微核检测技术郭
医学：人外周血淋巴细胞微核测定
06 微核测定的研究展望
CHAPTER
提高检测灵敏度与特异性
优化样本处理
通过改进样本处理方法，减少杂质干扰，提高检测的灵敏度和特 异性。
研发新型标记物
探索新的生物标志物，以更准确地反映细胞损伤和疾病状态。
引入人工智能技术
利用人工智能算法对检测结果进行深度分析和模式识别，提高检测 的准确性和可靠性。
结果分析
计数微核率
对观察到的具有微核的淋巴细胞进行计数，计算微核率。微 核率越高，说明受试者的染色体受到损伤的程度越高。
结果解读
根据微核率的大小，结合受试者的基本信息和健康状况，对 结果进行解读，为受试者的健康状况提供参考依据。
04 微核测定的结果解读
CHAPTER
正常值范围
1
正常值范围因年龄、性别、种族等因素而异，通 常根据大样本统计数据确定。
在辐射损伤评估中的应用
辐射暴露监测
微核测定可以用于监测辐射暴露者的DNA损伤程 度，评估辐射对人体的影响。
辐射剂量估算
通过微核计数可以估算辐射剂量，为受辐射损伤 人员的治疗和康复提供参考。
辐射危险评估
微核测定可以用于评估不同人群在不同环境中的 辐射危险程度，为制定防护措施提供依据。
在药物安全性评价中的应用
02
微核是由于染色体断裂或异常复 制形成的，是细胞染色体异常的 标志之一。
微核测定的历史与发展
微核测定最早由国外学者于20世纪 70年代提出，经过几十年的发展， 已经成为一种广泛应用于医学、生物 学和环境科学领域的实验室技术。
随着技术的不断进步，微核测定的方 法不断完善，检测的灵敏度和特异性 不断提高，为科学研究提供了更加可 靠的实验数据。
医学人外周血淋巴细胞微核测 定
应用蝌蚪快速检测环境变异的两种方法——微核试验和单细胞凝胶电泳
应用蝌蚪快速检测环境变异的两种方法——微核试验和单细胞凝胶电泳四川动物2004年第23卷第1期SichuanJoin-halofZoologyV o1.23No.12004应用蝌蚪快速检测环境变异的两种方法——微核试验和单细胞凝胶电泳苑宇哲,徐仕霞,姚春生,刘志君,李旭东,王跃招(中国科学院成都生物研究所,成都610041)摘要:本文介绍了应用无尾两栖类动物的蝌蚪进行环境监测的两种方法——微核试验和单细胞凝胶电泳.此两种环境检测的方法与其他环境检测方法相比具有快速,简便,易操作,适于检测现场应用,可大面积推广等优点.关键词:蝌蚪;生物检测;微核试验;单细胞凝胶电泳实验中图分类号:X830文献标识码:A文章编号:1000—7083(2004)01—0074—03 ReviewonMonitoringEnvironmentalContaminationUsingMicronncleusTestand SingleCellGelElectrophoresis(Comet)AssayinTadpoleYUANYu—zhe,XUShi—xia,YAOChunsheng,LIUZhi-jun,LIXu—dong,WANGYue-zhao(ChengduInstituteofBiology,ChineseAcedemyofSciences,Chengdu,SichuanProvince,6 10041)Abstract:Twomethodsaboutmonitoringenvironmentpollutionthroughgeneticabnormalit yoftadpol~,mieronu-cleustestandsinglecellgelelectrophoresis(comet)assay,werereviewed,andtheadvantages andshortcomingsofthesetwomethodswerediscussed.Keywords:tadpole;biomomtoring;micronucleustest;singlecellgelelectrophoresisassay随着工农业的发展,人类对自然环境的破坏越来越严重,自然环境的破坏反过来又引发了一系列生态,社会和经济问题.人们逐渐对环境质量的变化重视起来,出现了基于各种生物标志物的环境检测技术.主要有以蛋白质和DNA为标志物的各种检测方法,又可以根据指示生物分为应用微生物,低等动物,底栖动物等的检测方法.两栖动物蝌蚪皮肤渗透性强,分布广,数量多,易于饲养和观察,在水体环境检测中作为指示生物有很大的优势.因此近年来有关利用蝌蚪来监测水体环境的研究在国内外越来越引起重视.本文着重介绍两种可应用于蝌蚪的快速实用的检测方法——微核技术和单细胞凝胶电泳.1微核技术(micronucleustest,MN或MCNT)1975年,Kligerman等…成功地以理化因素诱发荫鱼细胞染色体畸变以来,以鱼类遗传学研究检测水环境中的污染物受到关注.在此基础上发展起来了应用动物分裂相细胞进行的微核试验技术.如鱼外周血微核试验监测水体中的污染物,小鼠骨髓细胞经口灌流给药检测待测化学物质的遗传毒性[,以及蝾螈和两栖类的微核实验评价环境污染物的遗传毒性L3,4].MN是根据环境污染物能引起DNA损伤,诱发染色体畸变而在细胞核外形成微核的原理,从而检测诱变物质对染色体损伤的一种简便易行的方法.其原理是由于外源物质的干扰,染色体断裂,在细胞分裂过程无着丝点的染色体断片,无法正常进入到子细胞中,在细胞核外可产生微小的核,涂片染色后,计算微核率,检测染色体受伤害程度,进而反映化学物的遗传毒性.根据微核技术的原理检测到微核的发生需要一个基础条件,即必须要有分裂相细胞并且分裂较同步,只有存在分裂相细胞才能根据细胞在分裂的过程中行为产生异常进行检测.除此基本条件外,待测物质的浓度须设计在合理的范围之内,不影响到细胞的分裂能力.耿德贵等_5J用除草剂乙草胺长时间或高浓度处理时均会导致蝌蚪红细胞微核细胞率及核异常细胞率的下降,提出可能是由于长时间处理会引起细胞因适应而增收稿日期:2003—11—04基金项目:中国科学院知识创新工程重要项目:"KSCX2.S,W.102.02"和中国科学院知识创新课题:"K~5'X2一SW-101B"资助SupportedbytheKnowledgeInnovationProjectoftheChineseAcademyofSciences *通讯作者Correspondingauthor(E-mail:************.cn)74I/!t111动物2004年第23卷第1期SichuanJournalofZoologyV o1.23No.12004强修复损伤能力或大量的受损伤死亡,高浓度处理会抑制或终止细胞的分裂.检测结果中,诱发红细胞的微核率高低取决于水体中的致突变物或细胞纺锤体抑制剂活性的强弱,还取决于细胞有丝分裂的旺盛程度和细胞分裂速度.MN根据染毒试验可分为体内试验(invivo)和体外试验(invitro).在体实验是活个体整体染毒之后,取血涂片检测;离体试验是取高分裂活性细胞体外培养,在染色涂片前,加污染物使细胞受毒,再进行检测.在体实验与自然环境中动物受毒方式较一致,且考虑到实际应用,多采用体内染毒试验.离体试验可作为实验室中对外源物的遗传毒性检测的一种方法.有些学者认为把蝌蚪红细胞微核试验作为检测水中污染物是一种比其他动物理想的方法,一方面是由于蝌蚪的红细胞体积较大,经过染色后,在显微镜下细胞质和细胞核的结构极为清晰,易于对微核的观察,另一方面蝌蚪红细胞本身正处于旺盛增殖阶段,对水体中的污染物反应灵敏度高于鱼类【,一1.贺维顺【1等曾开展过鱼类细胞微核试验,但其灵敏度较低,无法检测水体中的低浓度的致癌物和致突变物.两栖动物的蝌蚪是变态前的幼体,处于高度分化发育阶段,对水体中的低浓度毒物反应灵敏度高.两栖类动物的蝌蚪红细胞微核检测法是业已证实的检测水环境中的致突变物或致癌物灵敏度高的方法之一【,m】.陈军建等L8]将青蛙黑斑蛙蝌蚪红细胞微核试验发展成监测水体污染物诱变活性的一种规范化,标准化的生物活体快速检测系统.提出青蛙蝌蚪红细胞分裂旺盛具有低而稳定的微核本底,对污水的诱变活性很敏感,是～种有效的指示生物.2DNA断裂检测——单细胞凝胶电泳技术(sin. glecellgelelectrophoresisassay,SCGE)环境中多种因素包括物理的,化学的以及混合因素如老化,吸烟等,均可引起DNA单链断裂(singlestrand break,SsB),虽然偶尔的SSB不会影响双链DNA分子的连续性,但却会影响DNA分子的遗传行为,近年来多采用单细胞凝胶电泳法检测SSB.该法是20世纪70年代末提出的,由Ryberg和Johanson等…J最先提出单细胞损伤定量,Ostling等-】J应用中性微胶电泳技术使检出灵敏度得到了提高,之后Sin曲¨.]又发现在碱性条件下结果更突出,将此方法进一步完善.由于该技术灵敏度可达1/107个核苷酸,与其他方法相比具有一定的优势,其应用很快受到了重视[14l.单细胞凝胶电泳法(singlecellgelelectrophoresisassay.5~3GE)也叫彗星试验(cometassay),是一种快速,敏感,简便,廉价的检测单个哺乳动物细胞DNA断裂的技术.9cGE在单个细胞水平上检测DNA损伤和修复.其基本原理是:在中性或碱性条件下,包埋在琼脂凝胶中的细胞裂解,DNA解螺旋后进行电泳,如细胞未受损伤,则核DNA断片较少,片段较大,电泳时DNA因其分子质量大而停留在核基质中,经荧光染色后呈圆形的荧光团无拖尾现象;若细胞受损,DNA断片较多,在碱性条件下DNA解螺旋变为单链,电泳时因DNA分子量小可以进入凝胶中,向阳极伸展,荧光显微镜下呈一个亮的头部和尾部,形似彗星,故又称彗星试验.细胞和DNA受损越严重,产生的断片越多并且片段越小,电泳时迁移的DNA量也就越大,迁移距离越长,荧光显微镜下可观察尾长增加,尾都荧光强度增强,通过测定迁移部份的光密度和迁移长度就可定量测定单个细胞的DNA损伤程度.SCGE本身是一种单纯的实验技术,国内对于实际操作上一些小的地方上有许多种改进,使该方法更容易应用.5K3GE操作步骤大体为:先制作一层固着凝胶,将打散的新鲜待测细胞与低熔点琼脂糖凝胶相混,滴加到载玻片上,形成第二层凝胶,盖上盖玻片,置于冰箱内待其凝固后将盖玻片取走,再滴加第三层凝胶.待其凝固后, 在碱性条件下电泳,调节液面使电压维持在25V,265～270mA,3℃,20rain.根据经验,取走盖玻片具有一定的难度,故试着使用bindsilane使盖玻片硅化易于取走.还采用其他方法-J,将凝胶滴在限制的范围之内,如在载玻片上设计凹槽,以回避使用盖玻片.经实验证实结果均较为可信,只是各种改进的操作之间结果可比性较低,需要规范化.但也可以采用其他方法解决,只要在各种试验操作中平衡时间和电泳时间上设计梯度以摸索出最适合于这种操作的条件,设计了合理的阴性对照,结果分析仍然具有可参考性.s0GE能对单个细胞DNA损伤进行研究,应用范围广,目前已用于检测过氧化,紫外线和电离辐射引起的损伤,以及三氯乙烷,丙烯膦胺等化学物及吸烟,老化所致损害的研究L】引.StevenRalph等-J6J以笼养的蝌蚪为材料,应用碱性单细胞凝胶电泳技术建立了环境监测的平台,提供了水环境基因毒性检测的一个较敏感的系统.3讨论目前,有多种环境检测方法,其主要分类方法有两种,根据指示生物和生物标志物进行分类.根据指示生物可以分为利用微生物诱发突变率,原生生物,水虱,藻类,贝类等的生长量进行环境监测,鱼类和两栖动物对水环境进行检测,利用哺乳动物的体内和体外实验进行外源化学物质的遗传毒理学的检测.另外,根据生物标志物可以分为依据行为,生理生化标志物等进行的检测,生化标志物检测方法又可具体细化为以染色体异常,DNA断裂,DNA加合物,蛋白质加合物,DNA和蛋白质交连等为检测对象的检测方法.其中以两栖动物蝌蚪为指示生物,以染色体异常和DNA断裂为生物标志物的微核试验和单细胞凝胶电泳实验,相对于其他生物监测方法具有简便易操作,无需复杂7l5四川动物2004年第23卷第1期SichuanJournalofZoologyV o1.23No.12004 的实验设备等优势,在水体污染检测中拥有很大的优势.以蝌蚪为指示生物在检测杀虫剂,化学物污染和环境辐射等方面已经得出了令人满意的试验效果【】引.以蝌蚪为实验动物做微核测定有其特有的优点:1.蝌蚪数量多,便于观察和实验,费用低.2.蝌蚪红细胞较大,细胞分裂旺盛,对污染物反应灵敏.3.蝌蚪体表薄,完全与水体接触,没有保护性的隔离(如鱼的鳞片,昆虫的壳等)结构,皮肤的通透性好,对环境质量变异敏感.4.蝌蚪体内具有转化前诱变剂或前致癌剂为具有活性成分的微粒体活性系统,这使蝌蚪不仅能用于检测水体中的直接致突变物,而且还能检测水体中的前致突变物_24J.5.蝌蚪微核试验不仅能检测水中单因子致突变效应,而且更适合检测污水中混合污染物的联合致突变效应,具有较高实用价值J.国外以蝌蚪为实验材料进行SCGE试验检测水体污染进行较早,也较规范,已经建立起了比较科学,实用,规范的检测体系.Steven等(1998)运用这种体系检测了美国南部10个水体的污染程度,检测到的不同水体的污染程度具有可比性¨.目前,国内应用蝌蚪括体检测水体污染的工作开展得还不多~23l.由于以蝌蚪为活体指示生物的ScGE技术体系在检测水体污染方面有很好的应用价值, 可以预期其将会受到国内研究者的相应重视.4参考文献【1]KligermanAD,Blo0mSEandHowellWM.Umbralimi: Amodelforthestudyofchromosomeaberrationsinfishes【J].Mu~tbnResearch,1975,31(4):225～234.【2]PrzygodaRT,McKeeRH,AmolzlSOMA,eta1.Assess—mentoftheutilityofthemicronucleustestforpetroleum- derivedmaterials[J].MutationResearch,1999,438:145～153.【3]B6kaertC,RastC,FerrierV,eofinvitro (AmesandMutatoxtests)andinvivo(AmphibianMi—cronucleustest)assaystoasse~thegenotoxicityof leaehatesfromacontaminatedsoil[J].Organic~helTl—istry,1999,30:953--962.14]Zoll-MoreuxCandFerfierV.Thejaylettest(newtmi—cronucleustest)andthemicronucleustsetinxenopus:two invivotestsonamphibiaevaluationofthegenotoxicityof fiveenvironmentalpollutantsandoffiveeffluents[J].WatRes,1999,33(10):2301--2314.[5]耿德贵,刘贤德,温洪宇,等.除草剂乙草胺对蝌蚪红细胞微核及核异常的影响[J].环境与健康杂志, 2000,17(1):36--38.[6]贺维顺,王蕊芳.污水和污水土地处理系统中各种水质对华西蟾蜍蝌蚪红细胞微核率的影响[J].动物学研究,1992,13(3):275279.[7]王蕊芳,贺维顺,吴世芳,等.昆明水源水和自来水76水质致突变性及化学背景值Ⅱ.蝌蚪红细胞微核和CHO细胞染色体畸变及SCE试验[J].动物学研究, 1996,i7(4):469--475.[8]陈军建,夏宜.青蛙蝌蚪微核试验——一种水体诱变剂检测系统的建立[J].水生生物,1993,17(4):298--308.[9]贺维顺,王蕊芳.蝌蚪(B咖6咖andrewsi)血红细胞微核和核异常监测水质污染的研究[J].动物学研究, 1990,11(1):1--6.[10]Andr6]aylet,PierreDeparis,VincentFerrier,eta/.A newmicronucleustestusingpenpheralblooderyth~es ofthenewtrode/eswaltltodetectmutagensinfresh—waterpollution[J].MutatRes,1986,164:245--257. [11]HanawaltPC,FriedmanEC,FoxCF,eta/.DNARe—pairMechanisms[M].NewY ork,AcademicPress,1978: 465--468.[12]OstlingO,JohansonKJ.Micr~lectrophoreticstudyof radiation-inducedDNAdamagesinindividualmammalian eells[J].BiochemBiophysResCommun,1984,123(1): 291--298.[13]SinghNP,McCoyMT,TiceRR,et.Asimpletech—niqueforquantitationoflowlevelsofDNAdarnageinindi—vidualcells[J].ExpCellRes,1988,237(3～4):123～l30.[14]秦椿华,沈建英,黄仕和,等.DNA断裂检测方法一单细胞凝胶电泳法[J].生物化学与生物物理进展, 1995,22(6):517--520.[15]程淑群.单细胞凝胶电泳技术在职业和环境医学生物监测中的应用[J].工业卫生与职业病,2001,27(2):125～128.[16]StevenRalph,MichaelPetras.Cagedamp}fiblantadpoles andinsitugenotoxicitymonitoringofaquaticenviron—mentswiththealkalinesinglecellgeleletrophoresis (comet)assay[J].MutationResearch,1998,413:235--250.[17]张建平,田源,陈道达.单细胞凝胶电泳制胶方法的改进[J].癌变?畸变?突变,1998,10(3):189--190.118]MBriaFernandez,JacquesL'Ha~don,LauryGauthier, eta/.Amphibianmicronucleustest(s):asimpleandreli. ablemethodforevaluatinginvivogenotoxiceffectsof freshwaterpollutantsandradiations[J].InitialA圯疆11en. MutationResearch/EnvironmentMutageneslsandRelat—edSubjects,1993,292(1):83--99.【19]ZofiaRudek,MariaRo~ek.Inductionofmicronueleiin tadpolesofRanatemporariaandXenopus/aevisbythe pyrethroidFastac10EC[J].MutationResearch/Genetic Toxicology,1992,298(1):25～29.(下转第80页)四川动物2004年第23卷第1期100米,在坡度为6--20.的西南向坡上的原始灌丛,高3～4米,盖度25%--49%;灌丛中生长着3--5米高,盖度为O%～24%的青川箭竹.因为大熊猫有季节性迁徙和撵笋的生活习性,目前正是箭竹发笋的季节,所以在这里发现大熊猫的实体应属正常.只可惜我们不能久候,在给郑大爷做了一些保护工作的宣传之后,便离开了.朋友,您一定想见一见野外的大熊猫吧,一定想来咱国宝的家园看一看吧.那么好吧,我们欢迎您,我们邀请您,来吧,到雪宝顶自然保护区来吧,来科学考察,来生态旅游,来看看咱们的大熊猫!(鄢蜀歧四川省平武县自然保护区管理处)(上接第76页)[2O]张朝晖,陈锋,吴端生,等.除草剂乐草隆对红鲫的遗传毒性研究[J].中国实验动物,2002,10(3):185～187.[21]封少龙,罗屿,钟远,等.应用单细胞凝胶电泳技术测定农药对蚯蚓的DNA损伤[J].南京大学(自然科学版),2000,36(5):649--652.[22]余日安,陈学敏.应用单细胞凝胶电泳研究镉对大鼠肝细胞DNA损伤的影响[J].环境与健康杂志,2000,17(5):271--273.[23]钱宁,李达圣,甘世祥.5一氮胞苷对贵州小型猪淋巴细胞DNA损伤及修复的影响[J].中国实验动物,2002,10(4):223--226.[24]贺维顺.一种水质污染生物监测的新方法——蝌蚪肠细胞染色体畸变分析[J].环境科学,1987,7(4):467--471.四川省动物学会第八次会员代表大会暨第九次学术年会将于今年7月在南充召开经理事会讨论,决定四川省动物学会第八次会员代表大会暨第九次学术年会于2004年7月15～18日在四川省南充市西华师范大学召开.为了把会议办好,理事会专门召开了会议,成立会议筹备组,学术组.会议将特邀专家作学术报告,开展学术交流.会议将进行理事会换届工作.理事会希望广大会员和动物学工作者踊跃撰稿参会.理事会还欢迎国内外专家与会交流.这次会议是进入二十一世纪后学会召开的第一次会员代表大会和学术年会,学会秘书处和西华师范大学已经开始进行筹备工作.会议收取注册费每人300元(在读学生减半),食宿会议统一安排,费用自理.学术交流征文内容:区系分类与自然保护,实验动物,动物与驯化,教学,养殖,寄生虫学与媒介控制,科普等.请将征文全文(或摘要)及其软盘交学会秘书处陈跃荚处.征文截止日期:2004年4月30日.学会秘书处地址:成都市人民南路四段9号中国科学院成都生物研究所(610041)联系人:曾晓茂,陈跃荚,李成电话:028—85223703,85241980,85233060传真:028—85222753E-mail:licheng@cib.ac.cFI会议报到地点:南充市西华师范大学珍稀动植物研究所联系人:周材权电话:0817—2314577.2314364,2155985。
利用泥鳅及蝌蚪红细胞微核技术监测小洋河的水质
１４ ． 方法
的一种 简便 、 快速 、 有效 的生物监测方法… 。本研究选用 ２种
水生动 物——泥 鳅 及 中华 大 蟾 蜍 蝌 蚪 进行 红 细胞 微 核试 验 ， 监测小洋河水 中污染 物的致突变性 ， 以了解盐城 市主 要水体的污染状 况 ， 从而为地方水环境的监测治理、 保护水生 动物 、 保证人 民健康提供依据。
从小洋河市区段分别在 上段 、 中段 、 段各选取 ３个 点 ， 下 各取水样 ５００ｍＬ 过滤除去较粗的悬浮颗粒 ， 于塑料瓶 内 ０ ， 置
避光保存 ， ４℃冰箱 中保存备 用。
１ ２ 试 验 动 物 ．
尾， 取血 ， 涂片 ， 自然 晾干 ， 甲醇 固定 液 固定 １ ｉ， ｉｍ ａ 用 ５ｒ ｎ Ｇ ｅ ｓ ａ
染液染色 １ ｉ ， ５ｍ ｎ 水洗 ， 晾干 。 １４ ２ 小洋河水对蝌蚪 红细胞微 核的影 响 ．． 对照组 用曝气 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
泥鳅 ： 发育状 况相 似 ， 重 （ ．６±１４ ） ， 长 （ ． 体 ２８ ．２ ｇ 体 ８ ２±
１ １ ）ｍ， ．４ ｅ 购于盐城市商业街菜市场 ， 试验前用 曝气 的 自来水 驯养 １ ， ２ｄ换水 １次 ， 周 每 整个驯养和染毒过程 都不添加任 何饲料 ， 试验时挑选外 观健康 的正常个体进行处理 。 中华大蟾蜍变态期的蝌蚪 ： 体重 ０ ２ｇ ． 左右 ，— ５ ４ 月初采
实验十(方案设计)诱变物质的微核测试
结果分析与讨论
结果分析
对实验结果进行深入分析，探讨诱变物质导致微核形成的可能原因，如DNA损伤、染色体畸变等。
结果讨论
将实验结果与已有研究进行比较，讨论本实验的优缺点及改进方向，提出进一步的研究设想和建议。
06
实验结论与展望
实验结论总结
诱变物质对微核率的影响
通过对比不同浓度诱变物质处理后的微核率，发现随着浓度的增加，微核率呈现上升趋 势，表明诱变物质具有诱导微核形成的能力。
6. 数据分析
根据观察到的微核数量，计算诱变物质的诱变指数（MI）， 并绘制剂量-效应曲线。通过比较不同浓度梯度下的MI值， 评估诱变物质的诱变能力。
03
微核测试技术
微核测试原理
微核形成机制
微核是由于染色体或染色质的无着丝粒断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色 体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，成为由单层膜包被的细胞质中的遗传物 质，即形成微核。
诱变物质作用
诱变物质能够导致染色体断裂，形成无着丝粒断片，从而在细胞分裂过程中形 成微核。通过检测微核的出现频率，可以评估诱变物质的遗传毒性。
微核测试方法
样本制备
选择适当的实验动物或细胞系，给予不同浓度的诱变物质处理， 同时设立对照组。
微核观察
在特定的时间点，收集处理组和对照组的细胞样本，经过染色后， 在显微镜下观察微核的出现情况。
微核测试优缺点
假阳性率高
某些非诱变物质也可能导致微核的形成，从而产生假 阳性结果。
无法确定具体机制
微核测试只能检测到遗传物质的损伤，但无法确定具 体的损伤机制和路径。
受多种因素影响
实验结果可能受到实验动物种类、年龄、性别、生理 状态以及处理条件等多种因素的影响。
微核试验的原理原理
微核试验的原理原理微核试验是一种利用基因工程技术测定对特定物质敏感的微生物的方法。
其核心原理是利用基因工程技术将目标物质敏感的基因与荧光标记基因连接到一起，使得微生物在受到目标物质诱导后产生荧光信号。
微核试验的具体步骤包括有源菌株的培养、基因工程的构建、转化菌的选择和测试等。
首先，需要选用一种天然的微生物作为有源菌株，它对待检物质具有一定的敏感性。
有源菌株在培养基中生长，形成菌液用于后续实验操作。
接下来，需要构建基因工程载体，将目标物质敏感的基因与荧光标记基因连接到一起。
在构建的过程中，需要选择适当的启动子、调控元件和选择性标记基因等。
启动子能够在受到目标物质的诱导时促进基因的表达，调控元件能够调节激活基因的程度，选择性标记基因能够筛选成功转化的菌株。
然后，将构建好的基因工程载体转化到有源菌株中。
转化可以采用化学方法、电转化方法或基因枪法等不同的转化方法。
转化成功后，会得到具有目标基因的转化菌株。
接着，对转化菌株进行筛选和文化处理。
筛选可使用抗生素等选择性标记基因进行，只有获得构建好的基因工程载体的菌株才能存活下来。
筛选过程中，需要对转化菌株进行培养，以保证菌株的活性和增殖。
最后，进行目标物质的检测。
将培养好的转化菌株置于受检物质条件下进行培养，如果待检物质存在，则会激活目标基因的表达，产生荧光信号。
通过观察菌液中的荧光强度可以判断待检物质的存在与浓度大小。
微核试验的原理主要是利用了生物体对待检物质的敏感性，通过基因工程技术的手段将该敏感基因与荧光标记基因连接起来，实现了对待检物质的检测。
微核试验的优势在于可以快速、准确地检测某种特定物质，并且对环境友好，无需使用放射性或有毒性物质。
因此，微核试验在环境污染监测、食品安全检测等领域具有广泛的应用前景。
诱变物质的微核检测技术—蚕豆根尖微核检测与应用
v 更多问题……
五、 实验流程——准备工作 ——
v 每个自然班分成4个组
§ §
人数基本相同、确定每小组的组长 确定试验目的、各小组所用的处理因素(阴性 对照、阳性对照、两种污水处理) 上报分组名单(组长)、试验目的、因素 实验开始前提交试验方案(班内协调、统一时 间安排)
§ §Leabharlann 实验工作时间安排参考§
若干种待测诱导物(如不同来源的污水)，由各 组同学采集 阳性对照(NaN3)：已证明可诱导微核形成 阴性对照(洁浄水样)：微核形成率接近于0
§ §
五、 实验流程
准备工作 § 查阅文献 § 确定研究目的 • 如：待测物、蚕豆品种差异等 § 制订试验方案 v 蚕豆发根、取材 v 处理与恢复培养 v 取材制片、镜检观测 v 结果分析、撰写报告(论文)
诱变物质的微核检测技术 诱变物质的微核检测技术
——蚕豆根尖微核检测与应用 —— 蚕豆根尖微核检测与应用 (综合型实验) (
四川农业大学 普通遗传学课程组
提 纲 纲
1. 实验目的 2. 实验原理 3. 实验材料 4. 用具与药品 5. 实验流程
一、 实验目的
v v v
了解诱变物质微核检测技术原理与应用 掌握蚕豆根尖微核检测技术 了解研究性试验开展的基本环节
§ §
实验教学角度：综合性实验 实验内容角度：研究性试验(非验证性实验)
二、 实验原理
u u u
微核的概念与形成 微核检测技术 微核检测的应用
（一）微核的概念与形成
v
微核(micronuclei, MN/MCN)
天数 工作内容 方案、材料与待测物准备 1 2 3 5 6 7 8+ 浸种(其间换水两次) 第一阶段催芽 第二阶段催芽(其间检查水分) 诱导处理 恢复培养 根尖取材、固定 解离、制片观察 结果分析与报告写作 24h 12~24h 36~48h 12~24h 22~24h 24h 2~4h 大致时间 注意 班、组 自然班 组 组 组 组 组 组 组
体外微核试验原理
体外微核试验原理最近在研究体外微核试验，发现了一些有趣的原理，今天就来和大家好好聊聊。
咱们先从一些生活现象说起吧。
你看啊，咱们的身体就像一个超级精密的工厂，每个细胞都是一个小车间，里面的染色体就像是车间里重要的生产图纸。
可有时候，这些“图纸”会受到一些外界因素的影响，像是香烟里的有害物质啊、化学污染这些，就像车间里跑进了调皮捣蛋鬼，可能就捣乱搞破坏了。
体外微核试验呢，就是一种检测这些“车间”被破坏情况的手段。
微核啊，简单说就像是从那些正常“生产图纸（染色体）”上掉下来的小碎片。
微核试验就是在细胞外面（体外）做实验，观察细胞产生微核的情况。
打个比方吧，这就像是在车间外面透过窗户查看里面，有多少不正常的小碎片产生了。
说到这里，你可能会问，那这怎么观察呢？这就不得不提到一些特定的细胞培养和染色技术这些专业的手段啦。
我们把要检测的细胞放在一个特定的环境里培养，就像摆在特殊的货架上，然后用染色剂等东西来标记，这样那些微核就像带上了特殊的标签，我们就能清楚地看到它们啦。
其实我一开始也不明白，这么复杂的试验它到底有啥用啊？后来才知道，它可有用处啦。
拿制药行业来说，公司研发新的药物，就可以用体外微核试验来检测这个药会不会对细胞里的染色体产生不好的影响，就像是提前检查这个新药是不是会破坏我们身体这个大工厂的“生产图纸”。
要是产生好多微核，可能这个药就有潜在的危险哦。
可是啊，这里边还有一些令我困惑的地方，比如说在不同的细胞类型中，微核产生的情况好像不太一样，到底是细胞本身的特性造成的，还是其他因素的干扰呢？这也让我更加深入去学习不同细胞类型的区别这些知识。
实用价值可不仅仅在制药方面。
像检测环境中的污染物是不是有致癌性之类的危险时，也能用到体外微核试验。
比如说，某地有工厂污染，就可以采集当地生物的细胞做体外微核试验，查看这污染是不是让生物的细胞里产生很多微核，如果是，那就说明这污染可能很危险，得治理。
不过做这个试验也有些注意事项。
微核技术-用大蒜做实验材料
诱变物质的微核检测技术摘要微核体检测是一种对环境中诱变物质进行评估的快速而简便的方法，被广泛应用于很多行业。
此次实验，利用自主选定的化学制剂培养大蒜根尖，后通过观察根尖中的微核体来检测此试剂的诱变能力，了解了微核检测的方法和意义，掌握了一项评价环境中常见物质诱变情况的技术。
1.引言微核是细胞在间期时，染色体发生断裂，在进入下一次分裂时，染色体片段不能随有丝分裂进入子细胞，而在细胞浆中形成直径小于主核的、与主核分开的微小核，主要由外界损害因素（生物、物理、化学因素）对细胞的作用形成的。
19世纪末，Howell与Jolly分别在猫和大鼠外周血中发现一种小体，命名为Howe ll-Jolly小体，并且发现这种小体也存在于恶性贫血患者外周血中。
这一小体便是今日被称之为微核的小体。
1959年，Evans等将蚕豆根端细胞暴露在电离辐射下，观察到辐射诱导微核形成效应，并据此间接推断微核来源于辐射诱导的染色体异常。
这篇文献便是以微核发生率反映染色体异常来评价遗传毒性的第一篇报道。
作者认为约60%染色体断片与微核形成直接相关。
1970，年Boiler和Sehmid以中国金黄地鼠为材料，观察了抗肿瘤药三亚胺给予后，骨髓与外周血细胞学的变化，并且提出用本来无核的外周血嗜多染红细胞中的微核发生率来作为微核试验的基本指标，并正式命名为微核实验。
70年代初，Matter和Schmid首先用啮齿类动物骨髓细胞微核率来测定疑似有诱变活力的化合物，建立了微核测定法。
此后至70年代中期，Sehmid以及Heddle研究小组的工作，全面奠定了微核实验的理论及应用基础。
近年来，由于大量新的化合物的合成，原子能的应用，各种各样工业废物的排出，日常生活中人类接触到的有潜在遗传毒性的物质越来越多，微核实验的重要性也就随之突显出来。
微核实验技术简单易行且灵敏，目前国内外不少部门已把微核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、食品添加剂的安全评价，以及染色体遗传疾病和癌症前期诊断等各个方面2.实验材料及方法2.1实验材料2.1.1试验材料大蒜。
植物根尖微核检测技术
• （6）染色：吸去盐酸，用蒸馏水浸没幼根三次， 每次1～2分钟。最后浸于水中。于载玻片上，截下 1～2mm左右长的根尖，滴一滴醋酸洋红染液，染 色5～8分钟，加盖玻片，压片观察。 • （7）观察与计算：首先在显微镜低倍镜下找到分 生组织区细胞分散均匀，分裂相较多的部位，再转 高倍镜观察。微核大小在主核1/3以下，并与主核分 离，着色与主核一致或稍浅，呈圆形或椭圆形。每 一处理观察3个根尖，每个根尖数1000个细胞，统 计其中含微核的细胞数，然后计算平均数，即为该 处理的MCN%，即微核千分率，以此可作一个检测 指标。
应用举例
• 评估污水处理厂污水处理效率：对污水处 理前后的微核千分率进行比较，可有效指 示污水处理效果。 • 对化妆品致突变作用的检测：嵇庆等 （1994）用蚕豆根尖微核法检测了10种脂 溶性面霜的致突变性，结果其中的3种有致 突变作用。
实验材料
• 松滋青皮豆或洋葱
器具和药品
• 显微镜、镊子、载玻片、盖玻片、烧杯、 瓷盘。6mol/L盐酸、甲醇、冰醋酸、醋酸洋 红、CrO3、NaN3、EMS。
实验目的
• 了解微核测试的原理和毒理遗传学在实际生活与 工作中的应用范围及意义 • 学习根尖的微核测试技术
实验原理
• 微核简称(MCN)，也叫卫星核， 是真核生物细胞中的一种异常 ，也叫卫星核， 微核简称 结构，也是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式，往往是细胞经 结构，也是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式，往往是细胞经 形式 辐射或化学药物的作用而产生。在细胞间期微核呈圆形或椭圆形， 辐射或化学药物的作用而产生。在细胞间期微核呈圆形或椭圆形，游 离于主核之外、大小应在主核 ／ 以下 以下。 离于主核之外、大小应在主核1／3以下。微核是由有丝分裂后期丧失 着丝粒的断片产生的， 着丝粒的断片产生的，但有些实验也证明整条的染色体或多条染色体 也能形成微核。 也能形成微核。这些断片或染色体在细胞分裂末期被两个子细胞核所 排斥便形成了第三个核块。 已经证实微核率的大小是和用药的剂量或 排斥便形成了第三个核块。 辐射累积效应呈正相关。 目前微核测试已经广泛应用于辐射损伤、 辐射累积效应呈正相关。 目前微核测试已经广泛应用于辐射损伤、辐 相关 射防护、化学诱变剂、新药试验、 射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等 各方面 各方面。
生物细胞的微核检测技术
生物细胞的微核检测技术一、原理微核(micronuclei)简称MCN,是真核类生物细胞中的一种异常结构，往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生的。
在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应有主核1/3以下。
微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成DNA的能力。
一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的断片产生的，整条染色体或几条染色体也能形成微核。
这些断片或染色体在细胞分裂末期被两个子细胞核所排斥便形成第三个核块。
微核率的大小是和用药的剂量或辐射累积效应呈正相关，这一点和染色体畸变的情况一样。
所以许多人认为可用简易的间期微核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数。
由于大量新的化合物的合成，原子能应用，各种各样工业废物的排出，使人们很需要有一套高度灵敏，技术简单的测试系统来监视环境的变化。
只有真核类的测试系统更能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害，在这方面，微核测试是一种比较理想的方法。
目前国内外不少部门已把“微核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面。
二、步骤1.大蒜幼根的培养：提前3～5天进行培养，将大蒜瓣剥去外边膜质枯皮，下端可见许多微微凸起的根原体，将蒜瓣架在烧杯（大小与蒜瓣适宜）口上，杯中盛满清水，使蒜瓣的下部浸入水中，置温暖处，注意每天换水，经3～5天后，即可长出1-2cm的嫩根。
2.处理根尖：阳性检测采用M CrO3，M NaN3，M EMS，对照用自来水处理，处理时间24h。
3.恢复培养：处理后的根尖用自来水浸洗3次，每次2-3min，洗净后在水中恢复培养24h。
4.固定：用甲醛：冰醋酸（3：1）固定液固定24h后弃去固定液，或换入70％酒精中保存。
5.酸解：弃去固定液，用清水漂洗2-3次，吸净水，加入6M盐酸，于室温解离10min，弃去盐酸，漂洗根尖2-3次，彻底洗净盐酸。
6.染色：截下1-2mm长的根尖，滴加石炭酸品红染液，染色10min，加盖玻片，压片观察。
微核测定实验报告
1. 掌握微核检测的基本原理和方法。
2. 了解微核形成的原因及其与遗传毒性的关系。
3. 通过实验，验证不同处理条件下细胞微核率的差异。
二、实验原理微核检测是一种快速、简便的遗传毒性检测方法，主要用于评估化学物质、物理因素等对生物体遗传物质的损伤。
实验原理是：在细胞分裂过程中，染色体发生断裂或畸变，导致染色体片段或整个染色体未能正常分配到子细胞中，形成微核。
通过显微镜观察细胞核形态，计数含微核的细胞数量，计算微核率，从而评估遗传毒性。
三、实验材料1. 细胞培养液2. 细胞培养皿3. 不同处理组的试剂（如溶剂、药物等）4. 显微镜5. 计数板6. 染色剂7. 计数器四、实验方法1. 将细胞培养至对数生长期。
2. 将细胞分为不同处理组，分别加入溶剂、药物等试剂，设置对照组。
3. 在不同处理条件下培养细胞24小时。
4. 收集细胞，用染色剂染色，制片。
5. 在显微镜下观察细胞核形态，计数含微核的细胞数量。
6. 计算微核率，并统计分析各组数据。
1. 对照组微核率：5.0% ± 0.5%2. 溶剂处理组微核率：4.5% ± 0.3%3. 药物处理组微核率：7.5% ± 0.8%六、实验分析1. 对照组微核率较低，说明正常细胞分裂过程中微核形成较少。
2. 溶剂处理组微核率略有下降，可能与溶剂对细胞的轻微损伤有关。
3. 药物处理组微核率明显升高，说明该药物具有一定的遗传毒性。
七、实验结论1. 微核检测是一种快速、简便的遗传毒性检测方法。
2. 本实验结果表明，该药物具有一定的遗传毒性，需要进一步研究其作用机制。
八、实验讨论1. 微核形成的原因可能与染色体断裂、畸变、缺失等因素有关。
2. 微核检测结果受多种因素影响，如实验条件、细胞类型、处理时间等。
3. 在实际应用中，应结合其他遗传毒性检测方法，全面评估物质的遗传毒性。
九、实验改进1. 在实验过程中，可增加实验重复次数，提高实验数据的可靠性。
实验5蚕豆根尖细胞微核检测技术30页PPT
随着分子生物学技术的迅速发展和不断渗透到微核研究中, 使微核试验的检测应用范围不断扩大,现已发展成为能同时检测 染色体断裂、染色体丢失、分裂延迟、不分离、DNA 损伤修复 障碍、Hprt 基因突变、细胞凋亡、细胞分裂不平衡等多种遗传 损害终点 。
自20 世纪70 年代Heddle 和Schmid 利用啮齿类骨髓细胞建 立了微核试验检测方法以来,各国都在不断研究探索微核试验技 术。主要从三个方面来进行:一是探索微核试验的实验技术,即研 究材料、实验方法、给药方式、染毒途径、制片方法、染色方 法等;二是利用微核试验来检测各种致突变物质;三是通过微核试 验来预测疾病。
胞数）
MN‰ 在10‰以下的为基本污染 10‰ - 18 ‰ 区间为轻度污染 18 ‰ - 30 ‰区间为中度污染 30 ‰以上为严重污染 注：每个处理观察3个根尖，每个根尖记数1000个细胞，统计其中 含微核的细胞数然后平均，即为该处理的微核千分率。
2）污染指数（pollution index)
二分体时期微核
➢倒位的细胞学特征： 粗线期倒位圈；后期桥和断片；微核
➢倒位的遗传效应： 改变重组率；基因重排
微核(micronucleus ,MN) 是指位于生物细胞的细胞质中独 立于主核,直径小于主核1/ 20～1/ 3 ,完全与主核分开的圆形或 椭圆形的微小核。它可以是整条染色体,也可以是染色体断片, 染色性与主核一致,其中部分微核具有DNA 复制能力。微核是 由于外界损害因素使染色体发生断裂,细胞进入下一次分裂时, 染色体不能随有丝分裂进入子细胞,而导致染色体丢失或断裂, 从而形成一个或数个小核.
学习蚕豆根尖细胞微核制片与检测技术，了解该技术在诱变作 用检测上的应用。
三 材料 蚕豆根尖（新鲜的固定材料）
〖医学〗人外周血淋巴细胞微核测定
编辑本段明清时期（df肺25s血液f369血小板t5172红 血球gdf55m白 血球fd2）
是中医学理论综合汇编、深化发展，临 床各科 辨证体 系丰富 、提高 阶段。 如明代 楼英的 《医学 纲目》 和王肯 堂的《 证治准 绳》， 清代吴 谦等编 著的《 医宗金 鉴》和 陈梦雷 主编的 《古今 图书集 成·医部 全录》 等。王 清任著 《医林 改错》 ，注重 实证研 究，（ df高血 压958心脏病983u6糖 尿病87fr）纠 正了古 医籍中 关于解 剖知识 的某些 错误， 肯定了 “脑主 思维” ，发展 了瘀血 理论。 温病学 说的形 成和发 展，标 志着中 医理论 的创新 与突破 ，吴有 性著《 温疫论 》，叶 天士著 《温热 病篇》 ，吴鞠 通著《 温病条 辨》等 ，在药 物学研 究方面 ，（45传染病q566丙 肝964jo乙肝28jgs x甲 肝gh）李时珍 著的《 本草纲 目》， 总结了16世纪 以前我 国药物 学研究 的成就 。医的 诊察疾 病能参 考现代 医学的 微观分 析，将 辨证与 辨病相 结合， 实现宏 观与微 观的统 一，使 中医诊 断客观 化，即 把分析 与综合 相结合 的方法 引入中 医理、 法、方 、药的 研究， 使二
人外周血淋巴细胞 微核测定
南华大学预防医学与放射卫生实验教学中心
一、实验目的
掌握人外周血淋巴细胞微核 制备与分析技术
二、实验原理
微核实验是细胞遗传学的一种常用方法。70年代 初由Matter和Schnide建立。
微核是染色体损伤的一种表现形式，它是染色体 的无着丝粒断片或细胞分裂后期未纳入子核的落后 染色体在子细胞细胞质中形成的阳性染色质体。辐 射可引起人外周血淋巴细胞微核率升高，在一定剂 量范围内微核率和剂量成线性关系。该法简便易行。 我国已将微核列为放射病的诊断指标之一。
实验15 微核的诱导和检测
实验15 微核的诱导和检测微核（micronucleus）是染色体畸变的一种表现形式，为有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体片断，在间期细胞的细胞质中形成的一个或多个圆形或杏仁状结构。
微核游离于主核之外，大小在主核的l/3以下。
其折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具有合成DNA 的能力。
一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片产生的，但是已有实验证明，整条染色体或几条染色体也能形成微核。
这些断片或染色体在有丝分裂过程中行动滞后，在分裂末期未能进入主核，便形成了独立于主核之外的核物质块。
当子细胞进入下一次分裂间期时，它们便浓缩形成主核之外的小核，即形成微核。
在环境污染物中存在着许多具有诱变活性的物质，能直接或间接地诱发生物体发生基因突变（mutation）、染色体畸变（chromosome aberration）等细胞遗传损伤，染色体畸变在细胞分裂间期中以微核的形式表现出来，而微核产生的概率又可与诱变因子的剂量呈正比，因此可以用微核出现的频率来评价环境诱变因子对生物的诱变影响。
目前，常用的微核检测技术主要有骨髓微核试验和蚕豆根尖微核试验，可应用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、食品添加剂、环境检测的安全评价及染色体遗传疾病和癌症前期诊断等各个方面。
小鼠骨髓嗜多染红性细胞微核试验：1959年，Evans等人首先提出用微核试验检测细胞遗传损伤，1966年，Schroeder推荐用骨髓微核试验代替相对麻烦费时的骨髓细胞中期染色体畸变试验来研究受试物的有丝分裂毒性（mitotic toxicity）和断裂剂效应（calstogen effect）。
此后，Schmid、Heddle等人在鉴别小鼠骨髓嗜多染性红细胞（Polychromatic erythrocyte，PCE）的基础上建立了哺乳类脊髓微核试验方法，目前已经成为一个相当成熟的标准化体内检测系统。
具体方法为：（1）染毒：在小鼠腹腔注射受试物。
微核检测技术
微核检测技术一、目的1. 了解微核测试原理和毒理遗传学意义。
2. 学习小鼠骨髓细胞和蚕豆根尖的微核测试技术。
二、原理微核（micronucleus, 简称MCN），也叫卫星核，是真核类生物细胞中的一种异常结构，是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。
微核往往是各种理化因子，如辐射、化学药剂对分裂细胞作用而产生的。
在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下。
微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成DNA的能力。
一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片产生的。
有实验证明，整条染色体或几条染色体也能形成微核。
这些断片或染色体在分裂过程中行动滞后，在分裂末期不能进入主核，便形成了主核之外的核块。
当子细胞进入下一次分裂间期时，它们便浓缩成主核之外的小核，即形成了微核。
已经证实，微核率的大小是和作用因子的剂量或辐射累积效应呈正相关，这一点与染色体畸变的情况一样。
所以许多人认为可用简易的周期微核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数。
由于大量新的化合物的合成，原子能的应用，各种各样工业废物的排出等都存在污染环境的可能性，欲了解这些因素对机体潜在的遗传危害，需要有一套高度灵敏，技术简单易行的测试系统来监测环境的变化。
只有真核类的测试系统更能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害，在这方面，微核测试是一种比较理想的方法。
目前国内外不少部门已把微核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、食品添加剂的安全评价，以及染色体遗传疾病和癌症前期诊断等各个方面。
70年代初，Matter和Schmid首先用啮齿类动物骨髓细胞微核率来测定疑有诱变活力的化合物，建立了微核测定法。
此后，微核测定逐渐从动物、人扩展到植物领域。
人和动物的微核测试多用骨髓和外周血细胞，这需要一定的培养条件与时间，细胞同步化困难，微核率低，一般只在0.2%左右。
而植物系统则更直接、更简便。
如采用高等植物花粉孢子利用其天然的同步性作微核测试材料，取得较好效果，其中70年代末Te-Hsiu Ma用一种原产于美洲的鸭跖草（Tradescantia paludosa），建立的四分孢子期微核率计数（MCN-in-tetrad）的测试系统是较好的系统之一。
7,8,9综合实验蚕豆根尖微核检测技术
实验目的
1.了解微核检测的原理和毒理遗传学 2.学习蚕豆根尖微核检测技术
实验原理
微核（micronucleus，MCN）：
是真核生物细胞内遗传物质的一种异常结构
微核率（ MCN ‰）与作用因子的剂量或累积
效应呈正相关
污染指数
实验材料
蚕豆根尖
实验步骤
1、浸种催芽：将实验用蚕豆按需要量放入盛有自来水的杯中，浸 泡24h，此间至少换水两次。种子吸胀后，25℃催芽，置于铺 有湿润滤纸的培养皿中，经36—48h，大部分初生根长至1— 2cm。 2、用被检测溶液处理蚕豆根尖：每一处理选取3-5粒初生根生长 良好的已萌发种子，放入盛有被测的培养皿中，被测液浸没根 尖即可。阳性检测因子可采用CrO3、NaN3、重铬酸钾、EDTA为加 强阳性效果可适当加大溶度，如1.0—2.5mol/L CrO3和0.5— 1.5mol/L NaN3、溶液。另外可取一污水作被检液之一，用自来 水（或蒸馏水）处理作对照。处理根尖12—24h，此时间也可 视试验要求和被检液溶度而定。
实验结果
若进行污水检测，根据污染指数鉴定出你所测水样的污染程 度，也可以计算被检化学药剂的污染指数。 污染指数（PI)=样品实测MCN ‰平均值/对照组（标准水） MCN ‰平均值 污染指数在0.50—1.50区间基本没 有污染； 1.51—2.00区间为轻度污染； 2.01—3.50区间为中度污染； 3.51以上为重度污染。
实验步骤
5、酸解：用蒸馏水浸洗固定好的幼根两次，每次5min，吸净蒸馏 水，加mol/L盐酸将幼根浸没，室温下解离10min至根尖软化。
6、染色：吸去盐酸，用蒸馏水浸没幼根3次，每次1—2min。最后 浸于水中，制片前取出置于载玻片上，截下1—2mm长的根尖，滴 一滴石炭酸品红，染色10min，加一盖玻片，压片观察。
微核检测技术的发展及应用
微核检测技术的发展及应用微核检测技术是一种用于检测微生物种类和数量的技术，其发展与应用在环境监测、食品安全、医疗诊断等领域都有着重要的作用。
随着科学技术的不断进步，微核检测技术也得到了迅猛发展，成为了现代生命科学研究中不可或缺的工具。
微核检测技术最早是在20世纪70年代中期被引入到生命科学中的。
在那个时候，传统的微生物检测方法主要包括培养法和显微镜观察法，这些方法不仅费时费力，而且有很大的局限性。
为了解决这些问题，人们开始寻找一种新的方法来进行快速、准确、敏感的微生物检测。
于是，微核检测技术应运而生。
微核检测技术是一种以核酸提取、扩增、检测为基础的分子生物学方法，具有高度的特异性和灵敏性。
其中最重要的一项技术就是聚合酶链反应（PCR）技术。
PCR技术是一种体外扩增DNA的方法，可以从微生物DNA中快速产生大量的可供检测的DNA片段。
除了PCR技术，还有一些其他的微核检测技术也得到了广泛应用，如即时PCR、实时荧光PCR、核酸杂交等。
在环境监测领域，微核检测技术可以用于水质、空气质量以及土壤污染的监测。
通过监测微生物的种类和数量，可以判断出环境中是否存在污染物，并根据检测结果采取相应的措施进行清理和治理。
此外，微核检测技术还可以用于监测自然环境中的微生物群落变化，从而研究生态系统的稳定性和健康状态。
在食品安全领域，微核检测技术被广泛应用于食品中病原微生物的检测。
通过快速、准确地检测食品中的病原微生物，可以及时发现和解决食品安全问题，保障人民的身体健康。
此外，微核检测技术还可以用于检测食品中的其他微生物，如面筋中的酵母菌、食品中的霉菌等，从而保证食品的质量和卫生安全。
在医疗诊断方面，微核检测技术被广泛用于病原微生物的检测。
通过检测患者体内的微生物，可以快速准确地判断出患者的感染情况，并指导医生选择合适的治疗方案。
此外，微核检测技术还可以用于判断患者的免疫状况，如检测HIV病毒的核酸，从而评估患者的免疫功能和病情。
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以染色体为指标的“三致 效应”的检测方法：
1. 经典的染色体畸变分析方法； 2. 姐妹染色单体互换测试法； 3. 微核测试法。
微核
（1）断片 （2）双着丝点 （3）环
遗传毒理评价所用的材料：
1. 利用植物、昆虫（果蝇）、水生动物等生物的细胞 可以现场监测水源、空气及作业环境中遗传毒物的 存在。为此，发展了紫露草花序、蚕豆根尖、鱼红 细胞遗传毒性试验方法以及Ames（原生动物） 空气现场采样方法等。
由于大量新的化合物的合成、原子能的应用、各种 工业废物的排出，需要有一套高度灵敏、技术简单 的测试系统来监视环境的变化。只有真核生物的测 试结果更能直接推测反映诱变物质对人类或其他高 等生物的遗传危害，微核测试是一种比较理想的方 法。
目前国内外已把微核测试用于辐射损伤、辐射防护、 化学诱变剂、食品添加剂、新药试验、染色体遗传 疾病及癌症前期诊断等各方面。
再见
实验步骤： 根尖的培养
环磷酰胺处理
诱变处理
固定 解离
染色
压片
镜检及观察
实验材料 准备
细胞学鉴定
临时装片 制片
实验材料准备 —— 诱变处理
1. 毛葱沙培生根，室温下2-3天即长出0.5 ~ 1cm长的根；
2. 置于环磷酰胺溶液中处理24小时；
3. 从药液中取出，水洗后清水培养24 小时； 4. 水洗后用Carnoy’s固定液固定24小时，
微核率与用药剂量或辐射积累效应呈正相关。
实验材料：
毛葱（Allium fistulosum）根尖。
实验器材：
显微镜，冰箱，水浴锅，分析天平，剪刀，镊子， 刀片，载玻片，盖玻片，滤纸，量筒，滴瓶，酒精 灯，指管等。
试剂
1. 环磷酰胺（CP） 2. 卡诺氏（Carnoy‘s）固定液 3. 希夫（Schiff‘s）试剂 4. 45%醋酸 5. 1 N盐酸
第二片
第三片
总计
作业和思考题：
1. 叙述微核形成原理。 2. 统计微核细胞数，计算微核细胞千分率。 3. 画出具有微核的细过程中的细胞对不同理化因素的 敏感时期和敏感剂量是不同的，需要进行 试验摸索。
2. 观察与识别微核要准确，统计细胞数至少 200个。
3. 环磷酰胺有毒，使用时要注意。
水洗，转入70%乙醇中保存。
临时装片制片 —— 细胞学鉴定
1. 解离：取70%乙醇中保存的根尖水洗两次，用 1N HCl 在60℃处理根尖8-10min后，水洗 3~4次，每次5min。
2. 染色：根尖在有盖的小瓶中加入希夫（Schiff ） 试剂染色30min~2h。
3. 压片：在干净的载玻片上切下根尖分生区，滴一 滴45%醋酸，加盖玻片，用滤纸吸净多余的液体， 一手压住盖玻片一角，另一手持竹针轻敲盖玻片 至组织呈云雾状。将载玻片在酒精灯上轻烤，在 盖玻片上覆滤纸条，用拇指垂直按压制片。
肿瘤的发生和类型
“三致效应”的检测方法：
早期的方法：用待测化学物质喂饲、注射动物或 涂布在动物皮肤上，然后观查动物是否因此而患 肿瘤或出现畸胎等，可检测各种化学物质的致癌 和在胚胎发育过程中的致畸效应。
现在一般都采用细菌、离体培养的哺乳动物和人 类体细胞、植物为测试对象，主要的方法有：
智能全自动微核分析系统：
法国IMSTAR
本实验的目的：
1. 通过植物根尖微核试验，学习微核的制片 技术、识别及计数方法。
2. 掌握评价理化因子对机体遗传损伤的快速 筛选方法。
实验原理：
微核（micronucleus, MN）是真核生物 细胞中的一种异常结构。由于细胞经辐射或 化学药物等作用使染色体受到损伤，在有丝 分裂中、后期细胞中形成丧失着丝粒的染色 体单体或染色体断片，游离于子细胞质中形 成的次核。在间期细胞中，常常见到比普通 细胞核小很多的一个或几个圆形结构，其直 径大约相当于细胞直径的1/20~1/3。
4. 镜检及观察。
结果及分析：
1. 细胞学观察：
在细胞分裂间期，微 核呈圆形或椭圆形， 游离于主核之外，大 小在主核的1/3以下， 折光率及细胞化学反 应性质和主核一样。
蚕豆根尖微核照片
2.微核率计算
微核率（MCN%o）= 微核数/细胞数×1000%o
片号 第一片
微核检测记录表
细胞数
微核数
微核千分率
2. 动物细胞：小鼠骨髓细胞、外周血淋巴细胞等。
3. 应用多种人类细胞：口腔粘膜细胞、鼻腔粘膜细胞、 头皮毛囊细胞、痰液细胞等检测微核、染色体畸变、 姐妹染色单体互换率等指标，对人类接触遗传毒物 的剂量及效应进行评价。
微核测试法： （micronucleus test, MNT）
20世纪70年代初期由Matter和Schmid 首先建立了一种简便、快速、评价客观地检 测来自环境中的各种理化及生物因子对机体 产生潜在的遗传损伤方法，即用哺乳动物骨 髓嗜多染红细胞微核（polychromatic erythrocyte, PCE）出现率的实验方法。