孔雀石绿、亮绿检测方法-液质联用

超高效液相色谱-串联质谱法同时检测水产品中孔雀石绿

（隐）、结晶紫（隐）和亮绿

陈军（龙大食品检测中心）

摘要： 采用乙腈提取水产品组织中的目标物，液液分配到二氯甲烷层，10%氯化钠水溶液去除水溶性

杂质，无水硫酸钠脱水及过滤固体杂质。浓缩定容后，过中性氧化铝柱净化，采用UPLC/MS/MS 进行检测，方法简便、快捷、稳定、灵敏度高，定量下限为0.0005mg/kg，可满足水产品亮绿药物的检测的要求。

检测项目：亮绿（brilliant green ，BG ）属于碱性三苯甲烷类染料，具有类似的结构，在水产养殖过程中，

常作为杀菌剂和抗寄生虫药，用于防治各种鱼病。由于三苯甲烷具有致突变、致畸和致癌作用，

欧美、中国和日本等宣布严禁在水产养殖中使用孔雀石绿和结晶紫，并规定孔雀石绿（含隐色

孔雀石绿）和结晶紫（含隐色结晶紫）不得检出。

【药代动力学】

。

适用范围：本方法适用于虾、鱼、蟹等水产样品以上五种药物残留量的检测。

实验部分：

一、试剂与材料 1.1试剂

1.1.1 乙腈（色谱纯） 1.1.2 超纯水

1.1.3 无水硫酸钠（分析纯） 1.1.4 氯化钠（分析纯） 1.1.5 异丙醇（分析纯） 1.1.6 甲酸（色谱纯） 1.1.7 冰乙酸（色谱纯） 1.1.8 乙酸铵（色谱纯） 1.1.9 甲醇（色谱纯） 1.2仪器材料

1.2.1 飞利浦食品加工机

U

n R

e g

i s

t e

r e

d

1.2.2 50ml 带盖离心管 1.2.2 离心机

1.2.3 250mL 分液漏斗

1.2.4 中性氧化铝小柱(LC-Alumina-N)：100mg,3mL 1.2.5 旋涡混合仪 1.2.6 150mL 茄形瓶 1.2.7 氮吹仪 1.2.8 移液管 1.2.9 滤纸 1.2.10 UPLC/MS/MS

1.3 溶液

1.3.1 0.1甲酸乙腈：取0.5mL 甲酸加入到500mL 的乙腈中，摇匀。

1.3.2 5mmol/L 乙酸铵0.1%甲酸水溶液：称取0.19g 乙酸铵溶于500mL 水，然后向其中加入0.5mL

甲酸，摇匀。

1.3.3 定溶液：乙腈：5mmol/L 乙酸铵（PH4.5）=8：2，用冰乙酸调节pH=4.5. 二、实验方法

2.1 取500g以上的可食用部分组织充分绞碎混匀后，称取5.00g至50ml离心管中。

2.2 向离心管中加入15mL乙腈，充分振荡提取，旋涡混合3min，以5000r/min离心分离，重复提取

一次，合并两次上清液，并转入250ml分液漏斗中

2.3 向分液漏斗中加入20mL 10%氯化钠水溶液，20mL二氯甲烷，振荡3min（注意放气），静置分层后，去除下层水相；上层乙腈和二氯甲烷层过预先用乙腈淋洗的无水硫酸钠脱水净化，并收集到茄形瓶中，然后用20mL乙腈分数次洗涤硫酸钠，滤液一并转入茄形瓶中 2.4 向茄形瓶中加入10mL异丙醇, 40℃以下浓缩至干，用2ml定溶液溶解残渣，

2.5 残渣溶解液过中性氧化铝，前面3-5滴滤液弃去，随后的滤液全部收集过0.2um滤膜， UPLC-MS-MS分析 三、仪器条件

3.1 液相条件

使用含0.1%甲酸的5mmol/L 乙酸铵水溶液和含0.1%甲酸的乙腈做流动相， A : 5mmol/L 乙酸铵0.1%甲酸水溶液 B：0.1%甲酸乙腈

U

n R

e g

i s

t e

r e

d

Time(min) Flow(ml/min)

A% B% curve 1 Initial 0.25 80 20 Initial 2 1.0 0.25 80 20 6 3 1.5 0.25 20 80 6 4 3.0 0.25 20 80 6 5

4.0

0.25

80

20

1

3.2 质谱条件 3.2.1 ESI+模式

3.2.2 质谱参数：capillary(KV):3.0 Extractor(V):3.00

RF lens(V):0.3 source temp ：110℃ desolvation temp:350℃

desolvation gas ：600L/h cone gas ：50L/h

3.2.3监测离子对

名称 parent （Da ）

daughter （Da ） Dwell （s ） Cone （V ） coll energy(ev)

Delay （s ） 297.38 0.025 30 30 0.02 BG 385.77 341.41

0.025 30 30 0.02 208.01 0.025 35 35 0.02 MG 329.26 313.13

0.025 35 35 0.02 239.08

0.025 50 30 0.02 LMG 331.2 316.12 0.025 50 22 0.02 340.11 0.025 25 55 0.02 CV 372.2

356.16 0.025 25 40 0.02 238.03 0.025 42 28 0.02 LCV

374.16

358.13

0.025

45

22

0.02

四、实验数据

1、标准曲线线性

将浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10μg/L 的混合标准系列，依次进样，进样量均为5μL

药物名称 MG LMG CV LCV BG

线性相 关系数

0.998026

0.994963

0.995248

0.992089

0.995605

评价在0-10μg/L 此范围内五种化合物标准品在仪器上成线性响应。 2、仪器检测限

进样0.5μg/L 的五种化合物的混合标准物质，在UPLC/MS/MS 上的信噪比分别为：

U

n R

e g

i s

t e

r e

d