微生物限度检查方法验证方案

微生物限度检查方法验证方案

微生物限度检查法验证方案

1。目的:

为确认所采用的方法适用于药品微生物限度检查，包括细菌、霉菌、酵母菌和对照菌的计数，特制定本验证方案。通过比较试验菌的复苏生长结果，评价整个试验方法的准确性、有效性和重现性，从而确定试验样品在实验条件下无抑菌活性或抑菌活性可忽略不计。所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。

验证过程应严格按照本计划规定的内容进行。因特殊原因确需变更的，应填写《验证计划变更申请书》，报验证领导小组批准。2.范围: 本验证计划适用于微生物限度检查方法的验证。

3。规范性引用文件:

根据《中国药典》XXXX版附录二附录九J微生物限度检查法的要求，由于部分试验品的抗菌活性，当已建立的微生物检查方法或产品的成分发生变化或原检查方法的检查条件发生变化时，可能会影响检查结果的准确性。因此，必须验证测试物品的抗菌活性和测试方法的可靠性。4.验证和实施:

4.4.1试验前准备:

4.4.1.1试验设备的准备:试管、刻度移液器、薄膜过滤器、滤膜(孔径0.22um，直径50毫米)、平皿、空三角瓶、称重纸等。试验要求用牛皮纸包裹，放在湿热灭菌器中，在121℃灭菌30分钟，3天内使用4.4.1.2试验培养基的制备:取脱水培养基如营养琼脂培养基、玫瑰红

钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基(BL)、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡萄糖醛酸苷培养基(MUG)等经适用性检验合格的脱水培养基，按相应的制备说明用纯净水配制，分装，2小时内放入湿热灭菌器中，121℃灭菌15分钟，3周内使用

4.4.1.3试验用稀释液/缓冲液和冲洗液的配制:取有效期内的试剂，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%

无菌氯化钠溶液、0.05%(毫升/毫升)聚山梨酯80无菌氯化钠溶液和0.05%(毫升/毫升)0.9%氯化钠溶液等。按照相应的制备方法，用纯净水配制，加热溶解，过滤，分装，121℃灭菌15分钟，3周内使用4.4.2试验菌的制备和稀释:

4.4.2.1细菌、霉菌和酵母菌计数法验证菌液:

4.4.2.1.1取少量新鲜培养的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌，接种于10毫升营养肉汤中，在30-35℃培养18-24小时；将新鲜白色念珠菌培养物接种到改良的马丁培养基中，在23-28℃培养24-48小时；将黑曲霉的新鲜培养物接种到改良的马丁琼脂斜面培养基上，在23-28℃培养5-7天

4.4.2.1.2将上述大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和白色念珠菌的均匀培养物(细菌悬液)用0.9%无菌氯化钠溶液稀释两次，以制备每毫升细菌含50-100伏的测试细菌溶液。将3-5毫升含0.05%(毫升/毫升)聚山梨醇酯80的0.9%无菌氯化钠溶液加入到改良的黑曲霉马丁琼脂斜面培养基中，洗脱孢子(细菌悬液)，用含0.05%(毫升/毫升)聚山梨醇酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制备每1毫升细菌含50-100℃

fu的试验孢子溶液

4.4.2.1.3在测试上述细菌液体时，应将1毫升液体注入培养皿中，培养并计数。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌在30-35℃的营养琼脂培养基中倒置培养48小时，白色念珠菌和黑曲霉在23-28℃的玫瑰钠琼脂培养基中倒置培养72小时

4.4.2.2对照菌检验方法验证用菌液:

4.4.2.2.1将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、甲型副伤寒杆菌和铜绿假单胞菌的新鲜培养物轻微接种于10毫升的营养肉汤中，将生孢梭菌的新鲜培养物轻微接种于12毫升的巯基乙酸液体培养基中，在30-35℃下培养18-24小时

4.4.2.2.2取上述均匀培养物(细菌悬液)，用0.9%无菌氯化钠溶液加倍稀释，制成每毫升细菌含10 ~ 100伏的供试品溶液。

4.4.2.2.3在检测上述菌液时，取1毫升注射皿和营养琼脂培养基，在30 ~ 35℃下倒置培养48小时并计数。

4.4.3供试品溶液的制备:

4.4.3.1根据供试品的理化特性和生物学特性，采用合适的方法制备供试品溶液

4年4月3.2日，取养胃舒软胶囊5克，加入装有溶解的(温度不超过45℃)5克司盘80、3克单硬脂酸甘油酯和10克聚山梨醇酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻璃搅拌成球，缓慢加入45℃的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100毫升，边搅拌边加入，使试样充分乳化，作为1∶20的试验溶液

4.4.3.3当制备试验溶液需要水浴加热时，温度不得超过45℃，时间不得超过30分钟。

5.5.4细菌、霉菌和酵母菌计数验证方法:

4.4.4.1验证试验分为4组。根据“微生物限度检查法”，对不同批次的3个样品分别进行3次独立的平行试验，分别计算出试验样品组和对照试验组的细菌回收率为256±199

4.4.4.2试验组:

4.4.4.2.1平板法:将1毫升试验液和1毫升试验菌液(含菌量50 ~ 100cfu)按1: 20的比例分开，注入同一个直径90毫米的灭菌平板中，每个试验菌平行制备2个平板

4.4.4.2.2膜过滤方法:取1-10ml 1:20的供试品溶液，加入100ml稀释液中，混匀，按照膜过滤方法过滤(在过滤水溶性供试品溶液前，先过滤少量冲洗液使滤膜湿润，在使用试油溶液前，先将滤膜和过滤器充分干燥)用合适的冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜冲洗量约100毫升，总冲洗量不超过1000毫升。在最后一次冲洗液中加入1毫升试验菌溶液(含50-100cfu细菌),过滤，取出滤膜。将细菌表面粘贴在相应的预培养合格培养基平板、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌营养琼脂培养基平板、白色念珠菌和黑曲霉玫瑰酸钠琼脂培养基平板上。为每个测试菌株平行制备两块板。

4.4.4.3菌液组:每组取1毫升试验菌液，注入直径为90毫米的灭菌平板，每种试验菌平行制备2块平板

5.5.4.4试验样品对照组:

4.4.4.1平板法:取1毫升1: 20的试验溶液，注入直径为90毫米的无菌平板中，每种培养基平行制备2块平板