《细胞转染技术》PPT课件
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细胞转染PPT课件
蛋白转染
Adherent cell lines
3T3 L1 A549 BHK-21 CaSki CHO CV-1 HEK-293
60-80% 80% 30-40% 80-90% 80-90% 50% 45-55%
HeLa HepaRG MCF-7 MLE-15 NIH-3T3 RAW 264.7 Si Ha
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技术原理
蛋白转染
PULSin™: cationic amphiphilic-based formulation
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操作步骤
蛋白转染
For 24-well plate:
细胞融合度：70-80%
1 稀释蛋白：1µg of protein/100µl Hepes 2 加 4 µl PULSin™ 3 孵育 15 min
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细胞转染难易比较
体外转染
Adherent > Suspension
Problem: Membrane
E.g.:
THP1, Jurkat…
Fast dividing cell > non dividing cell
Problem: Access to the nucleus
E.g.:
k562gapdh788thp1gapdh818sirna转染转染第32页共73页原代细胞的高效沉默24wellplatebrancheddnaassay20406080100120nmsirnaconcentrationsirnagapdhsirnamm20406080100120nmsirnaconcentrationsirnagapdhsirnamm96人原代肝实质细胞人原代纤维原细胞82sirna转染转染第33页共73页interferin优势低浓度sirna甚至pmol级别就能达到高效的基因沉默在反向操作转染中的效率高sirna转染转染第34页共73页sirna转染竞争对手lipofectamine2000invitrogenolgofectamineinvitrogenhiperfectqiagensilentfectbioradlargestsirnatransfectionmarketdangerousoutsiderhiperfectsirna转染转染第35页共73页nterferinvslipofectamine2000interferinlipofectamine2000sirna浓度nmsirna降低成本20100nmsirna40nm血清和抗生素不受血清和抗生素影响不能加入抗生素基因沉默效率90以上操作即用型简单需稀释复杂细胞毒性无细胞毒性细胞毒性大sirnareagentwell24well06pmol13ul1050pmol0515ul价格第36页共73页nterferinvsoligofectamineinterferinoligofectaminesirna浓度nmsirna100nmsirna血清和抗生素不受血清和抗生素影响不能加入抗生素基因沉默效率90以上一般操作即用型简单需稀释复杂细胞毒性无细胞毒性细胞毒性大sirnareagentwell24well06pmol13ul60pmol3ul价格第37页共73页nterferinvshiperfectsilentfectinterferinhiperfectsilentfectsirna浓度nmsirna5nmsirna10nmsirna细胞融合度305050805090基因沉默效率高见表见表见表细胞毒性无细胞毒性细胞毒性较小细胞毒性大sirnareagentwell24well06pmol84ng13ul375ng3ul价格
细胞转染技术 PPT
脂质体介导法（目前应用最广泛）
原理：阳离子脂质体试剂与DNA混合后，形成一 种稳定的脂质双层复合物，DNA被包在脂质体中 间，这种脂质双层复合物可直接加到培养的细胞 中，脂质体粘附到细胞表面并与细胞膜融合， DNA被释放到胞浆中。
【主要应用】:瞬时转染 稳定转染.
【特点】：使用方法简单，可携带大片段DNA， 通用于各种类型的裸露DNA或RNA，能转染 各种类型的细胞，没有免疫原性。虽在体外基 因转染中有很高的效率，但在体内，能被血清 清除，并在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反 应，导致高水平的毒性，很大程度上应用受限 制。
将细胞稀释到1000个细胞/mL ，每孔100μl加 入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0， 100， 200，300， 400，500， 600，700，800， 900， 1000，1100μg/ml等12个级别，选择出在 10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行 下一步的筛选试验。一般400-800 μg/ml左右。
最常见的载体上带有新霉素抗性基因neo， 所以筛选的时候用G418 。G418是目前获 得稳转最常用的试剂之一。
ห้องสมุดไป่ตู้
G418是一种氨基糖苷类抗生素，其结构与 新霉素，庆大霉素，卡那霉素相似，通过 影响干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成， 对原核和真核细胞等产生毒素，包括细菌 ，酵母，植物和哺乳动物细胞，也包括原 生动物和蠕虫。
鉴定之后
一般经过4周左右的筛选，得到的阳性克隆都 比较稳定。但是外源基因如果没有整合到基因组中 的话，目的基因还是很容易丢失的。但是外源基因 整合到基因组中的概率太小了，而且是随机整合， 会导致表达的目的蛋白的量产生很大差异。随着培 养时间的延续，那些丢失了外源基因的细胞和很少 表达目的基因的细胞会占据优势，强表达目的蛋白 的细胞会越来越少。这样再次筛选是必不可少的。 只有经过2次以上的筛选之后才能找到那种我们想 要的遗传稳定的细胞克隆。
1. 细胞转染技术
慢病毒载体——介绍
慢病毒（Lentiviruses）属于逆转录病毒科。 慢病毒核蛋白质前整合复合物具有噬核特性，病毒基因组运 输至细胞核，从而使慢病毒可以感染和在非有丝分裂细胞中 复制。这一特性使慢病毒成为基因治疗的转移载体。
HIV（Human immunodeficiency virus） EIAV（Equine infectious anemia virus） FIV（Feline immunodeficiency virus） SIV（Simian immunodeficiency virus） 其中研究最多最为透彻的是HIV。
DOSPA
阳离子脂质体转染
阳离子脂质体转染——原理
1. Formation of Lipoplexes
2. Get into the cell
3. Get into the nuclear
Lipoplexes的形成
Lipoplexes的形成
FIGURE: Electron microscopy of DNA-liposome complexes. (A-E) Complexes prepared from a constant amount of DNA (3.5 μg/mL) and a gradually increasing amount of cationic liposomes. LiposometoLDNA'ratios (in terms of positive to negative charges) are (A) 0.2, (B) 0.4, (C) 0.6, (D) 1.0, and (E) 1.5. Note the aggregated (B-D) versus fused (E) complexes. Scale bar represents 0.5 μm.(1993, Hezi Gershon)
细胞转染
ShineGene Molecular Biotech,Inc. 上海闪晶分子生物科技有限公司 二. 实验材料与器材
1）材料 293T 细胞 MyoD 表达质粒和 EGFP 表达质粒 DMEM 培养基 链霉素/青霉素（双抗） FCS（小牛血清） PBS（磷酸盐缓冲溶液） 胰酶/EDTA 消化液 转染试剂（TransFast） 2）器材 20ul/200ul/1ml 微量移液器和 Tip 头 酒精灯 废液缸 血球计数板 涡旋振荡器 恒温水浴箱 台式离心机 35mm 培养皿 转染管 15ml 离心管 观察用倒置显微镜 荧光显微镜和 CCD
6 。
7） 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 8） 到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养 24－48 小时。 第二次细胞传代 1） 2） 在转染后 24 小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度 0.8X10 个细胞/35mm 培养皿将细胞重新粉入 培养皿中。 3） 在正常条件下培养 24 小时后按照染色要求条件固定。
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Add: Floor 2,Building A,328#, Wuhe Road,Minhang District,Shanghai,201109,China Tel: +86-21-54460832 Web: Fax:+86-21-54460831 E-mail: master@
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(3) 用 Tip 头加入 1ml Trypsin 液，消化 1 分钟（37 C，5%CO2 )。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞 完全从壁上脱落下来为止。 (4) 加入 1ml 的含血清培养基终止反应。 (5) 用 Tip 头多次吹吸，使细胞完全分散开。 (6) 将培养液装入离心管中，1000rpm 离心 5min。 (7) 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择 0.8X10 个细胞加入一个 35mm 培养皿。 (8) 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。 (9) 将培养皿转入 CO2 培养箱中培养，第二天转染。 细胞转染 1）转染试剂的准备 A. 将 400ul 去核酸酶水加入管中，震荡 10 秒钟，溶解脂状物。 B.震荡后将试剂放在－20 摄氏度保存，使用前还需震荡， 。 2） 选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA 质量）来转染细胞。在一个转染管中加入 合适体积的无血清培养基。加入合适质量的 MyoD 或者 EGFP 的 DNA，震荡后在加入合适体积的转染 试剂，再次震荡。 5） 将混合液在室温放置 10—15 分钟。 6) 吸去培养板中的培养基，用 PBS 或者无血清培养基清洗一次。
细胞转染
细胞转染转染技术是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。
常规的转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。
前者外源DNA/RNA不整合到宿主的染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其他调控元件的分析。
一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24—72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。
后者也称稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体存在。
尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。
外源DNA整合到染色体中的概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH：新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。
转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂的比例、细胞数量、培基及检测时间等。
转染效率受多种因素影响，主要因素有下面几个：1、转染试剂不同细胞系转染效率通常不同，但细胞系的选择通常是根据实验的需要，因此在转染实验前根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。
每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献，通过这些资料可选择最合适实验设计的转染试剂。
当然，最适合的是高效、低毒、方便、廉价的转染试剂。
2、细胞状态一般低的细胞代数（<50代）能确保基因型不变。
最适合转染的细胞是经过几次传代后达到指数生长期的细胞，细胞生长旺盛，最容易转染。
细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化。
这会导致和转染相关的细胞行为的变化。
也就是说同一种系的细胞株，在各实验室不同培养条件下，其生物学性状发生不同程度的改变，导致其转染特性也发生变化。
因此，如果发现转染效率降低，可以试着转染新鲜培养的细胞以恢复最佳结果。
细胞转染技术 PPT
人的微孔。电穿孔技术可用于瞬时转染和稳定转染，可方便 地用于悬浮细胞，重现性好，但需要较多的细胞。影响转染 效率的主要因素是脉冲强度和持续时间。必须找到能够使核 酸有效释放而又不杀死细胞的最佳平衡点。
(2）显微注射法 该法虽然费力，但却是非常有效的将核酸导入细
胞或细胞核的方法。这种方法常用来制备转基因动物， 但不适用于需要大量转染细胞的研究。 （3）基因枪法
最常见的载体上带有新霉素抗性基因neo， 所以筛选的时候用G418 பைடு நூலகம்G418是目前获 得稳转最常用的试剂之一。
G418是一种氨基糖苷类抗生素，其结构与 新霉素，庆大霉素，卡那霉素相似，通过 影响干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成， 对原核和真核细胞等产生毒素，包括细菌 ，酵母，植物和哺乳动物细胞，也包括原 生动物和蠕虫。
当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的 地方后，则能启动neo基因编码的序列转录 为mRNA，使细胞获得抗性而能在含有 G418的选择性培养基中生长。目前G418 的这一特性已在基因转移，敲除，抗性筛 选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
筛选之前
由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的 厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在 筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如 下：
加药时间
由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出 蛋白质。所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转 染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增殖较慢，时间长 了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛 选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加 G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下 降，所以每2~3天都要更换一次含有G418的筛选液。
将细胞稀释到1000个细胞/mL ，每孔100μl加 入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0， 100， 200，300， 400，500， 600，700，800， 900， 1000，1100μg/ml等12个级别，选择出在 10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行 下一步的筛选试验。一般400-800 μg/ml左右。
(2）显微注射法 该法虽然费力，但却是非常有效的将核酸导入细
胞或细胞核的方法。这种方法常用来制备转基因动物， 但不适用于需要大量转染细胞的研究。 （3）基因枪法
最常见的载体上带有新霉素抗性基因neo， 所以筛选的时候用G418 பைடு நூலகம்G418是目前获 得稳转最常用的试剂之一。
G418是一种氨基糖苷类抗生素，其结构与 新霉素，庆大霉素，卡那霉素相似，通过 影响干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成， 对原核和真核细胞等产生毒素，包括细菌 ，酵母，植物和哺乳动物细胞，也包括原 生动物和蠕虫。
当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的 地方后，则能启动neo基因编码的序列转录 为mRNA，使细胞获得抗性而能在含有 G418的选择性培养基中生长。目前G418 的这一特性已在基因转移，敲除，抗性筛 选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
筛选之前
由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的 厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在 筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如 下：
加药时间
由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出 蛋白质。所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转 染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增殖较慢，时间长 了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛 选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加 G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下 降，所以每2~3天都要更换一次含有G418的筛选液。
将细胞稀释到1000个细胞/mL ，每孔100μl加 入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0， 100， 200，300， 400，500， 600，700，800， 900， 1000，1100μg/ml等12个级别，选择出在 10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行 下一步的筛选试验。一般400-800 μg/ml左右。
细胞转染技术课件
细胞转染技术的应用
研究基因功能
基因表达调控
通过转染特定基因，研究其在细胞内的表达调控机制，有助于深入 了解基因的功能和作用。
基因敲除与敲入
利用转染技术将特定基因敲除或敲入细胞中，以探究基因对细胞生 长、分化等过程的影响。
表观遗传学研究
通过转染特定因子或抑制剂，研究表观遗传修饰对基因表达的调控作 用。
与合作。
降低对细胞的毒性
寻找低毒性的转染试剂
研发和选用对细胞毒性更低的转染试剂，减轻对细胞的损伤。
控制转染条件
优化转染条件，如降低转染浓度、减少转染时间等，以减轻对细胞的毒性。
细胞株的选择
选用对转染更具有耐受性的细胞株，降低转染过程中的毒性。
发展新型的转染技术与方法
非病毒载体转染技术
研究和发展非病毒载体转染技术，如纳米材料、基因 编辑技术等，以实现更高效、安全的基因转移。
体内转染技术
探索和发展体内转染技术，提高基因治疗在临床应用 中的效果和安全性。
跨物种转染技术
研究和发展跨物种转染技术，拓宽基因功能研究和基 因治疗的应用范围。
CHAPTER 06
案例分析：某基因的功能研 究
研究背景与目的
某基因在肿瘤发生发展中的重要作用
近年来，研究发现某基因在多种肿瘤中高表达，可能与肿瘤的发生、发展、转移等过程 密切相关。
提高转染效率的方法
预处理细胞
通过药物处理、电穿孔等方式预处理细胞，可以提高细胞膜的通 透性，有利于转染试剂进入细胞。
共转染
同时转染多个基因或质粒，可以提高转染效率和基因表达水平。
筛选稳定转染细胞株
通过药物筛选或克隆选择等方法，筛选出稳定表达目的基因的细胞 株，可以长期保存和应用。
研究基因功能
基因表达调控
通过转染特定基因，研究其在细胞内的表达调控机制，有助于深入 了解基因的功能和作用。
基因敲除与敲入
利用转染技术将特定基因敲除或敲入细胞中，以探究基因对细胞生 长、分化等过程的影响。
表观遗传学研究
通过转染特定因子或抑制剂，研究表观遗传修饰对基因表达的调控作 用。
与合作。
降低对细胞的毒性
寻找低毒性的转染试剂
研发和选用对细胞毒性更低的转染试剂，减轻对细胞的损伤。
控制转染条件
优化转染条件，如降低转染浓度、减少转染时间等，以减轻对细胞的毒性。
细胞株的选择
选用对转染更具有耐受性的细胞株，降低转染过程中的毒性。
发展新型的转染技术与方法
非病毒载体转染技术
研究和发展非病毒载体转染技术，如纳米材料、基因 编辑技术等，以实现更高效、安全的基因转移。
体内转染技术
探索和发展体内转染技术，提高基因治疗在临床应用 中的效果和安全性。
跨物种转染技术
研究和发展跨物种转染技术，拓宽基因功能研究和基 因治疗的应用范围。
CHAPTER 06
案例分析：某基因的功能研 究
研究背景与目的
某基因在肿瘤发生发展中的重要作用
近年来，研究发现某基因在多种肿瘤中高表达，可能与肿瘤的发生、发展、转移等过程 密切相关。
提高转染效率的方法
预处理细胞
通过药物处理、电穿孔等方式预处理细胞，可以提高细胞膜的通 透性，有利于转染试剂进入细胞。
共转染
同时转染多个基因或质粒，可以提高转染效率和基因表达水平。
筛选稳定转染细胞株
通过药物筛选或克隆选择等方法，筛选出稳定表达目的基因的细胞 株，可以长期保存和应用。
细胞转染
磷酸钙法
即磷酸钙共沉淀转染法，先将DNA和氯化钙混合， 然后加入到PBS中慢慢形成DNA磷酸钙沉淀，最 后把含有沉沉淀的混悬液加到培养的细胞上， 通过细胞胞膜的内吞作用摄入DNA。磷酸钙似乎 还通过抑制血清中和细胞内的核酸酶活性而保 护外源DNA免受降解。
磷酸钙法
核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式出现时，可 使DNA附在细胞表面，利于细胞吞入摄取，或通 过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内， 进入细胞的DNA仅有1%～5%可以进入细胞核中， 其中仅有不到1%的DNA可以与细胞DNA整合，在 细胞中进行稳定表达，基因转导的频率大约为 10-4，这项技术能用于任何DNA导入哺乳类动物 进行暂时性表达或长期转化的研究。此方法对 于贴壁细胞转染是最常用并首选的方法。
脂质体转染法
阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸 根通过静电作用，将DNA分子包裹入内，形成 DNA脂复合物，也能被表面带负电的细胞膜吸附， 再通过融合或细胞内吞进入细胞。
脂质体转染法
脂质体转染法
1. 脂质体转染适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养 细胞，可用于瞬时转染和稳定转染。 2. 转染效率高，比磷酸钙法高5-100倍。 3. 能够把DNA和RNA转染到各种细胞。 4. 转染的稳定性好，可重复性高。 5. 转染时最好不加血清和抗生素。 6. 阳离子脂质体细胞毒性相对较高，对部分细胞可 能会干扰细胞的代谢。由于脂质体对细胞有一定 的毒性，所以转染时间一般不超过24小时。 7. 常用细胞类型：cos-7 、BHK、NIH3T3 、Hela等。
理想的细胞转染
转染效率高，不影响细胞正常生理活动 细胞毒性 重复性好 安全 方法简单 省时、经济
报告基因
细胞转染Cell Transfection
细胞培养
• HeLa， HepG-2， NIH /3T3 细胞培养于含 10% 新生小牛血清的 DMEM 高糖培养液， 37 C ， 5% CO2， 90% 相对湿度培养箱中 . 在解冻小鼠 ES 细胞前， 先培养饲养层细胞 C57BL， 待长满后， 用 含 10 ug /mL 的mitomycin C处理 2 ~ 2. 51h， 用 37 C 预热的 PBS 漂洗两次， 加普通培养液过夜培养 . 第二天， 解冻小鼠 ES 细胞， 在含 10% 胎牛血清7 . 175 X 109 pmoI /L LIF饲养层上培养 .
•
转染试剂
细胞状态 转染方法
载体构建
•
细胞培养物 细胞密度 血清
抗生素
氮磷比 DNA质量
1． 转染试剂
• 不同细胞系转染效率通常不同， 但细胞系的选择通常是根据实验 的需要， 因此在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合 的转染试剂。 每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株 列表和文献， 通过这些资料可选择最适合实验设计的转染试剂。 当然， 最适合的是高效、 低毒、 方便、 廉价的转染试剂。
• 小鼠 ES 细胞， 用 冰预冷的 PBS 将处于对数生长期的细胞重悬为 1 X 107 个 /mL， 取 0. 8 mL 细胞悬液与 25 ug 线性化的 Target Vector 混合， 加到 4 mm 电击池， 冰上放置 5 min (对照组室温放置） • 用 电压 240 V,电阻 ,电容 500 uF 和 950 uF 分别进行电穿孔转染， 电击 后冰上放置 5 mi n (对照组室温放置） • 将细胞转移到装有预热培养液的 15 mL 离心管中 ， 轻轻吸打均匀后， 将 细胞悬液平均分到 6 个装有预热培养液（ 含 7 . 175 X109 pmoI /L LIF）铺 好饲养层的 10 cm 培养皿中 ， 摇匀， 常规条件培养 • 24 h后换新鲜培养液， 电击后 48 h,加250ug /mL G418 及 2 umoI /L gancycIovir 进行选择， 每天更换选择培养液
细胞生物学技术课件GFP细胞转染实验讲义
Chemical-based transfection：calcium phosphate ； liposomes Non chemical methods： Electroporation Particle-based methods：gene gun Viral methods：viral transduction Other (and hybrid) methods： nucleofection； heat shock.
这些特殊的结构可以实现目的基因在靶细胞内的稳 定表达
back
载体名称：pEYFP-C1 载体类型：哺乳动物细胞表达载体
载体大小：4.7kb 载体宿主：大肠杆菌，哺乳动物细胞（E.coli, Mammalian cells） 细菌抗性：卡纳（kan） 真核筛选标记：新霉素（Neomycin） 5' 测序引物：EGFP-N Sequencing Primer (#6479-1) 3' 测序引物：EGFP-C Sequencing Primer (#6478-1) 载体描述：encodes an enhanced yellow-green variant of the Aequorea victorioiled plasmid DNA or siRNA constructs), or even proteins such as antibodies, may be transfected.
Transfection of animal cells typically involves opening transient pores or "holes" in the cell membrane, to allow the uptake of material.
这些特殊的结构可以实现目的基因在靶细胞内的稳 定表达
back
载体名称：pEYFP-C1 载体类型：哺乳动物细胞表达载体
载体大小：4.7kb 载体宿主：大肠杆菌，哺乳动物细胞（E.coli, Mammalian cells） 细菌抗性：卡纳（kan） 真核筛选标记：新霉素（Neomycin） 5' 测序引物：EGFP-N Sequencing Primer (#6479-1) 3' 测序引物：EGFP-C Sequencing Primer (#6478-1) 载体描述：encodes an enhanced yellow-green variant of the Aequorea victorioiled plasmid DNA or siRNA constructs), or even proteins such as antibodies, may be transfected.
Transfection of animal cells typically involves opening transient pores or "holes" in the cell membrane, to allow the uptake of material.
细胞转染简介ppt课件
3.DNA片断的重组连接
粘端连接方法要点
平端连接方法要点
①单酶单切点 防自身环化， ①平端，平端连接；
希望定向插入；
②Linker连接酶切产生粘端连接；
③Adaptor衔接目的基因和载体；
②双酶双切点 定向克隆，构
④同源同聚尾，克隆cDNA的最好
建表达载体的最好用此法； 方法
③利用同裂解酶产生相同粘 ⑤T载体，PCR产物T/A克隆法连
（1）逆转录病毒 （2）腺病毒
28
四 转染后筛选
• 筛选所选用的抗生素跟转染所用的质粒上 所带的真核筛选抗性基因有关的 。
• 标有neo（实际上应该是neo resistance） 的载体，指载有降解新霉素的基因，新霉 素作用于原核和真核细胞，对两者都有杀 伤作用。用于转染后，稳定表达外源基因 细胞的阳性筛选。
（1）电穿孔法
利用高压电脉冲对细胞膜的干扰，使其 形成利于核酸进人的微孔。电穿孔技术可用于 瞬时转染和稳定转染，可方便地用于悬浮细胞， 重现性好，但需要较多的细胞。影响转染效率 的主要因素是脉冲强度和持续时间。必须找到 能够使核酸有效释放而又不杀死细胞的最佳平 衡点。
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(2）显微注射法 该法虽然费力，但却是非常有效的将核
A. 典型的哺乳动物细胞表达载体需要以下顺式作用元 件:
a.启动子 b.增强子 c. 多聚腺苷酸化信号 d. 药物选择 标记基
e. 报告基因 f.表位标签
11
B.常用的哺乳动物表达质粒载体 a. pcDNA3.l b. pSI c. pCMV-HA d. pBudCE4.1 e. pTRE
12
2）病毒型载体
38
• 6 时间进度 • 一般原则提示：要确保最终结果的成功；
第6章 细胞转染
寻找与目的基因相关的蛋白
4. Protein expression and antibody preparation
表达蛋白与抗体制备
5. Localization of protein 蛋白在细胞中的定位
The Construction of Adenovirus Vectors
Background
基因表达
1. Prokaryotic expression vector 原核表达载体 2. Baculovirus expression vector 昆虫杆状病毒表达载体 3. Mammalian expression vector 哺乳动物表达载体 4. Adenoviral and retroviral vector 腺病毒及逆转录病毒表达载体
裸DNA直接注射
1990年Wolff等首次注意到给小鼠直接肌肉注射纯 化的DNA或RNA重组表达载体，可使载体上的基因 在局部肌细胞内表达，这种表达可持续数日或更长 时间，且没有检出注射的外源核酸与宿主染色体整 合。 随后的大量动物实验都说明在合适的条件下，DNA 接种后可诱导机体产生细胞及体液免疫。于是，作 为一种新的基因治疗手段——核酸免疫技术应运而 生。
4.
Verify the digestion products on an agarose gel. If digestion is complete, heat inactivate for 20 min at 65º C. 5. Gel-purify the linearized vector. 6. Resuspend purified DNA in order to have at least 2 µg of DNA in 10 µL H2O.
4. Protein expression and antibody preparation
表达蛋白与抗体制备
5. Localization of protein 蛋白在细胞中的定位
The Construction of Adenovirus Vectors
Background
基因表达
1. Prokaryotic expression vector 原核表达载体 2. Baculovirus expression vector 昆虫杆状病毒表达载体 3. Mammalian expression vector 哺乳动物表达载体 4. Adenoviral and retroviral vector 腺病毒及逆转录病毒表达载体
裸DNA直接注射
1990年Wolff等首次注意到给小鼠直接肌肉注射纯 化的DNA或RNA重组表达载体，可使载体上的基因 在局部肌细胞内表达，这种表达可持续数日或更长 时间，且没有检出注射的外源核酸与宿主染色体整 合。 随后的大量动物实验都说明在合适的条件下，DNA 接种后可诱导机体产生细胞及体液免疫。于是，作 为一种新的基因治疗手段——核酸免疫技术应运而 生。
4.
Verify the digestion products on an agarose gel. If digestion is complete, heat inactivate for 20 min at 65º C. 5. Gel-purify the linearized vector. 6. Resuspend purified DNA in order to have at least 2 µg of DNA in 10 µL H2O.
8、细胞转染(脂质体介导法)
中性脂质体的混合物，是对于本次实验中采用的293T细胞优化的转染试剂。
三、实验材料与器材
1材料
293T细胞
MyoD表达质粒和EGFP表达质粒
DMEM培养基
链霉素/青霉素(双抗)
FCS(小牛血清)
PBS(磷酸盐缓冲溶液)
胰酶/EDTA消化液
转染试剂(TransFast)
2、器材
20ul/ 200ul/1ml微量移液器和Tip头
利于形成小的转染复合物，从而提高转染效率，但同时细胞毒性也增大。超高分枝的、较柔
性的PEI衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基，在染实验中发现这种PEI的毒性低，但转染效
率却较高。
Gen Escort是采用各种分枝状和超高分枝状的小分子PEI与各种含有生理条件下可降解键的
交联剂交联，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝结构使得其具有
一、实验目的
学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法——脂质体介导的转染。了解外源基因进入的
一般性方法，观测外源蛋白的表达(绿色荧光蛋白) ，为染色准备实验材料。
二、实验原理
上图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。
外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。电击
法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体
物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了
外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控
制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对 于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。
三、实验材料与器材
1材料
293T细胞
MyoD表达质粒和EGFP表达质粒
DMEM培养基
链霉素/青霉素(双抗)
FCS(小牛血清)
PBS(磷酸盐缓冲溶液)
胰酶/EDTA消化液
转染试剂(TransFast)
2、器材
20ul/ 200ul/1ml微量移液器和Tip头
利于形成小的转染复合物，从而提高转染效率，但同时细胞毒性也增大。超高分枝的、较柔
性的PEI衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基，在染实验中发现这种PEI的毒性低，但转染效
率却较高。
Gen Escort是采用各种分枝状和超高分枝状的小分子PEI与各种含有生理条件下可降解键的
交联剂交联，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝结构使得其具有
一、实验目的
学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法——脂质体介导的转染。了解外源基因进入的
一般性方法，观测外源蛋白的表达(绿色荧光蛋白) ，为染色准备实验材料。
二、实验原理
上图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。
外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。电击
法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体
物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了
外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控
制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对 于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。
细胞转染PPT课件
稳定转染子的选择
• 成功完成稳定转染需要高效DNA输送和筛选获得DNA的细胞的 方法。
• 筛选稳定表达转染DNA的细胞的最可靠方法之一是在用于转 染的DNA重组体或共转染至细胞的独立载体中加入选择标记 物，然后经过短暂的恢复期后，在细胞中应用适当的选择压 力。当共转染载体上表达选择标记物时，携带目的基因的载 体与携带选择标记物的载体的摩尔比应在5:1至10:1范围内， 以确保包含选择标记物的细胞也含有目的基因。
2019/8/2
尽管转染效率因细胞类型的不同而异，在104个转染 细胞中只有大约一个细胞可以稳定整合DNA (不论使用 的是线性还是环状DNA)。
没有一种方法可以适用于所有细胞和所有实验。必须 根据您的细胞类型和实验要求选择理想的方法，必须具 有高转染效率、低血细胞毒性、对正常生理学的影响最 小，且使用简单、可重复。
3、物理方法：将核酸直接导入细胞质或细胞核内。 显微注射、激光介导的转染
阳离子脂质体介导的输送
• 特殊设计的阳离子脂质体(如LipofectamineR转染试剂)可促进 DNA和siRNA进入细胞。基本结构包括带正电荷的头基和一个或 两个碳氢链。
• 采用阳离子脂质体试剂时，带负电荷的DNA与带正电荷的脂质 体自发结合，形成DNA-阳离子脂质体试剂复合物。一般认为， 转染复合物通过内吞作用进入细胞。
• 低毒性：病毒载体应尽量不对其感染的细胞的生理学造 成影响。
• 稳定性：一些病毒具有遗传不稳定性，会迅速重排基因 组。这会对使用病毒载体的操作的可预测性和可重复性产 生不利影响。
• 选择性：病毒载体应包含选择标记物，如特定的抗生素抗 性，从而可以分离出摄取了病毒载体的细胞。
SUCCESS
THANK YOU
细胞转染技术从入门到精通
细胞转染技术从入门到精通概念：概括地说，转染是使用非病毒感染的手段人工引入核酸（DNA或RNA）进入细胞的过程。
转染的目的是产生重组蛋白，或特异性增强或抑制转染细胞中的基因表达。
转染的类型根据导入的核酸存在于宿主细胞的时间长短，可以分为瞬转和稳转。
根据转染方式可以分为化学，生物，物理方法。
瞬转：因为导入的核酸没有整合到宿主细胞基因组，因此它只会短暂地存在于宿主细胞中，不会随着细胞的分裂而进入到子代细胞中。
然而，导入的遗传物质的高拷贝数导致其在细胞内的蛋白质表达水平较高。
根据所使用的载体的不同，瞬转通常可以1至7天内进行基因检测，但是瞬时转染的细胞通常在转染后24-96小时收获。
当使用超螺旋质粒DNA时，瞬时转染的效果最好，推测是由于超螺旋质粒DNA能更有效地被细胞摄取。
稳转：外源DNA整合到细胞基因组中或作为附加体质粒保留在细胞中。
与瞬时转染不同，稳定转染允许外源DNA在转染的细胞及其后代中的长期维持。
然而，通常是将单拷贝或几个拷贝的外源DNA整合到稳定转染的细胞的基因组中，因此，其表达水平一般低于瞬时转染的表达水平。
由于稳转效率较低，因此选用有效地转染策略和筛选方法很重要。
其中比较可靠地筛选方法是在DNA载体中包含选择性标记，然后在细胞转染短暂性恢复后进行适当地选择性加压。
尽管相对于超螺旋DNA，线性DNA被细胞摄取的效率较低，但其能最有效地整合到宿主基因组中。
目前，由于各种转染试剂的发明，哺乳动物细胞的瞬时转染已经用于生产具有适当折叠和翻译后修饰的重组蛋白。
但表达mg/L-g/L 的重组蛋白主要依赖于稳定细胞系的产生。
瞬转和稳转的比较瞬转稳转导入的DNA没有整合到基因组中，而是保留在细胞核上导入的DNA整合到基因组中导入的遗传物质不传递到子代；遗传改变只是暂时的导入的遗传物质能够代代相传；遗传改变是永久的不需要选择性筛选需要选择性筛选出稳定转染的细胞DNA载体和RNA都可用于瞬时转染只有DNA载体可用于稳定转染；RNA本身不能稳定地导入细胞中导入的遗传物质的高拷贝数导致高水平的蛋白质表达。
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6
磷酸钙共沉淀转染法
由于试剂易得、价格便宜而被广泛用于瞬时转染 和稳定染的研究。方法是，先将DNA和氯化钙混合，然 后加人到PBS中慢慢形成DNA磷酸钙沉淀，后把含有沉 淀的混悬液加到培养的细胞上，通过胞膜的内吞作用 摄人DNA。
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Байду номын сангаас
7
脂质体介导法（目前应用最广泛）
原理：阳离子脂质体试剂与DNA混合后，形成一种稳定的 脂质双层复合物，DNA被包在脂质体中间，这种脂质双 层复合物可直接加到培养的细胞中，脂质体粘附到细 胞表面并与细胞膜融合，DNA被释放到胞浆中。
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8
此图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒 进入细胞的一般过程。
【主要应用】:瞬时转染 稳定转染.
【特点】：使用方法简单，可携带大片段DNA，通用于 各种类型的裸露DNA或RNA，能转染各种类型的细胞， 没有免疫原性。虽在体外基因转染中有很高的效率， 但在体内，能被血清清除，并在肺组织内累积，诱发 强烈的抗炎反应，导致高水平的毒性，很大程度上应 用受限制。
该法依靠携带了核酸的高速粒子而将核酸导人细 胞内，这种方法适用于培养的细胞和在体的细胞。
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13
实验室用到的转染方法
脂质体介导法
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14
细胞转染Lipofectamine 2000转染试剂：以HEK193细胞 为例：
转染前一天，将细胞铺到培养皿中， 加入有血清无双抗的培养基（15ml）； 24小时候换上无血清无双抗的培养基12ml； 将所需的质粒用1.5ml无血清无双抗的培养基稀释；取
人的微孔。电穿孔技术可用于瞬时转染和稳定转染，可方便 地用于悬浮细胞，重现性好，但需要较多的细胞。影响转染 效率的主要因素是脉冲强度和持续时间。必须找到能够使核 酸有效释放而又不杀死细胞的最佳平衡点。
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12
(2）显微注射法 该法虽然费力，但却是非常有效的将核酸导人细
胞或细胞核的方法。这种方法常用来制备转基因动物， 但不适用于需要大量转染细胞的研究。 （3）基因枪法
转染的影响因素
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16
细胞
（1）分裂细胞相比较非分裂细胞 （2）贴壁细胞相比较悬浮细胞 （3）传代次数 （4）细胞数量（融合率）
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17
2 交叉污染
如果同一个实验室同时培养不同种类的细胞，那就有 可能发生交叉污染，即使遵循最严格的分离操作规程 这种情况也有可能发生。如有许多细胞系被HeLa细胞 所污染。和其他细胞系之间的交叉污染不总是能通过 镜检发现。如果有少量某种生长快速的细胞掺入到培 养细胞种，几个月过后它们就会完全取代目标培养物。
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10
利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因 此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长 短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问 题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有 巨大的作用。
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11
物理方法(电穿孔、显微注射及基因枪)
（1）电穿孔法 利用高压电脉冲对细胞膜的干扰，使其形成利于核酸进
目的DNA与宿主 染色体 表达持续时间
筛选办法
瞬时转染 快速分析
未整合
稳定转染
为获得稳定表达 外源基因的单细 胞克隆
整合
随细胞分裂而稀 释至丢失48－72 小时
随宿主细胞本身 基因组一样复制， 转录，翻译，并 被稳定遗传
抗生素抗性
抗生素抗性
基因转染真核细胞的方法
转染方 法
化学 转染法
物理 转染法
病毒 感染法
40ul的Lipofectamine 2000加入无血清无双抗的培养 基稀释，室温放置5min； 5min后将质粒和Lipofectamine 2000混合在一起，室 温放置20min后加入培养皿中，4h后换上完全培养基 48h培养； 注：24h看一次，如果培养基变颜色换培养基；
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15
细胞转染技术
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1
一 ：转染的简介 二 ：转染的分类 三： 转染的方法
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2
一 、 转染的简介
1.基因转染:将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并 使核酸在细胞内维持其生物功能。
2.基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究和基因治 疗研究。
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3
二 、转染的分类
目的
DEAE一 葡聚糖法
磷酸钙法
人工 脂质体法
显微 注射法
电穿孔法 基因枪法 逆转录病毒
腺病毒
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5
DEAE-葡聚糖法
是最早应用哺乳动物细胞转染的试剂之一。DEAE葡聚糖是阳离子多聚体,它与带负电的核酸结合后接近 细胞膜而被摄取。DEAE一葡聚糖转染已成功地应用于 瞬时开始，但用于稳定转染却不可靠。
(1)基础培养基 (2)胎牛血清 (3)添加剂
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20
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18
3 载体DNA
对纯化所得的载体进行质量鉴定。确定维持其正 常功能的基因序列是否适合于您的细胞体系。在测定 细胞体系的参数时，一定要选用一种已知具有功能的 载体做对照。
（1）载体完整性 （2）载体制备物
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19
4 组织培养试剂
一般原则：优化您的细胞生长条件。只使用新鲜配制的 培养基和添加剂，并尽可能减少所用试剂的变更。