《细胞转染技术》PPT课件
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目的DNA与宿主 染色体 表达持续时间
筛选办法
瞬时转染 快速分析
未整合
稳定转染
为获得稳定表达 外源基因的单细 胞克隆
整合
随细胞分裂而稀 释至丢失48－72 小时
随宿主细胞本身 基因组一样复制， 转录，翻译，并 被稳定遗传
抗生素抗性
抗生素抗性
基因转染真核细胞的方法
转染方 法
化学 转染法
物理 转染法
病毒 感染法
人的微孔。电穿孔技术可用于瞬时转染和稳定转染，可方便 地用于悬浮细胞，重现性好，但需要较多的细胞。影响转染 效率的主要因素是脉冲强度和持续时间。必须找到能够使核 酸有效释放而又不杀死细胞的最佳平衡点。
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12
(2）显微注射法 该法虽然费力，但却是非常有效的将核酸导人细
胞或细胞核的方法。这种方法常用来制备转基因动物， 但不适用于需要大量转染细胞的研究。 （3）基因枪法
转染的影响因素
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16
细胞
（1）分裂细胞相比较非分裂细胞 （2）贴壁细胞相比较悬浮细胞 （3）传代次数 （4）细胞数量（融合率）
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17
2 交叉污染
如果同一个实验室同时培养不同种类的细胞，那就有 可能发生交叉污染，即使遵循最严格的分离操作规程 这种情况也有可能发生。如有许多细胞系被HeLa细胞 所污染。和其他细胞系之间的交叉污染不总是能通过 镜检发现。如果有少量某种生长快速的细胞掺入到培 养细胞种，几个月过后它们就会完全取代目标培养物。
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8
此图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒 进入细胞的一般过程。
【主要应用】:瞬时转染 稳定转染.
【特点】：使用方法简单，可携带大片段DNA，通用于 各种类型的裸露DNA或RNA，能转染各种类型的细胞， 没有免疫原性。虽在体外基因转染中有很高的效率， 但在体内，能被血清清除，并在肺组织内累积，诱发 强烈的抗炎反应，导致高水平的毒性，很大程度上应 用受限制。
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6
磷酸钙共沉淀转染法
由于试剂易得、价格便宜而被广泛用于瞬时转染 和稳定染的研究。方法是，先将DNA和氯化钙混合，然 后加人到PBS中慢慢形成DNA磷酸钙沉淀，后把含有沉 淀的混悬液加到培养的细胞上，通过胞膜的内吞作用 摄人DNA。
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7
脂质体介导法（目前应用最广泛）
原理：阳离子脂质体试剂与DNA混合后，形成一种稳定的 脂质双层复合物，DNA被包在脂质体中间，这种脂质双 层复合物可直接加到培养的细胞中，脂质体粘附到细 胞表面并与细胞膜融合，DNA被释放到胞浆中。
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18
3 载体DNA
对纯化所得的载体进行质量鉴定。确定维持其正 常功能的基因序列是否适合于您的细胞体系。在测定 细胞体系的参数时，一定要选用一种已知具有功能的 载体做对照。
（1）载体完整性 （2）载体制备物
精选课件pptቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
19
4 组织培养试剂
一般原则：优化您的细胞生长条件。只使用新鲜配制的 培养基和添加剂，并尽可能减少所用试剂的变更。
该法依靠携带了核酸的高速粒子而将核酸导人细 胞内，这种方法适用于培养的细胞和在体的细胞。
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13
实验室用到的转染方法
脂质体介导法
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14
细胞转染Lipofectamine 2000转染试剂：以HEK193细胞 为例：
转染前一天，将细胞铺到培养皿中， 加入有血清无双抗的培养基（15ml）； 24小时候换上无血清无双抗的培养基12ml； 将所需的质粒用1.5ml无血清无双抗的培养基稀释；取
40ul的Lipofectamine 2000加入无血清无双抗的培养 基稀释，室温放置5min； 5min后将质粒和Lipofectamine 2000混合在一起，室 温放置20min后加入培养皿中，4h后换上完全培养基 48h培养； 注：24h看一次，如果培养基变颜色换培养基；
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15
(1)基础培养基 (2)胎牛血清 (3)添加剂
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20
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10
利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因 此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长 短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问 题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有 巨大的作用。
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11
物理方法(电穿孔、显微注射及基因枪)
（1）电穿孔法 利用高压电脉冲对细胞膜的干扰，使其形成利于核酸进
细胞转染技术
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1
一 ：转染的简介 二 ：转染的分类 三： 转染的方法
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2
一 、 转染的简介
1.基因转染:将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并 使核酸在细胞内维持其生物功能。
2.基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究和基因治 疗研究。
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3
二 、转染的分类
目的
DEAE一 葡聚糖法
磷酸钙法
人工 脂质体法
显微 注射法
电穿孔法 基因枪法 逆转录病毒
腺病毒
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5
DEAE-葡聚糖法
是最早应用哺乳动物细胞转染的试剂之一。DEAE葡聚糖是阳离子多聚体,它与带负电的核酸结合后接近 细胞膜而被摄取。DEAE一葡聚糖转染已成功地应用于 瞬时开始，但用于稳定转染却不可靠。
筛选办法
瞬时转染 快速分析
未整合
稳定转染
为获得稳定表达 外源基因的单细 胞克隆
整合
随细胞分裂而稀 释至丢失48－72 小时
随宿主细胞本身 基因组一样复制， 转录，翻译，并 被稳定遗传
抗生素抗性
抗生素抗性
基因转染真核细胞的方法
转染方 法
化学 转染法
物理 转染法
病毒 感染法
人的微孔。电穿孔技术可用于瞬时转染和稳定转染，可方便 地用于悬浮细胞，重现性好，但需要较多的细胞。影响转染 效率的主要因素是脉冲强度和持续时间。必须找到能够使核 酸有效释放而又不杀死细胞的最佳平衡点。
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(2）显微注射法 该法虽然费力，但却是非常有效的将核酸导人细
胞或细胞核的方法。这种方法常用来制备转基因动物， 但不适用于需要大量转染细胞的研究。 （3）基因枪法
转染的影响因素
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细胞
（1）分裂细胞相比较非分裂细胞 （2）贴壁细胞相比较悬浮细胞 （3）传代次数 （4）细胞数量（融合率）
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2 交叉污染
如果同一个实验室同时培养不同种类的细胞，那就有 可能发生交叉污染，即使遵循最严格的分离操作规程 这种情况也有可能发生。如有许多细胞系被HeLa细胞 所污染。和其他细胞系之间的交叉污染不总是能通过 镜检发现。如果有少量某种生长快速的细胞掺入到培 养细胞种，几个月过后它们就会完全取代目标培养物。
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此图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒 进入细胞的一般过程。
【主要应用】:瞬时转染 稳定转染.
【特点】：使用方法简单，可携带大片段DNA，通用于 各种类型的裸露DNA或RNA，能转染各种类型的细胞， 没有免疫原性。虽在体外基因转染中有很高的效率， 但在体内，能被血清清除，并在肺组织内累积，诱发 强烈的抗炎反应，导致高水平的毒性，很大程度上应 用受限制。
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磷酸钙共沉淀转染法
由于试剂易得、价格便宜而被广泛用于瞬时转染 和稳定染的研究。方法是，先将DNA和氯化钙混合，然 后加人到PBS中慢慢形成DNA磷酸钙沉淀，后把含有沉 淀的混悬液加到培养的细胞上，通过胞膜的内吞作用 摄人DNA。
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脂质体介导法（目前应用最广泛）
原理：阳离子脂质体试剂与DNA混合后，形成一种稳定的 脂质双层复合物，DNA被包在脂质体中间，这种脂质双 层复合物可直接加到培养的细胞中，脂质体粘附到细 胞表面并与细胞膜融合，DNA被释放到胞浆中。
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3 载体DNA
对纯化所得的载体进行质量鉴定。确定维持其正 常功能的基因序列是否适合于您的细胞体系。在测定 细胞体系的参数时，一定要选用一种已知具有功能的 载体做对照。
（1）载体完整性 （2）载体制备物
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19
4 组织培养试剂
一般原则：优化您的细胞生长条件。只使用新鲜配制的 培养基和添加剂，并尽可能减少所用试剂的变更。
该法依靠携带了核酸的高速粒子而将核酸导人细 胞内，这种方法适用于培养的细胞和在体的细胞。
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13
实验室用到的转染方法
脂质体介导法
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14
细胞转染Lipofectamine 2000转染试剂：以HEK193细胞 为例：
转染前一天，将细胞铺到培养皿中， 加入有血清无双抗的培养基（15ml）； 24小时候换上无血清无双抗的培养基12ml； 将所需的质粒用1.5ml无血清无双抗的培养基稀释；取
40ul的Lipofectamine 2000加入无血清无双抗的培养 基稀释，室温放置5min； 5min后将质粒和Lipofectamine 2000混合在一起，室 温放置20min后加入培养皿中，4h后换上完全培养基 48h培养； 注：24h看一次，如果培养基变颜色换培养基；
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(1)基础培养基 (2)胎牛血清 (3)添加剂
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10
利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因 此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长 短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问 题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有 巨大的作用。
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11
物理方法(电穿孔、显微注射及基因枪)
（1）电穿孔法 利用高压电脉冲对细胞膜的干扰，使其形成利于核酸进
细胞转染技术
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1
一 ：转染的简介 二 ：转染的分类 三： 转染的方法
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2
一 、 转染的简介
1.基因转染:将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并 使核酸在细胞内维持其生物功能。
2.基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究和基因治 疗研究。
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3
二 、转染的分类
目的
DEAE一 葡聚糖法
磷酸钙法
人工 脂质体法
显微 注射法
电穿孔法 基因枪法 逆转录病毒
腺病毒
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5
DEAE-葡聚糖法
是最早应用哺乳动物细胞转染的试剂之一。DEAE葡聚糖是阳离子多聚体,它与带负电的核酸结合后接近 细胞膜而被摄取。DEAE一葡聚糖转染已成功地应用于 瞬时开始，但用于稳定转染却不可靠。