流式细胞术样品制备技术(完整)

流式细胞术样品制备技术

流式细胞术对细胞的分析检测必须基于单细胞的基础上，这是流式细胞术的基本要求。因此就必须把实体组织制备成单细胞悬液。在应用FCM技术中，制备出合格的单分散细胞是流式细胞术样本制备技术中重要的一环。它要求这种分散细胞方法既要使细胞成为单个细胞，又能保持细胞的固有生物化学成分及生物学特性。

流式细胞术样品制备大致可分为下面五个步骤：①取材：取手术或活检组织必须具有代表性，如取手术肿瘤组织，必须取瘤细胞生长旺盛部位；组织等标本必须在取材后保持样本的新鲜；一般在室温1个小时之处理好样本或及时用固定剂或低温对组织进行保存；②对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色；③按照厂家提供的软件程序对样本进行获取、检测和存储；④再依照软件提供的程序对检测结果进行定量分析；⑤检测分析结果在生物、医学上的意义进行分析和评价。

第1节样本单细胞悬液的制备方法

一新鲜实体组织样本的制备

FCM对单细胞快速进行各种参数分析必须基于单细胞基础上，根据各种组织成分的特点，可选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞产额高、损伤少的目的。尽管标本制备已形成了标准化的程序，但实际操作中总会出现这样或那样的问题。在实体组织分散为单个细胞过程中，解离的方法可能瞬间地或持久地影响细胞的性质、形态、结构、功能等。所以，在对各种不同组织进行分散选择方法时，应尽量减少对细胞的这种影响。目前常用的分散组织细胞的方法有如下3种。

（一）酶消化法

1 作用原理：

对实体组织分散的作用原理主要有3方面：①可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等；②可以水解组织间的粘多糖等物质；③可以水解组织细胞间的紧密联结装置的蛋白质物质。酶消化法是实体瘤、培养细胞分散为单细胞的主要方法之一。常用的酶类试剂有：蛋白酶类——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解离组织中的细胞。胰蛋白酶能水解脂键和肽键；胶原酶能降解几种分子类型的胶原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷键；弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。不同酶对细胞和细胞间不同组分有特异作用，可根据分散组织类型来确定使用的酶类。

2 注意事项：

①酶需要溶解于适当的溶液中，而这些溶液不致于造成酶效价降低；②要注意酶的使用浓度和消化时间；③要注意酶活性的PH值。如胃蛋白酶在碱性环境中失去活性，胰蛋白酶在中性溶剂中活性不佳等；④要随时注意影响酶活性的其它因素，如酶的生产批号等。

3 方法学程序

（1）将适合于酶消化的组织置于离心管中；

（2）将选好的酶溶液1-2ml加入盛有被消化组织的试管中；

（3）一般消化20-30分钟（恒温37℃或室温），消化期间要间断振荡或吹打；

（4）终止消化，收集细胞悬液，以300目尼龙网过滤，除去细胞团块，以低速成离心除去细胞碎片；

（5）将制备好的单细胞悬液进行进一步荧光染色后上机检测，或保存备用。

（二）机械法

机械法分散实体组织包括：用手术剪刀剪碎或者用锋利的解剖刀剁碎组织，用匀浆器匀浆，再用细注射针头抽吸细胞或用300目尼龙网滤出单细胞悬液；采用搓网法也能获得大量细胞。机械法易造成细胞碎片和细胞团块，所以机械法常与其它方法配合使用。

1 剪碎法：

①将组织块放入平皿中，加入少量生理盐水；

②用剪刀将组织剪至匀浆状；

③加入10ml生理盐水；

④用吸管吸取组织匀浆，先以100目尼龙网过滤到试管中；

⑤离心沉淀1000prm,3-5min，再用生理盐水洗3遍，每次以低速（500-800prm）短时离

心沉淀去除细胞碎片；

⑥以300目尼龙网滤去细胞团块；

⑦细胞用固定液固定或低温保存备用。

2 网搓法

①将100目，300目尼龙网扎在小烧杯上；

②把剪碎的的组织放在网上，以眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边加生理盐水冲洗，直到将

组织搓完；

③收集细胞悬液，离心沉淀500-800prm，2分钟；

④固定细胞或低温保存备用。

3 研磨法

准备一只70ml研磨器。

①先将组织剪成1-2mm3大小组织块；

②放入组织研磨器中加入1-2ml生理盐水；

③转动研棒，研至匀浆；

④加入10ml生理盐水，冲洗研磨器；

⑤收集细胞悬液，并经300目尼龙网过滤，离心沉淀500-800 prm，1-2 min，再以生理

盐水洗3 遍，离心沉淀；

⑥固定或低温保存细胞悬液，备用。

（三）化学处理法

1 作用原理

化学处理法是将组织细胞间起粘着作用的钙镁离子置换出来，从而使细胞分散开来。

2 试剂的配制

① 0.2%EDTA配制：称EDTA 0.2g，加入Hankˊs液100ml，封装高压消毒。置0℃-4℃保

存；

②胰酶加EDTA配制：胰酶0.25g 加PBS（pH7.0）200ml，浓度0.125%，EDTA 0.2g加PBS

（pH7.0）100ml，浓度0.2%。各取40ml混合，分装置冰箱保存，用时过滤即可使用。

3 实验方法

①将组织切成薄片，置入试管中；

②首先加入EDTA液5ml，室温下0.5h，离心弃之；

③再加入胰酶-EDTA液5ml。在37℃恒温水浴振荡器30min；

④用300目尼龙网过滤，离心沉淀1000prm，5min。再以生理盐水洗2-3次；

⑤细胞固定或低温保存备用。

以上几种分散细胞的方法都是目前对实体组织解聚的常用的方法。实验证明，用化学试剂方法处理组织导致细胞成活率低，细胞产额低，细胞碎片和细胞聚集的量不稳定；化学试剂可单独使用，也可与其它方法结合使用；机械法常常造成严重的细胞损伤，单细胞产量低；酶学法、化学法对实体组织的分散解聚较理想，但对所测化学成分有不良影响。所以要根据实验目的去选择合适的单细胞悬液制备方法，才能获得理想的样本和更好的FCM检测结果。

（四）注意事项

①新鲜组织标本应及时进行处理保存，以免组织在室温下放置时间过长，产生中心组织坏

死以及细胞自溶，影响FCM测定结果；

②根据实验目的选择最隹的固定方法，以免由于固定剂的原因，造成FCM检测结果的不稳

定；

③酶学法要注意条件的选择和影响因素，要注意酶的溶剂，消化时间、pH值、浓度等方

面对酶消化法的影响。

④需注意不同组织，选择相应的方法；如富于细胞的组织——淋巴肉瘤、视神经母细胞瘤、

脑瘤、未分化瘤、髓样癌以及一些软组织肉瘤等，就不一定采用酶学法或化学法；往往用单纯的机械法就可以获得大量高质量的单分散细胞；

⑤在使用酶学方法时，要重视酶的选用，如含有大量结缔组织的肿瘤——食管癌、乳腺癌、

皮肤癌等，选用胶原酶较好，因为胶原酶具有在Ca++、Mg++存在或在血清状态下不发生活性降低的特性。

二组织活检、窥镜取材标本单细胞悬殊液的制备

正常组织、瘤组织和淋巴结等活检组织以及窥镜（胃镜、食管镜等）取材标本，由于材料较少，制备起来比较麻烦。但其制备方法与实体组织基本相似。

1 取材后立即放入盛少许PBS液青霉素小瓶中；

2 另取一只小烧杯，杯口用300目尼龙网盖住并用线绳固定好，并用PBS液湿润；取新鲜

组织标本置尼龙网上；因标本量较少，尤其是窥镜取材只少要取3块以上；

3 在操作前，先将剪刀用PBS液浸润一下，然后开始剪碎组织；

4 先剪几下，视基本无组织块存在时，用原来装标本的青霉素小瓶中的PBS液，冲洗细胞

均浆并过滤于小烧杯中；如果这时仍有可见组织块，再用剪刀剪碎，再加适量该PBS 液冲洗，直至网上无组织块为止。这样可尽量多的收集细胞；

5 细胞加固定液或低温保存，备用。

三石蜡包埋组织样本的制备

石蜡包埋组织单细胞分散方法的建立，扩大了流式细胞术的应用围。对大量临床随访资料通过病理包埋组织的流式细胞术分析，可以重新得到深入研究和利用。现将常用的石蜡包埋组织制备单细胞方法介绍如下。

1 实验方法：