单分子实时测序
PacBioRS单分子实时测序系统
第三代测序技术
第 X 代
公司
平台名 称
测序 方法
检测方法
大约读长 (碱基数)
ห้องสมุดไป่ตู้
优点
相对局限性
并不能高效地将DNA聚 合酶加到测序阵列中； 准确性一次性达标的机 会低（81-83%）；DNA 聚合酶在阵列中降解； 总体上每个碱基测序成 本高（仪器昂贵）；
第 三 代
太平洋 生物科 学公司
PacBio RS
第 三 代
全基因 组学公 司
GeXP遗 传分析 系统
复合 探针 锚杂 交和 连接 技术
荧光/光 学
10
低读长； 模板制备妨碍 长重复序列区域测序； 样品制备费事；尚无商 业化供应的仪器
第 三 代
Ion 个人基 Torrent/ 因组测 生命技 序仪 术公司 （PGM）
合成 测序 法
以离子敏 感场效应 晶体管检 测pH值 变化
PacBio RS
单分子实时测序系统
报告内容
• 测序技术发展简介 • PacBio RS技术
测序原理 流程和策略 优势
应用
第一代测序方法
第 X 公司 平台名 称 大约读 测序方法 检测方法 长(碱基 优点 相对局限性
代
数)
高读长，准确
第 一 代
ABI/生 命技术 公司
3130xL3730xL
桑格-毛细 管电泳测 序法
荧光/光 学
6001000
度一次性达标 率高，能很好 处理重复序列 和多聚序列 高读长，准确
通量低；样品制备成本高， 使之难以做大量的平行测 序
第 一 代 贝克曼
GeXP遗 传分析 系统
桑格-毛细 管电泳测 序法
单分子实时测序技术的原理与应用
单分子实时测序技术的原理与应用
单分子实时测序技术是一种能够指导未来的转录组学研究和基因组研究方法，它不仅可以解决以往复杂的测序技术和实验设计过程，而且可以提供该领域更为优质的数据。
一、单分子实时测序技术的原理
1、单分子实时测序技术（SMRT）基于质谱，首先在质量控制膜上分离单个碱基，然后谱图记录拆除和襄坚性回收，最后确定其碱基组成。
2、SMRT技术最初由芬兰贝塔公司开发，它采用了基于羟基甲基硫代烯酸（PMA）的环境回收技术，以及“Zero-Mode Waveguides"用于光学技术，它们能实现极其精
细的动态质谱。
3、SMRT技术能够准确识别DNA模版中的碱基，包括但不限于A、T、G、C等，以及带有软铅抑制剂的扩增产物等，这使得它强大的应用于未来的转录组研究及基因组研究。
二、单分子实时测序技术的应用
1、由SMRT技术提供的高信任度的数据，可以大大提高基因组组装的准确性和覆盖度。
2、利用SMRT技术可以提取长的变体分支，能够发现来自特殊物种的SNV和CNV。
3、利用SMRT技术，可以快速发现转录本的复杂半桶结构，从而更好地了解基因调控。
4、这种技术还可以定量不同细胞在细胞周期中的表达分布。
三、相关分析
1、可以利用SMRT技术来优化染色体和组蛋白的测序，使得原本复杂的实验变得更容易操作并且结果更可靠。
2、 SMRT技术还可以延伸至其他学科，比如生物化学和细胞生物学，可用于检测
细胞内的变化，识别复杂的基因调控网络，评价代谢网络和信号转导通路等。
3、此外，SMRT技术可以利用其高精度和深度的特点，开展一系列的生物信息学和生物材料学研究，开发各种生物辅助工具，为生物医学领域的发展提供支持。
基因组测序方法和流程
基因组测序方法和流程基因组测序是一种重要的分子生物学技术，用来确定生物个体的全基因组序列。
下面将介绍几种常见的基因组测序方法和其流程。
Sanger测序方法Sanger测序是最早被广泛应用的测序方法之一。
它通过DNA链终止反应来测定DNA序列。
Sanger测序的流程如下：1. DNA片段的扩增：通过聚合酶链反应(PCR)或其他扩增方法，将待测序的DNA片段扩增。
2. 序列反应：将DNA片段与DNA聚合酶、起始引物和四种特殊的二进制核苷酸（即各种类型的氮碱基）一起反应，使DNA聚合酶在复制DNA过程中停止。
这些停止的位置代表了DNA序列中的不同碱基。
3. 凝胶电泳：将反应产物经过凝胶电泳分离，根据酶在不同位置停止的情况，可以逐个测定DNA序列。
454测序方法454测序是一种高通量测序技术，利用酶依赖法合成技术进行测序。
其流程如下：1. DNA片段的制备：将待测序的DNA片段通过PCR扩增，得到大量的DNA片段。
2. 测序反应：将DNA片段与特殊的引物和酶（即磷酸巯基核苷酸转化酶）一起反应，使每个DNA片段在酶的作用下合成一链自由的DNA。
3. 测序仪读取信号：将反应产物加载至测序仪中，通过光学信号或电信号读取DNA合成时释放的磷酸巯基核苷酸的数目和位置，从而确定DNA序列。
Illumina测序方法Illumina测序是当前最常用的高通量测序技术之一。
其流程如下：1. DNA片段的制备：将待测序的DNA片段通过PCR扩增，得到大量的DNA片段。
2. 测序反应：将DNA片段和两种特殊的引物一起反应，引物与DNA片段的一端连接，形成桥式PCR产物。
然后，引物依次结合并延伸DNA链，生成补充DNA链。
3. 测序仪读取信号：将反应产物加载至测序仪中，通过荧光信号的强度和位置来确定DNA序列。
测序方法是一种基于单分子实时测序技术的测序方法。
其流程如下：1. DNA片段的制备：将待测序的DNA片段通过PCR扩增，得到大量的DNA片段。
三代测序技术的原理
三代测序技术的原理三代测序技术是指通过直接测序DNA或RNA分子，而不需要进行PCR扩增，从而能够更快地获取基因组或转录组的信息。
三代测序技术的原理主要有以下几种：1. 单分子测序原理：这种技术通过将DNA或RNA分子固定在测序平台上，利用荧光信号的变化来识别核酸碱基的顺序。
具体而言，这种技术一般使用一种特殊的引物，将DNA或RNA单分子连接到测序平台上。
接着，通过向样本中供应一种特定的核酸碱基，当该碱基与目标分子的下一个碱基匹配时，就会释放一种荧光信号，可以通过检测这种信号来确定核酸序列。
2. 实时测序原理：这种技术通过监测DNA合成的过程中释放的荧光信号来测序。
具体而言，这种技术使用一种特殊的合成DNA酶，它能够在DNA合成过程中释放荧光信号。
在测序的过程中，使用一个特定的引物和荧光信号强度监测系统，当该引物与待测DNA的下一个碱基匹配时，会释放出荧光信号。
通过监测这种信号的变化，可以获得核酸序列信息。
3. 液相法测序原理：这种技术通过在一种特殊的反应体系中进行DNA合成和检测。
具体来说，这种技术一般使用一种特殊的酶（如聚合酶），它能够在特定的反应条件下使用脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）作为合成DNA的底物。
在反应的过程中，每添加一个核苷酸，就会释放出一种特定的荧光信号。
通过监测这种信号的强度变化，可以获得核酸的序列信息。
总的来说，三代测序技术的原理主要是通过不同的方法来区分和检测DNA或RNA分子的碱基序列，从而实现基因组或转录组的测序。
这些技术相较于传统的第二代测序技术拥有更高的测序速度和更低的成本，已被广泛应用于生物学和医学领域。
单分子测序PacBio技术和应用解决方案
单分子测序PacBio技术和应用解决方案一、技术原理SMRT：single molecular real time SequencingPacBio RS，RS表示Real time Sequencing关键之一：DNA聚合酶基本原理：DNA聚合酶和模板结合，4色荧光标记4种碱基，经过Watson配对后不同的碱基加入，会发出不同光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。
和其他基本测序技术一样，在反应管中进行的是大规模平行的多分子反应，怎样在其中进行单分子反应检测？周围有大量的荧光标记的游离碱基，怎样将反应信号与周围游离碱基的强大荧光背景区别出来？通过一个物理现象解释：ZMW（zero-mode waveguides，零模波导孔）。
例如微波炉壁上可看到有很多密集的小孔。
小孔直径有考究，如果直径大于微波波长，能量就会穿透面板泄露。
如果孔径小于波长，能量不会辐射外部，起保护作用。
在一个反应管（SMRTCell：单分子实时反应孔）中有许多这样的圆形纳米小孔，即ZMW（零模波导孔），外径100多纳米，比检测激光波长小（数百纳米），激光从底部打上去后不能穿透小孔进入上方溶液区，能量被限制在一个小范围（体积20X 10-21L）里，正好足够覆盖需要检测的部分，使得信号仅来自这个小反应区域，孔外过多游离核苷酸单体依然留在黑暗中，将背景降到最低。
单个ZMW底部固定有一个结合了模板DNA的聚合酶，当加入测序反应试剂后，每个碱基配对合成后会发出相应的光并被检测。
一个SMRTCell中有15万个ZMW，每个孔中有一个单分子DNA链在高速合成，如众星闪烁。
原始检测数据的结果，每合成一个碱基即显示为一个脉冲峰，每分钟>100个碱基的速度，配上高分辨率的光学检测系统，就能实时检进行检测。
关键点之二：荧光标记位点。
这是影响测序长度的非常关键的因素。
二代测序都标记在5…端甲基上，在合成过程中，荧光标记物保留在DNA链上，随DNA链的延伸会产生三维空间阻力导致DNA链延长到一定程度后会出现错读。
单分子实时测序在HLA基因分型中的应用初探
单分子实时测序在HLA基因分型中的应用初探储玉霜;肖彦琳;望喆;冯青青;李亭亭;卞茂红【期刊名称】《临床输血与检验》【年(卷),期】2024(26)3【摘要】目的分析单分子实时(SMRT)测序技术判断HLA基因型、单体型的准确性,以探讨该方法应用于临床的可行性。
方法留取19例需行肾移植的患者血液标本,提取DNA后利用SMRT测序技术检测样本基因序列,并利用PCR-SBT方法验证其准确性。
结果 SMRT技术可鉴定出19例样本的HLA基因型和基因单体型,且结果与PCR-SBT方法相符。
1和14号样本PCR-SBT方法的C位点结果存在模棱两可现象,结果为HLA-C*03:02/04;03:03/132,SMRT技术可直接区分,结果为HLA-C*03:02:02,03:03:01。
另外,SMRT方法在1号样本的B位点发现新的HLA 等位基因。
结论 SMRT测序技术应用于HLA高分辨率分型具有高度准确性,在HLA单体型分析具有精准定位多个长间距突变位置的独特优势。
【总页数】7页(P359-365)【作者】储玉霜;肖彦琳;望喆;冯青青;李亭亭;卞茂红【作者单位】安徽医科大学第一附属医院输血科;江苏省泰州市泰兴人民医院检验科【正文语种】中文【中图分类】R44【相关文献】1.应用单管PCR扩增测序分型法分析成都汉族HLA-DRB1基因多态性2.神经纤维瘤病Ⅰ型患者HLA-DRB1位点等位基因的测序分型3.AllType NGS11位点测序试剂在HLA-DPB1基因分型中的模棱两可结果分析4.南方汉族人群HLA-E基因测序分型及其分子遗传多态性研究5.纳米孔基因测序技术在HLA基因分型中的应用因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
pacbio测序类型
pacbio测序类型
PacBio 测序是一种基于单分子实时测序（Single Molecule Real Time, SMRT）技术的测序方法，它可以对长片段的 DNA 进行高精度的测序。
PacBio 测序的主要特点包括：
1. 长读长：PacBio 测序可以产生长达几十到几百 kb 的读长，这比传统的二代测序技术（如 Illumina）长得多。
长读长有助于解决基因组组装中的难题，如重复序列、高 GC 区域等。
2. 高精度：PacBio 测序的精度可以达到 99.9%以上，这比传统的二代测序技术高得多。
高精度有助于提高基因组组装的质量，以及发现基因组中的变异和基因表达等信息。
3. 直接测序：PacBio 测序是一种直接测序技术，它不需要进行 PCR 扩增或其他预处理步骤，可以直接对 DNA 分子进行测序。
这有助于减少测序误差和偏差，提高测序的准确性和可靠性。
4. 实时测序：PacBio 测序是一种实时测序技术，它可以在测序过程中实时监测每个DNA 分子的测序情况，并及时调整测序参数，以提高测序的质量和效率。
总的来说，PacBio 测序是一种高精度、长读长、直接测序的测序方法，它在基因组组装、基因表达分析、变异检测等领域有着广泛的应用前景。
单分子实时测序技术的原理与应用
单分子实时测序技术的原理与应用最近几年，随着科学技术的发展，单分子实时测序技术（即SMRT 技术）已经被大量的研究者用于对生物序列的分析和修饰。
这一技术可以提供完整的、可靠的分子信息，从而为后续的研究提供重要的科学依据。
本文将交代SMRT技术的原理，并介绍它在抗生素耐药性、突变检测和药物研发等方面的应用。
首先，SMRT技术是基于单分子实时分子测序（SMRT）技术，SMRT 技术可以用于精确定位和解析单个DNA分子。
SMRT技术主要是通过三个步骤完成：（1）建立 DNA子芯片（2）识别及测序每个目标DNA 分子（3）识别DNA片段的碱基序列。
大多数的SMRT技术使用的测序装置包括：（1）光循环检测仪：主要功能是检测DNA分子上特定碱基的亮度变化，从而定位和识别（2）DNA改造机制：主要功能是将DNA 分子上的目标碱基改造为可被检测的碱基。
SMRT技术在抗生素耐药性方面的应用是一个重要的范例，可以使用SMRT技术将抗生素耐药机制的基因变异发现出来。
如抗菌肽基因抗性，可以通过SMRT技术来发现抗菌肽基因的突变和变异，从而揭示抗生素耐药性的根本原因。
此外，SMRT技术还可以用于抗药肽颗粒的构建，以不同的方式抑制抗生素耐药性并克服抗药性，这对研制更有效的、经济实惠的抗感染药物具有重要的意义。
此外，SMRT技术在突变检测方面也具有重要的意义。
可以用SMRT 技术对DNA分子的结构和功能的变异进行检测，可以精准的定位和识别DNA分子中的特定多聚体，从而发现不同的肿瘤细胞中特定基因的多态性变化，这有助于更好的了解肿瘤发病机制，有助于指导抗肿瘤治疗。
最后，SMRT技术也在药物研发方面发挥了重要作用。
SMRT技术可以对抗癌新药以及抗感染新药的药效作用发生机制进行分析，可以发现有药效的DNA序列，可以更快地发现潜在的新药物，以及给出合理的物种发现和药效分析。
在精准医学的指导下，SMRT技术可以使药物发现的更加精准有效地实现，有助于研发出更好的药物，更精准地治疗临床疾病。
第三代测序技术介绍
第三代测序技术介绍目前，主要的第三代测序技术包括单分子测序技术和纳米孔测序技术。
单分子测序技术是指将DNA样本直接读取成单个分子的测序技术。
这种技术的一个典型代表是PacBio Single Molecule Real-Time（SMRT）测序技术。
这种技术基于真核生物DNA聚合酶的特点，通过监测单个DNA分子的合成过程来实现测序。
在PacBio SMRT测序技术中，DNA分子被固定在悬浮在荧光物质中的微小光子学平台上，随着DNA合成的进行，DNA聚合酶会释放出光子，从而可以实时监测到DNA的合成过程。
这种技术能够实现长读取长度和高保真度，具有快速、高效、高通量的特点，被广泛应用于基因组学、转录组学等研究领域。
纳米孔测序技术是指通过将DNA样本引导通过一个纳米孔，并通过监测DNA分子在纳米孔中电信号的变化来实现测序的技术。
这种技术的一个代表是Oxford Nanopore Technologies（ONT）的MinION测序技术。
在MinION测序技术中，DNA样本通过纳米孔时，会引起电信号的变化，这种变化可以被转化成测序信息进行读取。
这种技术具有实时、长读取长度、低成本的特点，可以在实验室和户外等多种场合进行测序，被广泛应用于移动基因组学、环境监测等领域。
第三代测序技术的出现极大地推动了基因组学、转录组学等研究领域的发展。
它们不仅提高了测序的速度和准确性，还降低了测序的成本，使得大规模基因组和转录组的测序成为可能。
在人类基因组计划中，第三代测序技术被广泛应用于完成全基因组的测序任务，为研究人类基因组提供了重要的数据资源。
同时，第三代测序技术也被广泛应用于微生物学、农业科学、生物多样性研究等领域，为相关研究提供了有力的支持。
然而，尽管第三代测序技术在测序速度和准确性上有了巨大的进步，但其仍然存在一些挑战和限制。
比如，第三代测序技术在读取长度和错误率等方面仍有改进的空间，同时对于复杂的基因结构和重复序列的测序仍然存在困难。
简述三个测序的原理及应用
简述三个测序的原理及应用1. Sanger测序原理Sanger测序是一种传统的测序技术，由Frederick Sanger于1977年发明。
该技术利用DNA链延伸过程中使用到的反应终止剂，通过识别终止剂的顺序确定DNA序列。
具体流程如下： 1. DNA样本被分离成两条单链。
2. 在PCR反应中，引入少量的dideoxynucleotide（ddNTP），由于ddNTP缺少3’-OH基团，会在DNA延伸的过程中停止反应。
3. PCR反应产生不同长度的DNA片段。
4. 利用聚丙烯酰胺凝胶电泳，按照片段大小进行分离。
5. 通过荧光标记的引物与片段反应，获取每个片段的序列。
应用Sanger测序在过去几十年中大量应用于DNA测序的研究和基因组学项目。
其应用包括但不限于： - 基因组测序：用于测定生物个体的基因组序列，从而研究遗传背后的相关机制。
- Sanger测序是疾病基因检测的核心技术之一，可以用于检测各种遗传性疾病和突变。
- 通过Sanger测序确定细菌、病毒等微生物的基因组序列。
2. Illumina测序原理Illumina测序（又称为高通量测序）是一种广泛使用的测序技术，由Illumina 公司开发。
该技术基于桥接PCR扩增和荧光标记的碱基识别。
具体流程如下： 1. DNA样本被分离成两条单链，在适当的条件下与适配体结合。
2. 在PCR反应中，适配体结合的DNA片段扩增形成cluster，每个cluster包含数百万个相同序列的DNA片段。
3. 在测序过程中，引入荧光标记的碱基，然后利用激光进行激发和检测。
4. 激光读取荧光信号，记录每个碱基的识别结果。
5. 通过多个循环的重复，读取DNA片段的序列。
应用Illumina测序广泛应用于基因组学、转录组学和表观遗传学等研究领域。
其应用包括但不限于： - 基因组测序：用于生物个体的全基因组测序，从而研究个体之间的遗传差异。
- 转录组测序：用于测定特定时期或特定条件下生物体内所有转录过程的基因表达情况。
三代测序原理和流程
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sbb和sbs测序技术原理
sbb和sbs测序技术原理SBB和SBS是两种常见的测序技术，它们分别代表着单分子实时测序（Single Molecule Real-Time Sequencing）和同步引物加性测序（Synchronous Primer Extension Sequencing）的缩写。
这两种技术在DNA测序领域有着广泛的应用，可以高效准确地获取DNA的序列信息。
以下是对SBB和SBS测序技术原理的详细介绍。
SBB测序技术（Single Molecule Real-Time Sequencing，SMRT）是由PacBio公司于2011年推出的一种单分子实时测序技术。
其原理基于DNA聚合酶的工作方式，通过观察DNA聚合酶对DNA模板进行链延伸的过程来实现单分子的DNA测序。
SBB测序技术主要包括DNA合成、荧光检测和数据分析三个步骤。
首先，在SBB测序技术中，DNA样本经过初始处理后被构建成一个圆形的单分子DNA模板，然后与DNA聚合酶和引物结合。
DNA聚合酶会根据引物的序列信息进行DNA链的合成，合成过程中聚合酶会释放一个荧光标记的核苷酸。
这个荧光标记可以通过激光束进行激发，激发后的荧光标记会发出荧光信号。
其次，在荧光检测环节，SBB测序技术使用高速摄像机捕获DNA聚合酶合成DNA链的过程，通过观察聚合酶释放荧光标记的时间来确定合成的核苷酸。
由于核苷酸的合成速度和酶活性不同，不同的核苷酸可以通过荧光信号的强度和时间来区分。
这种实时检测的方式使得SBB 测序技术能够实现快速高效的DNA测序。
最后，在数据分析的过程中，通过分析荧光信号的时间和强度来确定每个荧光标记所对应的核苷酸，并重复这个过程直到整个模板的DNA链被合成完毕。
通过将这些核苷酸的序列信息组合起来，就可以得到该DNA模板的完整序列。
由于SBB测序技术是实时测序，不需要进行后续的PCR扩增等步骤，从而避免了PCR引入的偏差和错误。
相比之下，SBS测序技术（Synchronous Primer Extension Sequencing）是由Illumina公司于2006年开始商业化的一种高通量测序技术。
目前dna测序技术的种类和原理
目前dna测序技术的种类和原理DNA测序技术是指通过对DNA序列进行分析和解读，以了解DNA分子的组成、结构和功能。
随着科学技术的不断发展，目前已经出现了多种不同的DNA测序技术。
以下是其中的几种技术及其原理：1. Sanger测序技术Sanger测序技术是一种最早被广泛应用的DNA测序技术。
其原理是利用DNA聚合酶和DNA核酸酶，将DNA单链逐个扩增成双链，并在每个反应体系中加入一种ddNTP，这种ddNTP会取代普通的dNTP进入DNA链，导致DNA链的终止。
在反应结束后，用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出不同长度的DNA链，通过分析这些DNA链的长度就可以确定DNA的序列。
2. Illumina测序技术Illumina测序技术是一种高通量、快速的测序技术。
其原理是将DNA片段通过PCR扩增成成百万甚至数亿个同一长度的DNA片段，然后将这些片段用碱性化学方法进行固定，接着在根据DNA序列逐一加入碱基，每加入一个碱基就记录下来。
一旦所有的碱基都加入完毕，就可以得到DNA的完整序列。
3. PacBio测序技术PacBio测序技术是一种基于单分子实时测序的技术。
其原理是将DNA分子通过引物和DNA聚合酶逐一扩增成双链，然后将DNA分子引入到一个微小的孔道中，引入后DNA分子会被拉伸成一个线性结构，并利用荧光标记的DNA聚合酶对其进行逐一扩增。
在扩增的过程中，荧光标记的碱基被逐一加入，每加入一个碱基就会发出一个荧光信号。
通过监测这些信号的强度和时间，就可以得到DNA分子的序列信息。
4. Nanopore测序技术Nanopore测序技术是一种利用纳米孔测序的技术。
其原理是将DNA分子通过引物和DNA聚合酶逐一扩增成双链，然后将DNA分子引入到一个纳米孔中，孔径大小与DNA分子的直径相似。
当DNA分子通过孔道时，通过测量DNA分子对孔道的电阻变化，就可以确定DNA的序列信息。
综上所述，DNA测序技术的种类和原理多种多样，每种技术都有其独特的优势和适用范围。
全基因组重测序方法
全基因组重测序（Whole Genome Sequencing，WGS）是一种高通量测序技术，用于获取一个个体的完整基因组序列信息。
全基因组重测序方法可以揭示个体的遗传变异、基因组结构和功能等方面的信息，对于研究遗传疾病、人类进化、种群遗传学以及农业和生物多样性等领域具有重要的意义。
以下是几种常见的全基因组重测序方法：
1. Sanger测序：虽然现在已不常用于全基因组重测序，但Sanger测序是第一种用于测序基因组的方法。
该方法通过DNA链延伸的方式，使用特殊的标记测定碱基序列。
2. Illumina测序：Illumina测序是目前最常用的全基因组重测序方法之一。
它基于DNA文库的构建，将DNA片段连接到测序芯片上的特定DNA序列上。
然后，通过化学反应和光学信号检测，测定每个DNA 片段的碱基序列。
3. PacBio测序：PacBio测序利用第三代DNA测序技术，采用单分子实时测序（Single Molecule Real-Time Sequencing）原理。
它通过监测DNA聚合酶在DNA模板上的合成过程，实时测定碱基的加入顺序。
4. Oxford Nanopore测序：Oxford Nanopore测序也是第三代DNA 测序技术，基于纳米孔电流测序原理。
DNA片段通过纳米孔时，测量的电流变化与碱基序列有关，从而实现测序。
这些全基因组重测序方法各有优缺点，如测序精度、读长、覆盖度、成本等方面存在差异。
研究人员和实验室选择具体的方法通常取
决于他们的研究目标、预算以及可用的技术设备。
单分子测序技术
单分子测序技术随着分子生物学的快速发展，肿瘤基因及病原微生物基因测序等技术已成为现代临床诊疗的重要辅助手段。
•一代基因测序开启了 DNA 测序的序章，但其价格昂贵、测序速度慢限制了其在多样本大规模测序项目上的使用。
•二代测序的测序通量高且测序成本较低，但文库构建复杂繁琐、测序读长短、序列分析时间长。
为了更加精确高效地挖掘 DNA 信息，科研人员开发出第三代测序技术，即单分子测序（single molecule sequencing）技术。
这项技术与前两代技术不同的是测序时不需要进行 PCR 扩增，而是基于单分子的电信号或化学反应信号检测，实现了对每一条 DNA 分子的单独测序。
单分子测序技术简介单分子测序技术的特点1、较长的测序读长：单分子测序技术利用碱基穿过纳米孔时电信号的改变实现测序，原则上可检测通过纳米孔的全部核酸序列，因此对测序长度没有限制，目前最长读长可达 2.4 M。
2、可实时测序：测序文库制备过程简单，无需对样品中核酸进行 PCR 扩增或逆转录，可以直接对 DNA 或 RNA 进行测序；可边测序边输出结果，能够实现对测序数据的实时分析。
3、纳米孔测序设备简单便携：目前使用最成熟的 MinION 测序仪可在极地、海洋甚至太空等各种复杂环境下完成实时测序，可保证对突发疫情处理的时效性。
4、可直接对 RNA 进行测序：纳米孔测序可以直接对各类形式的 RNA 进行测序，能避免目前对 RNA 病毒进行测序和研究时必须将 RNA 逆转录为 DNA 扩增所产生的偏向性及可能引入的突变。
单分子测序技术的临床应用在癌症检测方面，单分子测序技术适用于阐明等位基因突变状态和复杂癌症基因组的完整结构，这可能将为我们提供癌症分子分型新标准，指导临床个体化治疗。
在检测大型基因组变异方面，单分子测序技术优势明显。
SV 为 > 1 kb 的大型基因组变异，如大片段的插入缺失、倒位和重复，或染色体重排，如易位。
DNA测序方法
DNA测序方法DNA测序是指通过分析DNA序列中的碱基信息来确定DNA序列的技术。
DNA测序方法的发展使得科学家们可以更加深入地了解生物的基因组构成以及基因之间的相互作用。
本文将介绍几种常见的DNA 测序方法。
Sanger测序法Sanger测序法是一种经典的DNA测序方法，也被称为链终止法。
该方法利用了DNA复制的一种特殊性质：在DNA复制时，加入了特殊的链终止核苷酸，使得复制过程在该核苷酸处中断。
通过在每个终止核苷酸中标记一种不同的染料，可以将不同长度的DNA片段分开，并通过电泳方法测量标记染料的信号强度，从而确定DNA序列。
近年来，Sanger测序法已经被新一代测序技术所取代，并且在高通量测序中已较少被使用。
然而，由于其准确性和可靠性的特点，Sanger 测序法仍然应用于小规模的DNA测序实验和特定的研究领域。
新一代测序技术新一代测序技术，也称为高通量测序技术，是在过去十年中迅速发展起来的一类DNA测序方法。
相比于传统的Sanger测序法，新一代测序技术的最大优势在于可以同时进行大量样本的高通量测序，大大提高了测序效率和降低了成本。
常见的新一代测序技术包括454测序、Illumina测序和Ion Torrent 测序。
这些技术都基于不同的原理，但本质上都涉及将DNA样本进行多次扩增，并利用荧光标记和高通量测序仪器进行碱基测定。
将这些碱基信号进行计算和处理后，就可以得到原始的DNA序列信息。
新一代测序技术的应用广泛，不仅用于基因组学研究，还应用于生物学、医学、农业等领域。
通过对DNA序列的深入研究和分析，科学家们可以揭示遗传信息在生物体内的作用机制，加深对生命科学的认识。
单分子测序技术除了新一代测序技术，近年来还出现了单分子测序技术，也被称为第三代测序技术。
与传统的扩增和测序方法不同，单分子测序技术通过直接读取单个DNA分子来进行测序。
这种技术大大减少了测序试剂的使用量和测序时间，并提高了测序的准确性。
基因测序技术在肿瘤早期筛查中的应用
基因测序技术在肿瘤早期筛查中的应用概述肿瘤早期筛查是一种重要的方法，可帮助提前发现肿瘤，并为治疗提供更好的机会。
而基因测序技术作为一种高效、准确的分析方法，已经广泛应用于肿瘤早期筛查中。
本文将讨论基因测序技术在肿瘤早期筛查中的应用，并探讨其在诊断和治疗方面的优势。
I. 基因测序技术的原理基因测序技术是通过对DNA或RNA样本进行测序，以获取个体遗传信息的工具。
主要有三种常见的方法：Sanger测序、第二代测序（如Illumina等）和第三代单分子实时测序（如PacBio等）。
这些技术可以精确读取DNA或RNA上不同碱基的顺序，并生成大量数据供进一步分析使用。
II. 基因测序在肿瘤早期筛查中的应用A. 检测癌相关突变通过对肿瘤组织或体液样本进行基因测序，可以检测到与癌症相关的突变。
肿瘤细胞中的突变体现为不同于正常细胞的DNA序列变化，这对于早期筛查和确诊具有重要意义。
例如，某些特定基因突变在多种癌症类型中都存在，如TP53、KRAS等。
基因测序技术可以准确检测这些突变，并作为肿瘤早期筛查的有力工具。
B. 检测其它影响癌症发生风险的遗传因素除了突变外，遗传因素也与个体患癌风险密切相关。
某些人群携带一些特定遗传突变会增加罹患肿瘤的概率，如BRCA1、BRCA2等基因突变与乳腺和卵巢癌密切相关。
通过基因测序技术，可检测这些遗传突变并对高风险个体进行有效筛查和预防。
C. 评估药物治疗指导对于已确诊肿瘤的个体，药物治疗选项是必要考虑的问题之一。
而且，在个别情况下，由于特定基因突变引起的遗传异常可能导致特定药物的不敏感性，或者某些药物的副作用较为严重。
基因测序技术可以帮助评估患者对不同药物的反应和耐受性，并指导医生制定更加个体化的治疗方案。
III. 基因测序技术在肿瘤早期筛查中的优势A. 高灵敏度和高特异性基因测序技术具有非常高的灵敏度和特异性，能够准确检测到低水平突变并排除伪阳性结果。
这对于肿瘤早期筛查尤其重要，因为早期肿瘤往往仅有少量癌细胞存在。
第三代测序技术(单分子实时DNA测序)与第二代测序技术(高通量测序技术)简介
第三代测序技术（单分子实时DNA测序）与第二代测序技术（高通量测序技术）简介第三代测序技术(单分子实时DNA测序)与第二代测序技术(高通量测序技术)简介第三代测序技术简介如果有人告诉你用显微镜实时观测单分子DNA聚合酶复制DNA，并用它来测序，你一定会认为他异想天开，没有一点生物的sense。
我最初就是这样认为的，然而它不仅可以实现，而且已经实现了～这个就是被称为第三代的测序技术，Pacific Biosciences公司推出的“Single Molecule Real Time(SMRT) DNA Sequencing”(单分子实时DNA测序)。
我有幸在NIH听到了这个技术发明人Stephen Turner博士的讲座，根据自己粗浅的理解记录整理一下。
要实现单分子实时测序，有三个关键的技术。
第一个是荧光标记的脱氧核苷酸。
显微镜现在再厉害，也不可能真的实时看到“单分子”。
但是它可以实时记录荧光的强度变化。
当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。
当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。
这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。
第二个是纳米微孔。
因为在显微镜实时记录DNA链上的荧光的时候，DNA链周围的众多的荧光标记的脱氧核苷酸形成了非常强大的荧光背景。
这种强大的荧光背景使单分子的荧光探测成为不可能。
Pacific Biosciences公司发明了一种直径只有几十纳米的纳米孔[zero-mode waveguides (ZMWs)]，单分子的DNA聚合酶被固定在这个孔内。
在这么小的孔内，DNA链周围的荧光标记的脱氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G这四种荧光标记的脱氧核苷酸非常快速地从外面进入到孔内又出去，它们形成了非常稳定的背景荧光信号。
而当某一种荧光标记的脱氧核苷酸被掺入到DNA链时，这种特定颜色的荧光会持续一小段时间，直到新的化学键形成，荧光基团被DNA聚合酶切除为止(见图)。
三代测序的原理
三代测序的原理三代测序是一种新型的高通量测序技术，它可以在较短时间内获得大量的 DNA 测序数据，为基因组研究、单细胞基因组学等领域提供了更为高效的方法和手段。
三代测序技术相比于传统的二代测序技术，在测序长度、测序速度等方面都具有明显的优势，因此备受关注。
那么，什么是三代测序？它的原理是什么？三代测序技术包括单分子测序技术、纳米孔测序技术等，这些技术都是基于不同的原理而发展的。
下面我们就一些常见的三代测序技术原理进行详细介绍。
一、单分子测序技术单分子测序技术，顾名思义，就是在一个分子的层面上进行 DNA 测序，这种技术可以突破传统二代测序技术中 DNA 放大和分离纯化等阶段的限制，避免了因 PCR 反应带来的测序误差，并可以直接测序双链 DNA 分子。
单分子测序技术主要有实时荧光测序技术和化学测序技术两种。
1. 实时荧光测序技术实时荧光测序技术是通过 DNA 上特异序列受体，与荧光信号的转导机制相结合来实现的测序技术。
这种技术可以检测位于 DNA 测序反应过程中的碱基，并通过光学探测来连续监测测序结果。
实时荧光测序技术的基本原理是在每一轮的 DNA 合成中加入荧光标记基团，然后通过不断检测从而读出 DNA 序列信息。
2. 化学测序技术化学测序技术是将 DNA 去除荧光标记基团后，采用荧光探针进行信号监测，从而得出碱基序列信息的一种测序技术。
先在反应过程中加入一个被称为“保护基覆盖”的基团，然后进行荧光信号检测，得出结果后再将前面添加的保护基覆盖去掉，继续进行下一轮检测，直到完成整个 DNA 序列的测定。
单分子测序技术擅长于检测低复杂度序列（如 GC/AT 重复序列）、基因组结构变异等重要问题，可以应用在很多领域，如生物医学、生物环境以及生物信息学等领域。
二、纳米孔测序技术纳米孔测序技术是利用纳米孔对单个 DNA 分子进行测序的技术，它是一种界面控制技术，主要包括固体纳米孔、液态纳米孔和气态纳米孔等。
ont ultra-long 测序原理
ont ultra-long 测序原理"Ultralong" 测序原理指的是一种具有极高测序读长的基因组测序技术。
这种技术能够获得单个DNA分子的完整测序信息，包括基因组中的长片段序列。
传统的测序方法往往只能获得较短的读长，需要将基因组片段进行分割和重组，然后通过组装算法还原原始序列。
在“Ultralong”测序原理中，通常会使用一些新兴的测序技术，如单分子实时测序（Single Molecule Real-Time Sequencing，SMRT）、纳米孔测序（Nanopore Sequencing）等。
这些技术的特点是可以直接读取单个DNA分子的完整序列，避免了分割和重组的过程，大大提高了测序的读长。
在SMRT测序中，DNA片段首先被连接到一个聚合酶酶模板上，形成一个DNA 聚合酶复合物。
然后，在引入荧光标记的dNTPs的同时，通过激光照射激发荧光信号，并对荧光信号进行实时监测。
荧光信号的变化可以直接反映出DNA链的延伸和序列信息。
Nanopore 测序则利用通过纳米孔的电流变化来推断DNA序列。
DNA片段被引入纳米孔，而电流通过纳米孔时会因为核苷酸的特性而发生变化。
通过分析电流信号的变化模式，可以推断出DNA的序列信息。
这些“Ultralong”测序原理的发展，使得可以直接获得更大片段的基因组序列，从而提供了更全面和详细的基因组信息，有助于研究基因组结构与功能的关系，
以及解析相关疾病的发生机制。
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单分子测序原理
利用DNA 聚合酶合成与模板互补的DNA 链, 在三围空间中记录模板位置和核苷酸序列信息, 再反向构建DNA 模板的序列。
除了DNA 合成反应的三大要素(模板、酶、核苷酸)之外, 模板所处位置和反应循环中单色荧光标记的核苷酸顺序(如A、C、G、T )也是最终DNA序列能够完成的关键要素。
如果反应所用的核苷酸标记着四种不同的荧光, 则每一次反应循环就需要切换不同波长的光以记录不同的碱基。
单分子测序平台介绍
1．并行单分子合成测序技术
Helicos Biosciences 是第一个设计开发单分子测序方法( tSMSTM) 技术平台的公司，其基础主要来自于Braslavsky 等人的研究。
主要是利用合成测序理论，测序时首先将待测序列打断成小片段并在3'末端加上polyA ，并用末端转移酶阻断，同时在玻璃芯片上随机固定多个polyT 引物( 其末端皆带有荧光标记) ，将小片段DNA 模板与检测芯片上的polyT 引物进行杂交并精确定位，通过成像来精确定位杂交模板所处的位置，建立边合成边测序的位点; 逐一加入荧光标记的单色末端终止子及聚合酶的混合液孵育，洗涤，利用全内反射显微镜( total internal reflection microscopy，TIRM)进行单色成像，之后切开荧光染料和抑制基团，洗涤，加帽，允许下一个核苷酸的掺入。
通过掺入、检测和切除的反复循环，就可以实现实时测序。
由于该技术采用了Cy5 ( 吲哚-5-菁) 荧光基团具有很好的光稳定性、高水溶性和高荧光效率，激发波长在647nm 处) 和灵敏的监测系统，能够直接记录到单个碱基的荧光，从而克服了其他方法须同时测数千个相同基因片段以增加信号亮度的缺陷。
2．单分子实时合成测序技术
SMRT 技术是基于边合成边测序的思想，以SMRT芯片为载体进行测序反应。
SMRT 芯片是一
种带有很多零模式波导孔( zero-mode waveguides，ZMW) ( 厚度为100 nm) 的金属片，ZMW 是一种直径只有几十个纳米的孔，由于其底部上的小孔短于激光的单个波长，导致激光无法直接穿过小孔，而会在小孔处发生光的衍射，形成局部发光的区域，即为荧光信号检测区，该区域内锚定有DNA 聚合酶。
测序时将基因组的DNA 打断成许多小的片段，制成液滴后将其分散到不同的ZMW 纳米孔中。
当ZMW 孔底部聚合反应发生时，被不同荧光标记的核苷酸会在小孔
的荧光探测区域中被聚合酶滞留数十毫秒，荧光标记会在激光束( Excitation) 的激发下发出荧光，根据荧光的种类就可以判定dNTP 的种类，反应完成后荧光标记会被聚合酶切除而弥散出ZMW 小孔，其它未参与合成的dNTP 由于没进入荧光信号检测区而不进入荧光信号检测区。
SMRT 测序时，样品准备过程涉及到样品DNA 的打断、末端补齐、连接接头、测序这几个步骤。
测序中需要的样品量很少，样品准备中所用的试剂也很少，而且测序过程中省去扫描和洗涤的过程，所以测序所花的时间较少。
3．纳米孔单分子技术
Oxford Nanopore Technologies 公司研发的测序技术完全不同于前两种测序技术，其核心就是将在某一面上含有一对电极的特殊的脂质双分子层置于一个微孔之上，该双分子层中含有很多由α溶血素蛋白组成的纳米孔中结合一个核酸外切酶。
当DNA 模板进入孔道时，孔道中的核酸外切酶会“抓住”DNA 分子，顺序剪切掉穿过纳米孔道的DNA碱基，每一个碱基通过纳米
孔时都会产生一个阻断，根据阻断电流的变化就能检测出相应碱基的种类，最终得出DNA 分子的序列。
纳米孔单分子测序技术的一大优势就是仪器构造简单使用成本低廉; 因为它不需要对
核苷酸进行标记，也不需要复杂的光学探测系统( 如激光发射器和CCD信号采集系统等) ，能
直接对RNA 分子进行测序。
同时由于它是直接检测每一个碱基的特征性电流，因而能对修饰过的碱基进行测序，这一点对于表观遗传学研究具有极高的价值; 缺点就是它采用的是水解测序法，不能进行重复测序，因而无法达到一个满意的测序精确度。
单分子测序技术的应用
由于单分子测序具有通量更高，仪器和试剂相对便宜、操作简单等的优势而比第二代测序技术有更广阔的应用空间。
1 基因组测序
由于具有读长长的特点，SMRT 测序平台在基因组测序中能降低测序后的Contig 数量，明显减少后续的基因组拼接和注释的工作量，节省大量的时间。
Christophern 等仅仅用0．5 ×的PacBio RS 系统长度的数据与38 ×的二代测序( NGS) 的测序数据，对马达加斯加的一种指猴基因组进行拼装，大幅度提高了数据的质量和完整度，同时借助Pacbio RS 的帮助将原有的Contig 数量减少了10 倍。
David A．等利用PacBioRS 平台和C2 试剂通过全球合作几天内就完成了从德国大肠杆菌疫情中获得的大肠杆菌样品以及近似菌株的测序和数据分析，最终获得了2 900bp 的平均读长以及99．998% 的一致性准确度。
在对霍乱病菌的研究中，第三代测序技术已初现锋芒。
研究人员对5 株霍乱菌株的基因组进行了测序研究，并与其他23 株霍乱弧菌的基因组进行对比。
结果发现海地霍乱菌株与2002 年和2008 年在孟加拉国分离得到的变异霍乱弧菌El Tor O1 菌株之间关系密切，而与1991 年拉丁美洲霍乱分离株的关系较远。
相对NGS 的优势就是能更快获得结果，因此该系统在鉴定新的病原体和细菌的基因组测序方面得到很广泛的应用。
天津生物芯片公司成功地引进了PacBio RS II测序平台，并与二代测序平台相结合，建立了细菌基因组完成图测序新策略，可以更好地致力于细菌基因组学研究！
2．甲基化研究
SMRT 技术采用的是对DNA 聚合酶的工作状态进行实时监测的方法，聚合酶合成每一个碱基，都有一个时间段，而当模板碱基带有修饰时，聚合酶会慢下来，使带有修饰的碱基两个相邻的脉冲峰之间的距离和参考序列的距离之间的比值如果大于1，由此就可以推断这个位置有修饰。
甲基化研究中关于5-mC 和5-hmC( 5-mC 的羟基化形式) 是甲基化研究中的热点。
但现有的测序方法无法区分5-mC 和5-hmC。
美国芝加哥大学利用SMRT 测序技术和5-hmC 的选择性化学标记方法来高通量检测5-hmC。
通过聚合酶动力学提供的信息，可直接检测到DNA 甲基化，包括N6-甲基腺嘌呤、5-mC 和5-hmC，为表观遗传学研究打开了一条通路。
3．突变鉴定( SNP 检测)
单分子测序的分辨率具有不可比拟的优势，而且没有PCR 扩增步骤，就没有扩增引入的碱基错误，该优势使其在特定序列的SNP 检测，稀有突变及其频率测定中大显身手。
例如在医学研究中，对于FLT3 基因是否是急性髓细胞白血病( AML) 的有效治疗靶标一直存在质疑。
研究人员用单分子测序分析耐药性患者基因，意外发现耐药性与FLT3 基因下游出现的稀有新突变有关，重新证明了FLT3 基因是这种最常见白血病—急性髓细胞白血病( AML) 的有效治疗靶标，打破了一直以来对于这一基因靶标的疑惑。
凭借PacBio 平均3 000bp的读长，获得了更多基因下游的宝贵信息，而基于单核酸分子的测序能够检测到低频率( 低至1%) 罕见突变，正是这项成果的关键所在。