赤芍总苷的提取纯化与质量检查设计方案

赤芍总苷的提取纯化与质量检查设计方案

1文献背景

赤芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall. 或川赤芍Paeonia veitchii Lynch 的干燥根，具有清热凉血、散瘀止痛的功效，其主要有效成分为芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药花苷等单萜苷类化合物，总称赤芍总苷，可改善机体微循环，抑制血小板凝聚，抗血栓形成，具有广泛的药理活性[1-3]，是一种可用于保健食品的中药。

1.1赤芍总苷背景意义

在药理学上，赤芍总苷对血液具有抗凝血、抗血栓以及抗内毒素和改善微循环的作用。并且赤芍总苷对缺血性损伤如心肌缺血同样具有保护作用[4]，正是这样的良好使用疗效，我们需要对赤芍总苷进行更多的研究，来保证临床的使用疗效。

1.2提取研究现状

目前报道的赤芍总苷提取工艺文献中，多采用正交试验设计法[5]。即分别称取赤芍药材若干（通常800g），以不同的提取液（水、乙醇）分别按正交试验设计表试验，滤过，合并滤液，量取体积，即得正交试验各试验的提取液。

1.3纯化研究现状

目前报道的赤芍总苷纯化工艺文献中，多采用正丁醇萃取法和大孔树脂吸附法[6]。即将提取过程中，包括糖类、脂类等许多杂质在内的浸膏提取液，补充蒸馏水至药材的2倍量，作为待纯化样品溶液。

纯化方法1（正丁醇萃取法）：取上述待纯化样品溶液200ml，取等量石油醚萃取3次，除去石油醚层，然后用水饱和后的正丁醇萃取3次，收集正丁醇层，再用200ml蒸馏水洗1次，弃去水层，减压回收正丁醇，所得浸膏于真空干燥器中干燥。

纯化方法2（大孔树脂吸附法）：D101大孔吸附树脂100g，经95%乙醇浸泡12h，充分溶胀后装柱，蒸馏水洗至无醇味，备用。上述待纯化样品溶液取

200ml，上树脂柱，3倍量蒸馏水洗，再用3倍量的乙醇洗脱，收集20%洗脱组分，减压回收乙醇，剩余浸膏于真空干燥器中干燥。

1.4质量控制

赤芍中赤芍总苷质量控制包括性状鉴别（颜色、气味）、薄层鉴别（蓝紫色斑点）、以及对其进行高效液相色谱的含量测定（检测波长为230nm，理论板数按芍药苷峰计算应不低于3000）以及水分、炽灼残渣，重金属等检测。

2 赤芍饮片的质量检查

2.1性状: 本品应呈圆柱形，稍弯。表面棕褐色，粗糙，有纵沟和皱纹，并有须根痕和横长的皮乳样突起，有的外皮易脱落。质硬而脆，易折断，断面粉白色或粉红色，有的有裂隙。气微香，味微苦、酸涩。

2.2鉴别: 取本品粉末0.5g，加乙醇10ml，振摇5分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加乙醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（附录ⅥB）试验，吸取上述两种溶液各4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40：5：10：0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点。

2.3含量测定：照高效液相色谱法（通则0512）测定。

2.3.1 色谱条件与系统适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（40：65）为流动相；检测波长为230nm。理论板数按芍药苷峰计算应不低于3000。

2.3.2 对照品溶液的制备

取经五氧化二磷减压干燥器中干燥36小时的芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，即得。

2.3.3 供试品溶液的制备

取本品粗粉约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称

定重量，浸泡4小时，超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.4 测定法

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品含芍药苷（C23H28O11）不得少于1.8%。

参考文献：2015版《中国药典》

3 赤芍总苷的提取工艺

3.1 指标成分的选择及含量测定

赤芍中所含丰富的苷类成分总称赤芍总苷，为赤芍的主要活性部位，其中以芍药苷的含量最高，选择芍药苷作为含量测定的指标成分。

3.1.1 HPLC色谱条件的优化选择

色谱柱的选择：考察Hypersil ODS(150mm*4.6mm,5μm)和Hypersil

BDS(200mm*4.6mm,5μm)

流动相选择：流动相考察甲醇-水系统、甲醇-0.05%磷酸溶液系统、乙腈-水及乙腈-0.05%磷酸溶液系统。

流速选择：流速考察0.6ml/min、0.8ml/min、1.0ml/min

3.1.2 对照品溶液的制备

精密称取芍药苷对照品10.63mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品贮备液(每lml含芍药苷对照品425.2μg）。

3.1.3 标准曲线的制备

分别精密量取对照品贮备液溶液(425.2μg/ml)0.5ml、l.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml置10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。精密量取上述不同浓度对照品溶液各10μl注入液相色谱仪，按前述色谱条件分别测定其峰面积。以对照品浓度X为横坐标，峰面积积分值Y为纵坐标，绘制标准曲线。

3.1.4 供试品溶液的制备及测定

取提取液，稀释至一定体积，滤过，即得供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，由外标一点法计算即得芍药苷含量。

3.2 提取溶媒的筛选：

赤芍中所含苷类成分极性较大，在水、乙醇等亲水性溶剂中溶解度较好。本实验以芍药苷的含量为评价指标，考察水和不同浓度的乙醇对芍药苷的提取效率，筛选赤芍药材的最佳提取溶媒。见表1：

表1 不同提取溶媒芍药苷含量

提取溶媒水50%乙醇70%乙醇溶媒用量(倍)666

提取次数(次)222

提取时间(h) 1.5 1.5 1.5

芍药苷含量(%)

3.3 正交试验设计优化提取工艺

3.3.1 因素水平设置

溶剂法提取中影响提取效率的因素主要有溶媒用量、提取时间及提取次数等。根据实际情况，设置醇用量、提取时间及提取次数为3个考察因素，因素水平设置见表2。

表2 因素-水平表

因素-A提取溶媒B提取时间C提取次数