荷式分选2
充电电路对选定细胞液滴充 电，使其带正电荷或负电荷， 未被设定分选参数的细胞液 滴则不带电荷。
流式细胞仪原理ppt课件
300 nm 400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Excitation Emisson
流式细胞仪的组成
仪器硬件组成 计算机硬件系统 软件系统 应用
大型机——FACSVantage SE
多激光多波长 八荧光参数 高速分选 单细胞点对点分选
台式机——FACSCalibur
双激光 488nm 635nm
鞘液、洗液、PMA等：清洁无颗粒杂质
单细胞悬液的处理
荧光标记抗体的染色：使用特异的单克隆抗体
单色分析：直接标记、间接标记 双色分析：SimulSET IMK、HLA-B27 多色分析：TriTEST、MultiTEST、ProCOUNT
溶血：FACS Lysing Solution 细胞打孔：FACS Perm2 固定：1%多聚甲醛
荧光素吸收激光能量 荧光素将吸收能量释放，转换为
振动能和热能 释放较入射光波长更长的光量子
荧光素与特异抗体结合 荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信
号越强
荧光信号
FALS Sensor
Freq
Fluorescence detector (PMT3, PMT4 etc.)
Fluorescence
流式细胞仪的电子系统
进行信号检测和分析 当细胞携带荧光素标记物, 通过激光照射区时,
受到激发, 产生不同波长的、代表细胞内不同物 质的荧光信号 荧光信号由光电接收器接收，转变为电信号， 可分析电压脉冲的高度、面积和宽度 电脉冲信号经A/D转换成数字信号 数字信号传送到计算机，进行储存、 作图、 统计分析
荧光信号
激发光源与荧光标记物
流式细胞术样本来源
细胞悬液：
分离PBMC、PRP等：操作复杂，分离、离心步骤导 致细胞特定群体丢失，并可能引入某些误差
流式细胞仪培训ppt课件
慢性活动性肝 炎、肝硬化
肿瘤
降低
降低 降低
正常或 增高 增高
降低 降低 降低 降低
.
用荧光标记抗体
抗体特异性地结合细 胞上对应的抗原
表达该抗原的细胞被 标记上荧光； 抗原表达多的细胞荧 光强度强
.
阳性细胞百分 比或浓度
靶蛋白浓度
淋巴细胞CD抗原的流式细胞检测
收集透镜
光信号收集
3
带通滤波片 光电倍增管
.
光信号
FSC SSC FL1 FL2 FL3
数据处理
电信号
对数 线性 线性 线性 对数
脉冲处理，模数转换 （面积，峰高，宽度）
记录数据，显示结果
.
流式细胞仪产生的信号 非荧光信号
颗粒度
细胞大小
.
荧光信号
FL1 – FITC,GFP…(PMT2) FL2 – PE (PMT3) FL3 – ECD,PI… (PMT4) FL4 – PC5,APC… (PMT5)
633nm空冷激光： APC、APC-CY7 、CY5
90-4水冷激光：UV（333-364nm） HOECHST 33342、DAPI …
.
三、流式细胞仪应用
.
流式细胞仪应用
Ø 淋巴细胞免疫功能测定 Ø 干细胞研究 Ø 细胞增殖与凋亡检测 Ø 细胞周期及倍体分析 Ø 细胞活性分析 Ø 细胞分选 Ø ……
Focused laser beam
流 动 室
.
流式细胞仪光路图
620BP FL3 (ECD)
575BP FL2 (PE)
525BP FL1 (FITC)
Air-cooled Argon Ion Laser
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
ppt课件
9
常用荧光染料的特性
荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途
颜色
FITC
488
525
免疫荧光 绿色
PE(RD1) 488
575
免疫荧光 橙色
ECD
488
620
免疫荧光 橙红
PeCy5 488
675
免疫荧光 红
PI
488
620
DNA染色 橙红
PECy7 488
755
免疫荧光 深红
ppt课件
7
流式细胞检测样本的制备： 细胞样本的处理： 组织样本的处理 流式细胞仪检测的信号： 散射光信号：前向角散射光（Forward scatter， FSC) 与细胞大小有关；侧向角散射(Side scatter ，SSC，又 称90°角散射光）与细胞精细结构和颗粒性质有关，对 胞膜、胞质、核膜变化更敏感。 荧光信号：特异性荧光信号是指将荧光素分子耦联到特 异性抗体或分子上，当其与细胞表面或者胞浆中的抗原 结合后，被特定波长激发光激发而产生的信号； 自发荧光：个别的细胞有着他们各自特异性水平的自发 荧光（荧光信号产生于他们自身）。
流式细胞仪 FLOWபைடு நூலகம்CYTOMETER
基本概念和原理
ppt课件
1
2003年推出世界上第一台单激光五色的流式细 胞仪FC500/MCL，2005年升级为FC500/MPL
Cytomics FC500
ppt课件
2
流式细胞术的基本概念
流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种可 以快速、准确、客观，能够同时检测快速直线流 动状态中的单个细胞的多项物理及生物学特性， 加以分析定量的技术，并且可以对特定群体加以 分选。其中用到的流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集激光技术、电子物理技术、光电测量技术 、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆 抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。在国外 又把流式细胞仪称为荧光激活细胞分选器（ Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS），所 以目前大多数流式细胞仪机型都以FACS命名。
ppt课件
3
分流式细胞术的基本特点
分析对象：单细胞悬液或生物微粒；
分析速度：快速，可高达104个细胞/秒；
检测参数：多参数（散射光参数、荧光 参数）；
可同时检测多种可溶性成分：流式微球 芯片技术（Cytometric Beads Array, CBA）
强大的细胞分选功能：在分析的同时可 以对特定群体加以分选。
PerCP 488
670
APC
633
670
ppt课件
10
5 Color Single Laser (488nm)
FITC/PE/ECD/PC5/PC7
ppt课件
11
流式细胞仪的工作原理
采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色 性与激发效率；
利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术， 保证检测的灵敏度和特异性；
ppt课件
8
流式细胞术的常用试剂：
荧光染料：荧光染料也称荧光素，根据其应用的领域不同主要分为核酸染料和 蛋白染料。 1. 核酸染料：是指能与DNA或与RNA结合的染料，它们在激光器激发的发射光 能被检测器收集，主要用于检测核酸含量以及细胞周期，也可以与荧光染料两 河应用，判断细胞的生物学活性。常用的有碘化丙啶（Propidine Iodide, PI） 、DAPI及7-氨基放线菌素D（7-Aminoactinomycin D ，7-AAD）等。 2.蛋白染料：蛋白染料有多种，大多数是与蛋白中的某些氨基酸基团形成稳定 的结合，如CFSE是最常用的活细胞染料，也称CFDA-SE或CFDA，它与胞内 蛋白赖氨酸侧链及可利用的氨基发生不可逆结合，随着细胞分裂而被减，广泛 用于细胞体外增殖或是体内示踪等。除此之外，蛋白染料更为广泛的用途在于 标记生物大分子，其中主要是抗体。这些抗体与染料结合以后，形成荧光抗体 ，与细胞表面或是胞浆中的抗原特异性结合后，经流式细胞仪检测，从而反映 抗原的表达及分布情况。 这类染料主要有异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate，FITC）、藻红 蛋白（Phycoerythrin ，PE or R-PE）、别藻红蛋白（Allophycocyanin ，APC ）、多甲藻叶绿素蛋白（Peridinin chlorophyll protein ，PerCP）等等，目前世 界上最大的荧光染料生产商当属Invitrogen旗下Molecular Probes公司。
流式细胞术：能快速（可达104细胞/秒）、定位 （胞膜或胞浆）、定量（细胞的相对或绝对计数、 蛋白的表达水平）并且高灵敏度和高特异性地检测 多种活性蛋白的共表达情况，同时也是一项可以把 具有相同荧光信号特性的某些细胞亚群从多细胞群 体中分离和富集出来的细胞分析技术。因此与上述 多种生物检测方法相比有明显的优势。
ppt课件
4
流式细胞术的检测范围
细胞结构：包括细胞的大小、颗粒度、表 面积、DNA含量及细胞周期和RNA的含量 等。 细胞功能：细胞表面或胞浆、核内的特异 性抗原、细胞因子、受体；蛋白磷酸化、 pH值及细胞钙例子浓度等。
ppt课件
5
流式细胞术的优势
目前有多种方法能够检测蛋白的表达，如免疫印 迹、酶联免疫吸附测定、免疫组织化学以及免疫荧 光等。它们与流式细胞术相比各有侧重。
用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的
多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度 与统计分析精确性。
ppt课件
12
流式细胞仪的基本结构
（1） 液流系统 （2） 光学系统 （3） 数据处理系统
ppt课件
13
液流系统
ppt课件
6
酶联免疫吸附测定：定量检测细胞或组织液中蛋白的表达， 不能体现细胞或组织定位以及多种蛋白的共表达情况。灵敏 度高，特异性低。 免疫组织化学：能直观的定位蛋白在组织中的分布，不能定 量。操作步骤多，灵敏度低，假阳性率高。 免疫荧光：能直观体现蛋白的亚细胞定位，相对定量，不能 同时大量检测多种不同蛋白的共表达。 免疫印迹：定性、相对定量检测细胞或组织液中蛋白的表达 ，不能代表蛋白的天然状态、细胞或组织定位以及两种以上 蛋白的共表达情况。操作繁琐，灵敏度低。