流式细胞术样本制备ppt课件
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流式细胞术课件
酸化的检测同样可以用对pH敏感的荧光探针，如 DCH, BCECF, BCECF-AM, SNAFLs, SNARFs等进行检测
Flow cytometry of apoptotic cell death
Phospholipid redistribution
第七节 细胞周期的检测
Flow cytometry of cell cycle
原理：细胞在有丝分裂的过程中 DNA 会加倍。 （n----2n）
以二倍体细胞为例，流式检测细胞周期的过程。 首先，我们知道细胞分为处于静止期的细胞 （G0）和处于分裂状态的细胞，分裂期状态的 细胞又有 G1 期，S 期,G2 期和 M 期。
Flow cytometry of cell cycle
基本工作原理
已标记的单细 硅化管 胞悬液和鞘液
基本过程
流动室 形成稳态 喷嘴 水平激光与之 荧光染料被
单细胞液柱
垂直相交 激发发光
荧光检测系统和
收集光信号 光电倍增管
放大 脉冲信号
散射光感受系统
计算机系统 分析结果
现代流式细胞仪包括
液流系统 聚焦细胞以供检测
光学系统 激发和收集光信号
电子系统 将光信号转化为电信号，并使其数字化以供计算机分 析
液流系统示意图
鞘液
Fluorescence signals
Focused laser beam
喷嘴
FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
2. 光学系统
激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
Flow cytometry of apoptotic cell death
Phospholipid redistribution
第七节 细胞周期的检测
Flow cytometry of cell cycle
原理：细胞在有丝分裂的过程中 DNA 会加倍。 （n----2n）
以二倍体细胞为例，流式检测细胞周期的过程。 首先，我们知道细胞分为处于静止期的细胞 （G0）和处于分裂状态的细胞，分裂期状态的 细胞又有 G1 期，S 期,G2 期和 M 期。
Flow cytometry of cell cycle
基本工作原理
已标记的单细 硅化管 胞悬液和鞘液
基本过程
流动室 形成稳态 喷嘴 水平激光与之 荧光染料被
单细胞液柱
垂直相交 激发发光
荧光检测系统和
收集光信号 光电倍增管
放大 脉冲信号
散射光感受系统
计算机系统 分析结果
现代流式细胞仪包括
液流系统 聚焦细胞以供检测
光学系统 激发和收集光信号
电子系统 将光信号转化为电信号，并使其数字化以供计算机分 析
液流系统示意图
鞘液
Fluorescence signals
Focused laser beam
喷嘴
FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
2. 光学系统
激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
流式细胞术培训优秀课件
二.细胞分选原理
●高通量 ●高纯度：可达99.9% ●可分选极少含量的细胞 ●多种分选方式
FACSVantage Diva 的模拟四路分选。
四.实例与数据分析
（1）红细胞裂解后的外周血细胞检测
• 成分：样本中的细胞有单核细胞，淋巴细胞，粒细胞 • 染色：单克隆抗体标记
1）CD14存在于单核细胞表面。 荧光染料： Phycoerythrin（PE）
（5）各色荧光信号分离
激光束
侧向散射光， 荧光
细胞
二色反光镜
1
2
3
前向 散射 光
收集透镜
带通滤光片 光电倍增管
多通道（多参数）
另一个参数：时间—连续 过程的检测
多激光激发：多通道（多参数）—6杆激光，17个荧光通道
（6）更先进的光信号收集和分离方式
八角反射式 信号收集系统
提高的灵敏度— (二色反光镜)反射~透 射:95%~80%
（2）测量对象：颗粒尺度
（单细胞悬浮液）
当前流式细胞仪可测量颗粒大小 最小约0.2μm
电镜
光学 显微镜
人眼极限
0.1nm 1nm 10nm
100nm
1μm
10μm
100μm
1mm
原子氨基蛋白 病毒 支原体 细菌 酸质
红细胞 上皮细胞 植物细胞
（3）可测量的细胞参数
核酸分析： DNA、 RNA含量，DNA合 成、降解、断裂， 区分核酸单、双 链，测量端粒长 度、染色质结 构 、碱基构成。 染色单体分选。
（2）DNA含量检测
高精确性—以及极小的 仪器误差（CV）！
BD FASCalibur
• 质量控制：
变异系数（CV）：流式细胞仪的“分辨率”。
流式细胞术.ppt
信号检测与分析
当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射 时，产生代表细胞内不同物质、不同波长 的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向 空间360度立体角发射，产生散射光和荧光 信号。 以激发图
散射光信号
散射光信号不依赖任何样品的制备技术 （如染色），因此称为细胞的物理参数。
①T淋巴细胞及亚群： 外周血中成熟淋巴细胞主要属于
TCRαβ＋T细胞，可分为Th、Ts、Treg， TCRγδT细胞和NK1.1＋T细胞等，他们 都有一个共同的标志CD3。
a、辅助/诱导性T淋巴细胞（Th）占27-51%， 是主要的功能亚群，主要表达CD3＋CD4＋CD8 －。
b、抑制/细胞毒性T淋巴细胞（Ts）占15-44%， 是 主 要 的 效 应 性 T 细 胞 亚 群 ， 主 要 表 达 CD3＋ CD4 －CD8＋。
因此通过流式细胞仪计数和多参数分析淋巴细胞亚群对了解 淋巴细胞发育、分化、活化和功能成熟，鉴别新的淋巴细胞 亚群具有重要价值；更重要的是通过研究和分析疾病与特异 性淋巴细胞亚群或某些疾病，如免疫性疾病、感染性疾病、 肿瘤等的诊断、治疗、免疫功能重建和器官移植检测有着重 要临床意义。
（1）淋巴细胞及其亚群分析
（三）质料采集和分析过程中 的质量控制
1、标本采集处理
a、组织标本采集： b、标本固定：70%的乙醇固定效果好。 C、单细胞悬液的制备：细胞浓度调整为1×106/ml。 d、石蜡包埋组织的单细胞制备：一般不用。
2、资料采集：一般每个标本应获取1×104。 2×104个有核细胞的荧光和散光系数，白血病 微小残余病变检测应收集5×104个细胞。 3、资料分析；略
缺点；细胞散射光特征丢失较肝素标本快。
（一） FCM单细胞标本的制备
《流式细胞术的原理》PPT课件
光学系统
电子系统
流式细胞仪的工作原理
散射光信号
前向角散射光〔FSC，Forward Scatter〕： 细胞相对大小及其外表积 侧向角散射光〔SSC，Side Scatter〕： 细胞颗粒度及细胞核相对复杂性
散射光信号
荧光信号
特异荧光信号
背景信号
荧光素
•什么是荧光及荧光素？ •某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比照射 光波长长的光线-即荧光。而这些受激发后能产生荧光的物质称 为荧光素。 •什么是荧光发生机理？ •室温下的荧光素分子大局部处于稳定的“基态〞。当荧光素在 激发光的照射下吸收足够的光能后，跃迁到新的状态，即“激发 态〞。处于激发态的荧光分子极不稳定，它可以通过极短时间
•液流驱动系统
Fluorescence signals
Focused laser beam
鞘液三大作用： 防止堵塞喷孔 约束样本位于喷嘴中心、提高测量精度 保持细胞活性
液流系统
对灵敏度要求不是很苛刻的实验，可调高样本进样速率，从而 提高采样分析速度。
光学系统
主要由激发光源、光束成形及收集系统组成
荧光染料的选择
1，首先，了解目标抗原 1〕细胞外表抗原 2〕细胞内或是核内抗原〔固定、透膜步骤〕 3〕以上两者兼备。先标记外表抗原，固定后，破膜标记 胞内抗原。 4〕细胞内细胞因子的测定。使用细胞内蛋白分泌抑制剂， 如monensin、BFA，使得细胞因子不能分泌到细胞外。 〔活化、固定、透膜〕
《流式细胞术的原理》 PPT课件
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流式细胞术课件
b.荧光抗体标记：使用同厂家、同批次抗体，足量、足程标记， 抗体过少或过量均会出现问题.
11
FCM使用注意事项
c.减少非特异染色：充分洗掉未结合抗体，使用间 标抗体注意非特异背景干扰（如Fc受体）.
d.每批、每步实验条件要一致：如PBS、PH值、温度 等 .
e.未固定样本在2h内，固定样本24小时内测定完毕： 避免荧光强度衰减
完成仪器设置、数据获取、统（实习1）
1.开机
2.运行FACSComp：监测仪器工作状态并记录数据
3.建立获取模板
4.调出FACSComp生成的仪器条件 5.条件优化：用阴性和单阳性样本确定电压、补偿和域值，确 定获取的目的细胞数＞10000 6.确定存储数据的地址
7.记录数据
8.分析数据：建立分析模板-调出已存储的原始数据-调整 Gate(门)或 Region(区域)-设置Marker(标尺)-显示象限统计框 （Quadrant Stats） -打印分析数据
对计数 绝对值
2）ProCOUNT：造血干/祖细胞自动化分析，报告CD34+细胞 3）HLA-B27分析软件：血液T淋巴细胞HLA-B27定量分析 4）ReticCOUNT：网织红细胞自动化分析
6
BD仪器软件
5）ModFit软件：DNA周期、倍体和凋亡的自动或手动分析 6）QuantiCALC：荧光定量分析，报告每个细胞抗体结合量 （ABC），要检测白细胞表面分化抗原和细胞活化指标 7）PAINT-A-GATE：多维参数资料分析，同时分辨显示多个 细胞群体 8）ATTRACTOR软件：多参数资料的自动快速批量分析
22
23
•DNA分析时，FSC、SSC和FL2都应使用线性模式采集信号。
•调节FL2的电压，使FL2-A的G1期细胞的峰位于200道数 的位置上。
流式细胞术实验技巧及数据分析ppt课件
FITC+T red
488
568
FITC+PeCy5 488
FITC+ ECD
488
F+P +PeCy5
488
F+ ECD +PeCy5 488
F+P +PeCy5 +APC 488
633
525 、575
绿色、橙色
525
绿色
615
红色
525、 675
绿色、 红色
525、 625
绿色、橙红色
525、575、675
17
流式细胞术操作流程：
培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋
单细胞悬液 制备
荧光抗体标记
上机检测
表型测定 细胞分选
统 计 学 分 析
FISH PCR
继 续 培 养
18
单 分 散 细 胞
19
FSC
FSC信号的强弱与细胞的大小和活力相关
20
SSC
SSC信号的强弱与细胞内颗粒多少相关
21
细胞散色光信号
22
排除双联体细胞
27
细胞阻滞在G2M期
28
双 克 隆 细 胞 周 期 分 析
29
BrdUrd和DNA双标记染色
溴脱氧尿嘧啶核苷( Bromodeoxyuridine， BrdUrd )是胸苷的一种类似物。它可以替代
胸腺嘧啶掺入到细胞新合成的DNA分子中，成为S 期细胞的一种标记物。流式细胞术采用抗BrdUrd 单克隆抗体免疫荧光和PI双参数检测细胞，不仅 可检测一个细胞群体的动力学参数和DNA含量，同
层流是液体稳定流动的必要条件,管道中层流 的形成要满足雷诺数
流式细胞术原理及应用新课件PPT全
流式细胞术是20世纪70年代发展起来的一种技术，有人将流式细胞仪比喻成高级的荧光显微镜。 HLA-B27: 强直性脊柱炎 细胞功能检测：细胞周期、凋亡
Flow Sorting 直方图适用于：单参数分析
SORTING（细胞分选） CD16+56 NK细胞 可利用FCM进行细胞周期分析，适当选择周期特异性药物或非周期特异性药物。
巨血小板
• 细胞凋亡与坏死的区别 一般只测一个参数、不能分选
5、DNA含量分析法（晚晚期）
2F时LO必W需C停Y用TO免M疫E抑TR制Y剂。虽然凋亡与坏死的最终结果极为相似，但
凋亡检测
每一步都有检测它试剂盒们的过程与表现却有很大差别。
光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握,适合
坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理 流式细胞分析在人类基因组计划中发挥了重要作用，流式细胞技术的应用也适用于植物，目前这个技术应用范围包括流式核型分析，
目前，该技术以广泛用于生物及医 学基础研究与临床检测，在分子生物学、 免疫学、遗传学、血液学、肿瘤学等领 域内发挥着重要作用。
流式细胞仪
荧光显微镜
Flow Cytometry
控制 一般只测一个参数、不能分选
电脑
人脑
其细胞及组织的变化与坏死有明显的不同。
可利用FCM进行细胞周期分析，适当选择周期特异性药物或非周期特异性药物。
• 空白对照：ALL 应用领域将不断开拓，成为科研与临床不可或缺的重要工具。
随着白细胞分化抗原意义的确认以及单克隆抗体技术的发展，随着人们创新意识的加强，结合计算机技术和其他技术，流式细胞仪的 应用领域将不断开拓，成为科研与临床不可或缺的重要工具。 坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。
流式细胞术 ppt课件
制备(如染色)无关。
✓前向角散射(FS)反映被测细胞的大小，它由 正对着流动室的光电二极管装置，接收并 转变为电信号。
✓侧向角散射(SS)反映被测细胞的细胞膜、细 胞质、核膜的折射率和细胞内颗粒的性状， 它由一个光电倍增管(PMT) 接收并转变为 电信号，这些电信号存储在流式细胞仪的 计算机硬盘或软盘内。
➢荧光信号也有两种：
✓一种是细胞自发荧光，它一般很微弱。
✓一种是细胞样本经标有特异荧光素的单克 隆抗体染色后，经激光激发发出的荧光， 它是我们要测定的荧光，荧光信号较强。
✓这两种荧光信号的同时存在是我们测定时 需要设定阴性对照的理由，以便从测出的 荧光信号中减去细胞自发荧光和抗体非特 异结合产生的荧光。
(1)单参数数据显示和分析
➢ 细胞的每一个单参数测 量数据用直方图来显示
➢ 横坐标表示散射光或荧 光信号相对强度值，其 单位是道数，可以是线 性的，也可以是对数的
➢ 纵坐标表示细胞数。
(2)双参数数据显示和分析：
➢细胞的双参数测量数据和细胞数量的关系 用一维直方图、二维点阵图、假三维地形 图、等高线图和密度图显示和分析。
✓流动室孔径有60μm、100μm、150μm 、 250μm等多种，供检测者选择。小型仪器一 般固定装置了一定孔径的流动室。
➢流动室里的鞘液流一般是稳定流动，控制鞘 液流的装置是在流体力学理论的指导下由一 系列压力系统、压力感受器组成。
➢调整好鞘液压力和标本管压力, 鞘液流包绕 样品流并使样品流保持在液流的轴线方向， 能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相 等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。Fra bibliotek等高线图
分别是测定细胞的两种荧光双参数数据，横坐标 和纵坐标分别代表一种荧光参数，同理只要设定 “十字门”就可得到两种荧光的各种测定值，密 度图和等高线图较点阵图更直观。
✓前向角散射(FS)反映被测细胞的大小，它由 正对着流动室的光电二极管装置，接收并 转变为电信号。
✓侧向角散射(SS)反映被测细胞的细胞膜、细 胞质、核膜的折射率和细胞内颗粒的性状， 它由一个光电倍增管(PMT) 接收并转变为 电信号，这些电信号存储在流式细胞仪的 计算机硬盘或软盘内。
➢荧光信号也有两种：
✓一种是细胞自发荧光，它一般很微弱。
✓一种是细胞样本经标有特异荧光素的单克 隆抗体染色后，经激光激发发出的荧光， 它是我们要测定的荧光，荧光信号较强。
✓这两种荧光信号的同时存在是我们测定时 需要设定阴性对照的理由，以便从测出的 荧光信号中减去细胞自发荧光和抗体非特 异结合产生的荧光。
(1)单参数数据显示和分析
➢ 细胞的每一个单参数测 量数据用直方图来显示
➢ 横坐标表示散射光或荧 光信号相对强度值，其 单位是道数，可以是线 性的，也可以是对数的
➢ 纵坐标表示细胞数。
(2)双参数数据显示和分析：
➢细胞的双参数测量数据和细胞数量的关系 用一维直方图、二维点阵图、假三维地形 图、等高线图和密度图显示和分析。
✓流动室孔径有60μm、100μm、150μm 、 250μm等多种，供检测者选择。小型仪器一 般固定装置了一定孔径的流动室。
➢流动室里的鞘液流一般是稳定流动，控制鞘 液流的装置是在流体力学理论的指导下由一 系列压力系统、压力感受器组成。
➢调整好鞘液压力和标本管压力, 鞘液流包绕 样品流并使样品流保持在液流的轴线方向， 能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相 等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。Fra bibliotek等高线图
分别是测定细胞的两种荧光双参数数据，横坐标 和纵坐标分别代表一种荧光参数，同理只要设定 “十字门”就可得到两种荧光的各种测定值，密 度图和等高线图较点阵图更直观。
实用流式细胞技术及其样品处理ppt课件
G0/G1
G2/M
Aneuploid peak
S
# of Events
PI
0
200
400
600
800
1000
PI
必须用RNase去除RNA
精选课件
31
DNA合成---BrdU Incorporation
BrdU+ 或 S期细胞
凋亡细胞
G0/G1期精细选胞课件
G2/M期细胞
32
增殖细胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen，PCNA）: 参与DNA复制和核酸的 切补修复（excision repair ）的一种蛋白
Skatron, Partec, Dako (Galaxy), Cytomation (MoFlo).
July 2002 : DakoC精yt选om课a件tion: Cyan benchtop.
24
精选课件
25
Long pass
460 500 540
滤光片
Short pass
460 500 540
Data are stored in so-called flow cytometry standard (FCS) format.
Data stored on one cytometer may not be analyzable
on software from another cytometer.
FACS I,II,III,IV,400,420,440,FACStar,Vantage, DiVa, Aria : Sorters. FACS Analyser, can, Calibur* , LSR, Canto: ‘Benchtop’.
《流式细胞技术》PPT课件
完整版ppt
34
CBA(Cytometric Bead Array)
完整版ppt
35
Traditional Analysis -- Percent positive
Po s i t i v e Ce l l
Ne g a ti v e Ce l l
CDX PE
TraditionalAnalysis— PercentPositives
43
3）DNA倍体：主要比较G0/G1期细胞DNA含量 的变化。用DNA指数（DI）表示。
DNA指数=测量样本G0/G1期DNA含量/正常人 淋巴细胞G0/G1期DNA含量
以正常人淋巴细胞作为对照。
正常细胞DNA指数为1.00，DNA指数＞1，为超 2倍体，＜1为亚2倍体，两者可统称为非整倍 体。非整倍体细胞中肿瘤的特异性标志，实体 肿瘤中出现频率较高。
完整版ppt
42
2）利用DNA的荧光染料，如PI （Propidium iodide碘化丙啶），与细胞 内的DNA结合，可反映细胞内DNA含量。 采用DNA直方图显示。具有2C DNA含量 细胞为G0/G1期细胞，4C DNA含量细胞 为G2/M期细胞，DNA含量介于两者之间 的细胞为S期细胞。
完整版ppt
完整版ppt
作者：笛风
1
基本概念
1、流式细胞仪(Flow Cytometer):是集光电子物 理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗 技术为一体的高科技细胞分析仪。
2、流式细胞术(Flow Cytometry):利用流式细胞 仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参 数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分 析和分选（纯度可达99%以上）的技术。
140
流式细胞术PPT课件
电荷式分选
lasers
–超声振动器(15-100kHz)
–液流充电系统
–高压偏转板
–收集装置(流式管、培养板)
断裂点(充电) 高压偏转板
29
四路分选原理
电荷式分选装置
30
分选指标
• 分选时间由三方面决定：进样速度、目标细胞所占比例、 需要收集的细胞数。
需要细胞数
目标细胞所占比例(%)
1
5
50
104
• Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的 方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞 DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
• PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。
• AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光， RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
• 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素； 各个通道之间的荧光素可以随意搭配。
FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。
33
B 根据抗原表达强弱合理选择 抗体
• 不同的荧光素强度有所不同；
CD5
• 高表达的抗原可用不太“亮” 的染料，更“亮”的荧光素分 配给表达低的抗原：
99%以上。 • 分选收获率是指被分选出的细胞与原来总细胞的百分比。 • 分选纯度和收获率永远是相互矛盾的，纯度提高，收获率
降低，反之亦然。
– 富集模式(enrich mode) – 纯化模式(purify mode) – 单细胞模式(single cell mode)
流式细胞术精品PPT课件
4
四、 流式细胞术的应用
1 细胞DNA含量检测：
细胞固定后用PI染色，因为PI特 异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI 的结合量呈良好的线性关系，根据这 个原理，并通过专用的DNA分析软件， 可测出细胞的DNA含量。用于细胞周 期、细胞倍体以及凋亡的检测。
5
• 肿瘤诊断：
•
DNA异倍体的出现是癌变的一个重
• 一、 流式细胞术的概念 流式细胞术（FCM）就是对在的鞘
液包括下的细胞、粒子进行分析和分选 的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧 光标记的。其特点是测量速度快，每秒 钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进 行多参数测量，另一特点是在分析的同 时可把具有指定特征的细胞分离出来， 这就是分选技术。
1
二、流式细胞仪的工作原理
产生及发展，现在CD系统已有247种之多。
细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用
流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析
出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性
细胞的CD分子的相对含量。标记的方法一
般用直标法，也可用间标法。荧光探针多
为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、
APC等。
9
淋巴细胞分类：
•
红细胞表面CD59缺失
18
5 细胞内蛋白的分析：
•
细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧
光标记，用流式细胞仪进行测量分析，同表型
分析一样，可以测量出这种阳性细胞的数量和
这种蛋白的相对含量。并且，结合细胞表型分
析，进行多标记和多参数分析，可以检测出含
这种蛋白的细胞是属于哪一种表型的细胞。多
用间标法，荧光探针多为FITC。也可以与周期
27
•
流式细胞仪对一个样品提供的结果是否可
四、 流式细胞术的应用
1 细胞DNA含量检测：
细胞固定后用PI染色，因为PI特 异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI 的结合量呈良好的线性关系，根据这 个原理，并通过专用的DNA分析软件， 可测出细胞的DNA含量。用于细胞周 期、细胞倍体以及凋亡的检测。
5
• 肿瘤诊断：
•
DNA异倍体的出现是癌变的一个重
• 一、 流式细胞术的概念 流式细胞术（FCM）就是对在的鞘
液包括下的细胞、粒子进行分析和分选 的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧 光标记的。其特点是测量速度快，每秒 钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进 行多参数测量，另一特点是在分析的同 时可把具有指定特征的细胞分离出来， 这就是分选技术。
1
二、流式细胞仪的工作原理
产生及发展，现在CD系统已有247种之多。
细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用
流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析
出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性
细胞的CD分子的相对含量。标记的方法一
般用直标法，也可用间标法。荧光探针多
为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、
APC等。
9
淋巴细胞分类：
•
红细胞表面CD59缺失
18
5 细胞内蛋白的分析：
•
细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧
光标记，用流式细胞仪进行测量分析，同表型
分析一样，可以测量出这种阳性细胞的数量和
这种蛋白的相对含量。并且，结合细胞表型分
析，进行多标记和多参数分析，可以检测出含
这种蛋白的细胞是属于哪一种表型的细胞。多
用间标法，荧光探针多为FITC。也可以与周期
27
•
流式细胞仪对一个样品提供的结果是否可
流式细胞术原理及应用ppt课件
•横坐标：道数 •纵坐标：细胞数
•横坐标：某细胞参数 相对含量
•纵坐标：该细胞另一
参数含量
等高线图（Contour Plot）
整理版课件
15
细胞分选系统
• 电荷式分选 ✓超声振动器(15-100kHz) ✓液流充电系统 ✓高压偏转板 ✓收集装置(流式管、离心 管、培养板、载波片等)
MACS ®技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学
流式细胞术原理及应用
整理版课件
1
一、什么是流式细胞术？ 流式细胞仪的构造
二、怎样设计流式实验？ 三、流式实验中涉及到的关键步骤 四、常见流式细胞术应用
整理版课件
2
一、流式细胞术基本概念
• 流式细胞术（Flow Cytometry）是对于处在快速直 线流动中的细胞和生物颗粒进行多参数、快速的定量 分析和分选技术.
整理版课件
42
科研应用
在免疫学研究中的应用: • 鉴定免疫细胞类型 • 抗原特异性T细胞研究 • 细胞因子分泌细胞研究 • 全血细胞研究 • 凋亡检测 • 细胞增殖检测 • 干细胞向免疫细胞分化的研究 • 转染荧光蛋白细胞系研究 • 稀有细胞检测 • 。。。
在神经生物学研究中的应用： • 神经干细胞和神经祖细胞的特性
整理版课件
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• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
整理版课件
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
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• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信 号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的 死细胞。
流式细胞术ppt课件
可区分高FL细胞与低FL细胞。 一般的流式细胞仪装有一个激光光源（488nm），可
测出三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪 装有三个激光光源（488nm、633nm和407nm），可测 出13个FL。
2、荧光信号
双色直接染色
二、荧光染料的选择
选择荧光染料要考虑: 1、流式细胞仪配置的激光可否激发该荧光染料； 2、流式细胞仪可否检测该荧光染料的发射波长； 3、使用多种荧光染料时，要考虑荧光染料之间的干扰。
二、荧光染料的选择
颜色补偿
➢荧光染料的发射波长范围一般宽于检测器检测到的波 长范围；检测范围之外的波长可能会进入相邻的检测器 被检测，从而造成荧光信号之间的干扰。流式细胞仪可 以通过“颜色补偿”校正这一干扰。 ➢ 单标管用于调补偿。
Fluorescein (FITC)
300 nm
400 nm
Excitation
500 nm
Wavelength
Emisson
600 nm
700 nm
400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
Phycoerytherin (PE)
300 nm 400 nm
Excitation Emisson
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
FITC和PE荧光光谱
直接染色
间接染色
样品制备过程中常见的问题及解决对策
常见问题 细胞密度低 非特异荧光
强
碎片多 细胞聚集
荧光弱
原因 细胞损失 抗体不纯、死细胞多
细胞死亡、机械损伤 消化不完全
抗体少、反应时间短
解决对策 增加离心时间、弃上清 选择纯度高的抗体、用同型 对照抗体或双标记排除非特
测出三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪 装有三个激光光源（488nm、633nm和407nm），可测 出13个FL。
2、荧光信号
双色直接染色
二、荧光染料的选择
选择荧光染料要考虑: 1、流式细胞仪配置的激光可否激发该荧光染料； 2、流式细胞仪可否检测该荧光染料的发射波长； 3、使用多种荧光染料时，要考虑荧光染料之间的干扰。
二、荧光染料的选择
颜色补偿
➢荧光染料的发射波长范围一般宽于检测器检测到的波 长范围；检测范围之外的波长可能会进入相邻的检测器 被检测，从而造成荧光信号之间的干扰。流式细胞仪可 以通过“颜色补偿”校正这一干扰。 ➢ 单标管用于调补偿。
Fluorescein (FITC)
300 nm
400 nm
Excitation
500 nm
Wavelength
Emisson
600 nm
700 nm
400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
Phycoerytherin (PE)
300 nm 400 nm
Excitation Emisson
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
FITC和PE荧光光谱
直接染色
间接染色
样品制备过程中常见的问题及解决对策
常见问题 细胞密度低 非特异荧光
强
碎片多 细胞聚集
荧光弱
原因 细胞损失 抗体不纯、死细胞多
细胞死亡、机械损伤 消化不完全
抗体少、反应时间短
解决对策 增加离心时间、弃上清 选择纯度高的抗体、用同型 对照抗体或双标记排除非特
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研究生免疫学POWERPOINT讲稿
流 式 专 题
对照样本
对照样本应与实验样本平行操作 阴性对照：评估非特异反应水平， 界定阴性范围 阳性对照：在诊断抗原表达确失性 疾病时，需确定抗原表达正常时的 抗原表达强度和百分含量 补偿调整管
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使用特异的单克隆抗体 最好使用荧光直接标记的抗体 采用适当的阴性对照物 抗体最适滴度
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流 式 专 题
淋巴细胞表面抗原分析
样本来源
新鲜抗凝全血 PBMC
单克隆荧光抗体染色 溶血 洗细胞 固定 上机检测
流式细胞术样本制备
样本制备
研究生免疫学POWERPOINT讲稿
流 式 专 题
流式细胞术样本来源
含有生物学颗粒的悬液：单细胞悬液、微 生物颗粒悬液、人工微球悬液 标本类型：
细胞悬液：
外周血（溶血）、PBMC、骨髓 灌洗液、体腔积液 培养细胞、细胞系
实体组织：
病理组织：新鲜样本/石蜡包埋样本 针吸组织：新鲜样本
实体组织：MediMachine
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流 式 专 题
单细胞悬液的处理
荧光标记抗体的染色：使用特异的单克隆 抗体
单色分析：直接标记、间接标记 双色分析：SimulSET IMK、HLA-B27 多色分析：TriTEST、MultiTEST、ProCOUNT
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流 式 专 题
淋巴细胞细胞内抗原分析
样本来源
新鲜抗凝全血 PBMC
细胞表面抗体染 色 溶血、固定 细胞打孔 细胞内抗体染色 上机检测
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研究生免疫学POWERPOINT讲稿
流 式 专 题
Cat. No 340999
11.5ml，Low 11.5ml，Med 11.5ml，High
流 式 专 题
BD Multi-Check Control
BD Multi-Check Control Cat. No 340911 12.5ml Cat. No 340912 22.5ml Cat. No 340913 52.5ml
样本制备
研究生免疫学POWERPOINT讲稿
BD Multi-Check CD4 Low Control
流 式 专 题
BD Multi-Check Control
淋巴细胞免疫表型：
CD3+ CD3+CD4+ CD3+CD8+ CD19+ CD3-CD16+56+ CD3+HLA-DR+
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靶值及质控范围：
% Total Lymph Absolute Number/L
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研究生免疫学POWERPOINT讲稿
流 式 专 题
BD Multi-Check Control
流式细胞术淋巴细胞免疫表型分 析与计数的全血质控物
抗体染色 溶血 固定 流式细胞仪设置及运行状况 分析数据，计算淋巴细胞各亚群含 量
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研究生免疫学POWERPOINT讲稿
样本制备
研究生免疫学POWERPOINT讲稿
流 式 专 题
BD Stem Cell Control
流式细胞术造血干细胞免疫表型分 析与计数的全血质控物
抗体染色 溶血 流式细胞仪设置及运行状况 分析数据，计数干细胞
Cat. No 340991
12.0ml，CD34Low 12.0ml，CD34High
红细胞、血小板表面抗原分析
样本来源
新鲜抗凝全血 PRP
单克隆荧光抗体 染色 固定 上机检测
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流 式 专 题
细胞周期分析
准确分析细胞核中DNA含量 单细胞悬液：
细胞数0.5-1106 碎片和粘连细胞少
DNA染色的线性度：CEN 单细胞分析：CTN进行DDM 检查 CV：2m微球
鞘液、洗液、PMA等：洁净，无颗粒杂质
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样本制备
Байду номын сангаас
研究生免疫学POWERPOINT讲稿
流 式 专 题
流式细胞术样本来源
血液成分的分析：如白细胞、红细 胞、血小板等
分离血液中特定细胞成分，进行分析： 操作复杂，分离、离心步骤导致细胞特 定群体丢失，并可能引入某些误差 直接使用全血：最接近生理状况，操 作简便，样本用血量小
流 式 专 题
质控品
体外诊断试验的必要保证 稳定样品，提供靶值和质控范围， 供实验室监测流式细胞仪分析实验 全过程，确保结果可靠 质控品应与实验样本同时处理，采 用相同步骤，相同试剂，相同的画 门分析方法 双水平控制：Low/High 三水平控制：Low/Median/High
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样本制备
研究生免疫学POWERPOINT讲稿
流 式 专 题
细胞周期分析
DNA Cycle Plus
Buffer Solution：细胞保存液 Solution A：破膜剂 Solution B：RNase Solution C：PI
单细胞悬液1106cells/ml，固定 消化RNA DNA染色
溶血：FACS Lysing Solution 细胞打孔：FACS Perm2 固定：1%多聚甲醛
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流 式 专 题
细胞染色
染色要求：
特异识别某一群细胞，有效区分不同细胞亚 群 非特异反应水平低 抗体校价高，用量适用于常规标本
Cat. No 340914 12.5ml Cat. No 340915 22.5ml Cat. No 340916 52.5ml
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样本制备
研究生免疫学POWERPOINT讲稿
流 式 专 题
BD Retic-COUNT Control
流式细胞术网织红细胞分析与计数的全血质控物 荧光染色 流式细胞仪设置及运行状况 分析数据，计数网织红细胞
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对照样本
对照样本应与实验样本平行操作 阴性对照：评估非特异反应水平， 界定阴性范围 阳性对照：在诊断抗原表达确失性 疾病时，需确定抗原表达正常时的 抗原表达强度和百分含量 补偿调整管
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使用特异的单克隆抗体 最好使用荧光直接标记的抗体 采用适当的阴性对照物 抗体最适滴度
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淋巴细胞表面抗原分析
样本来源
新鲜抗凝全血 PBMC
单克隆荧光抗体染色 溶血 洗细胞 固定 上机检测
流式细胞术样本制备
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流式细胞术样本来源
含有生物学颗粒的悬液：单细胞悬液、微 生物颗粒悬液、人工微球悬液 标本类型：
细胞悬液：
外周血（溶血）、PBMC、骨髓 灌洗液、体腔积液 培养细胞、细胞系
实体组织：
病理组织：新鲜样本/石蜡包埋样本 针吸组织：新鲜样本
实体组织：MediMachine
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单细胞悬液的处理
荧光标记抗体的染色：使用特异的单克隆 抗体
单色分析：直接标记、间接标记 双色分析：SimulSET IMK、HLA-B27 多色分析：TriTEST、MultiTEST、ProCOUNT
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淋巴细胞细胞内抗原分析
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新鲜抗凝全血 PBMC
细胞表面抗体染 色 溶血、固定 细胞打孔 细胞内抗体染色 上机检测
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Cat. No 340999
11.5ml，Low 11.5ml，Med 11.5ml，High
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BD Multi-Check Control
BD Multi-Check Control Cat. No 340911 12.5ml Cat. No 340912 22.5ml Cat. No 340913 52.5ml
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BD Multi-Check CD4 Low Control
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BD Multi-Check Control
淋巴细胞免疫表型：
CD3+ CD3+CD4+ CD3+CD8+ CD19+ CD3-CD16+56+ CD3+HLA-DR+
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抗体染色 溶血 固定 流式细胞仪设置及运行状况 分析数据，计算淋巴细胞各亚群含 量
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抗体染色 溶血 流式细胞仪设置及运行状况 分析数据，计数干细胞
Cat. No 340991
12.0ml，CD34Low 12.0ml，CD34High
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细胞周期分析
准确分析细胞核中DNA含量 单细胞悬液：
细胞数0.5-1106 碎片和粘连细胞少
DNA染色的线性度：CEN 单细胞分析：CTN进行DDM 检查 CV：2m微球
鞘液、洗液、PMA等：洁净，无颗粒杂质
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流式细胞术样本来源
血液成分的分析：如白细胞、红细 胞、血小板等
分离血液中特定细胞成分，进行分析： 操作复杂，分离、离心步骤导致细胞特 定群体丢失，并可能引入某些误差 直接使用全血：最接近生理状况，操 作简便，样本用血量小
流 式 专 题
质控品
体外诊断试验的必要保证 稳定样品，提供靶值和质控范围， 供实验室监测流式细胞仪分析实验 全过程，确保结果可靠 质控品应与实验样本同时处理，采 用相同步骤，相同试剂，相同的画 门分析方法 双水平控制：Low/High 三水平控制：Low/Median/High
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细胞周期分析
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Buffer Solution：细胞保存液 Solution A：破膜剂 Solution B：RNase Solution C：PI
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溶血：FACS Lysing Solution 细胞打孔：FACS Perm2 固定：1%多聚甲醛
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细胞染色
染色要求：
特异识别某一群细胞，有效区分不同细胞亚 群 非特异反应水平低 抗体校价高，用量适用于常规标本
Cat. No 340914 12.5ml Cat. No 340915 22.5ml Cat. No 340916 52.5ml
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