PacBio RS II第三代单分子实时测序
PacBioRS单分子实时测序系统
第三代测序技术
第 X 代
公司
平台名 称
测序 方法
检测方法
大约读长 (碱基数)
ห้องสมุดไป่ตู้
优点
相对局限性
并不能高效地将DNA聚 合酶加到测序阵列中； 准确性一次性达标的机 会低（81-83%）；DNA 聚合酶在阵列中降解； 总体上每个碱基测序成 本高（仪器昂贵）；
第 三 代
太平洋 生物科 学公司
PacBio RS
第 三 代
全基因 组学公 司
GeXP遗 传分析 系统
复合 探针 锚杂 交和 连接 技术
荧光/光 学
10
低读长； 模板制备妨碍 长重复序列区域测序； 样品制备费事；尚无商 业化供应的仪器
第 三 代
Ion 个人基 Torrent/ 因组测 生命技 序仪 术公司 （PGM）
合成 测序 法
以离子敏 感场效应 晶体管检 测pH值 变化
PacBio RS
单分子实时测序系统
报告内容
• 测序技术发展简介 • PacBio RS技术
测序原理 流程和策略 优势
应用
第一代测序方法
第 X 公司 平台名 称 大约读 测序方法 检测方法 长(碱基 优点 相对局限性
代
数)
高读长，准确
第 一 代
ABI/生 命技术 公司
3130xL3730xL
桑格-毛细 管电泳测 序法
荧光/光 学
6001000
度一次性达标 率高，能很好 处理重复序列 和多聚序列 高读长，准确
通量低；样品制备成本高， 使之难以做大量的平行测 序
第 一 代 贝克曼
GeXP遗 传分析 系统
桑格-毛细 管电泳测 序法
pacbio测序原理
pacbio测序原理PacBio测序原理。
PacBio测序是一种基于单分子实时测序技术的第三代测序方法，它具有高通量、长读长、低假阳性率等特点，在生物医学研究、基因组学和生物信息学等领域有着广泛的应用。
PacBio测序的原理主要包括DNA样品制备、DNA聚合酶链反应、测序反应和数据分析等步骤。
首先，DNA样品制备是PacBio测序的第一步。
DNA样品可以来源于各种生物组织或细胞，如血液、细胞培养物等。
在这一步骤中，需要对DNA样品进行纯化和质量检测，确保样品的纯度和完整性，以保证后续的实验顺利进行。
接下来是DNA聚合酶链反应（PCR）。
PCR是一种体外扩增DNA的方法，通过PCR可以将少量的DNA扩增成足够用于下游实验的量。
在PacBio测序中，PCR主要用于扩增目标DNA片段，以便进行后续的测序反应。
测序反应是PacBio测序的核心步骤。
PacBio测序采用的是单分子实时测序技术，其原理是将目标DNA片段连接到一种特殊的DNA聚合酶上，形成DNA聚合酶-DNA复合物。
然后，将DNA聚合酶-DNA复合物固定在测序芯片上，通过激光逐个测序DNA片段，实现对DNA序列的高通量测序。
最后是数据分析。
PacBio测序生成的数据量大，需要进行复杂的数据分析和生物信息学处理。
数据分析的步骤包括测序数据的质控、序列拼接、基因组注释等，最终得到目标DNA序列的完整信息。
总的来说，PacBio测序原理是基于单分子实时测序技术，通过DNA样品制备、PCR扩增、测序反应和数据分析等步骤，实现对DNA序列的高通量、长读长、低假阳性率的测序。
这种测序方法在基因组学研究、临床诊断、药物开发等领域有着广泛的应用前景，将为生命科学领域的研究和发展带来新的机遇和挑战。
Pacbio 第三代测序仪
第三代测序-单分子实时测序一，PacBio RS平台介绍二，PacBio RS测序仪系统服务领域1，动植物复杂基因组测序2，真菌基因组完成图3，细菌基因组完成图4，BAC克隆完成图5，从头组装（DE Novo Assembly）三，天津生物芯片提供的PACBIO RS系统测序方案四，PacBio RS测序仪系统优势五，PacBio RS测序仪系统原理一，PacBio RS平台介绍PacBio RS测序仪系统是太平洋生物技术公司（Pacific Biosciences）基于单分子实时（SMRT）测序技术的第三代测序平台，可以在一天内完成从样品制备到测序和读取序列的全过程。
天津生物芯片利用PacBio RS测序仪系统全面解决了二代测序几大困扰：海量数据拼接难，变异检测假阳性高，稀有突变被淹没，高GC含量区域无法跨越，高度片段无法准确测定等，得到高质量，完整的数据信息，为合作伙伴提供优质的基因组组装，目标区域测序，碱基修饰检测等技术服务。
二，PacBio RS测序仪系统服务领域1，动植物复杂基因组测序(1)杂合基因组：杂合基因组主要指杂合率高于0.5%的二倍体基因组，如大部分水产类和昆虫等；(2)高重复基因组：主要指重复序列比例高于50%的二倍体基因组，大部分林木；(3)超大基因组：基因组大小大于3G，甚至是10G以上的物种，如两栖类，部分林木；(4)多倍体基因组：如四倍体、六倍体植物等。
图1 主要技术策略示意图2，真菌基因组完成图(1)适用于所有真菌菌株；(2)尤其适合超高GC/超低GC真菌;(3)其它用传统方法测序比较困难真菌；(4)真菌基因组草图或精细图补洞。
3，细菌基因组完成图(1)普通细菌快速完成图构建；(2)尤其适合超高GC/超低GC细菌;(3)其它用传统方法测序比较困难细菌菌株通过采用第三代测序技术，直接进行细菌基因组的完成图绘制。
4，BAC克隆完成图通过PacBio RS平台进行单分子实时测序，可以快速得到超长读长。
三大检验医学创新技术中，你不得不了解的知识点
三大检验医学创新技术中，你不得不了解的知识点检验医学，是一门专业化的学科，临床上主要是通过对所选择的材料进行各个方面的检验，如依据微生物学、生物化学、细胞学等理论知识，从而得出最新的检验结果，为疾病的预防、治疗以及评估健康状态来提供有效的依据。
例如可以检测出患者是否有贫血症状，其肝脏功能是否无碍等等。
总体而言，检验医学是专业性较强的学科，往往需要结合不同种类的光电仪器，或是化学类试剂，这就要求进行检验的人员具备过硬的理科知识与技能。
作为一门与其他多门学科有紧密联系的应用技术型学科，随着经济发展，各类高新技术也应运而生，因此，检验医学的应用范围变得更广。
尤其是许多体外诊断的产品不断发展，使得临床检验的工作效率被大大提升，诊断水平也有了提高。
在2016年7月，国务院颁布了《“十三五”国家科技创新规划》，其中明确地指出，要研究出一批适用于基层医院的高精度的诊断产品，其作用是能够提升许多重大疾病的诊断概率，从而能够及时制定治疗对策，保障了患者的健康。
在此研究过程中，测序技术、微流控技术等，已是检验医学中新型的科学技术，具有重要的运用价值。
据此，文章主要从三类典型的新型技术进行阐述，总结如下。
1.化学发光免疫分析技术1.1技术的发展历程化学发光免疫技术，其实起步于上个世纪，由于其特异性强、灵敏度高，干扰小，对人体和环境没有影响，且能够实现自动化等优点，因此被广泛运用在各个领域中。
当然，也成为临床免疫检测中，一项非常有价值的技术。
而随着时间的推移，科学技术不断发展，直接化学发光、电化学发光、光激化学发光技术等，已经成为新的分析技术，且逐渐占据市场中的主导地位。
而光激化学发光技术便开始成为现阶段中具有创新性的技术之一。
1.2技术的优势及特点关于此技术的特点，主要包括以下三种：首先，灵敏度有所提升。
是由于纳米级微粒本身的形态相对更大，能够促进抗原及抗体间的相互作用，使其能够更快实施反应，因此也为检测带来了便捷。
二代和三代测序原理及技术详解
二代和三代测序原理及技术详解二代测序（Second Generation Sequencing）和三代测序（Third Generation Sequencing）是现代生物学中常用的两种高通量测序技术。
二代测序技术主要包括Illumina测序技术和Ion Torrent测序技术，而三代测序技术则由PacBio和Oxford Nanopore等公司开发。
本文将详细介绍二代和三代测序的原理和技术。
二代测序技术采用了不同的原理，但其基本步骤相似。
首先，DNA 或RNA样本需要经过一系列的前处理步骤，如DNA片段化、连接测序指示子、PCR扩增等。
然后，将样品片段化的DNA或RNA分子固定到测序平台上，通过荧光标记的碱基依次加入到模板上，并经过图像采集系统进行扫描和记录。
最后，根据荧光信号的强度和位置确定每个碱基的序列，并通过计算机算法进行基因组的重建和分析。
Illumina测序技术是目前应用最广泛的二代测序技术之一。
其基本原理是通过将DNA片段固定到测序芯片上的特定位置上，然后通过反复的循环扩增和碱基加入的方式进行测序。
在每个循环中，只能加入一种荧光标记的碱基，并记录荧光信号，之后通过去除荧光信号并进行图像分析来确定碱基的序列。
Illumina测序技术具有高通量、高准确性和较低的测序成本，并广泛应用于基因组学、转录组学和表观遗传学等领域。
Ion Torrent测序技术是另一种常用的二代测序技术。
其原理基于DNA聚合酶催化链延伸反应，该反应会释放出质子，通过测量质子释放的情况来确定碱基的序列。
Ion T orrent测序技术具有高通量和较低的测序成本，但由于其测序误差率较高，主要应用于低复杂度的基因组测序和个体检测等领域。
与二代测序技术相比，三代测序技术具有更长的读长和更高的速度。
PacBio是其中一种代表性的三代测序技术。
PacBio测序技术基于单分子实时测序（Single-Molecule Real-Time Sequencing）原理，通过将DNA聚合酶与荧光标记的碱基一起加入到DNA模板上，通过测量聚合酶引发的荧光信号来确定碱基的序列。
picbio三代测序原理
三代测序之PacBio SMRT技术全解析2017-05-11 11:29 来源:基因谷技术气温回升，天气渐暖，花儿开了一簇又一簇~在这美好的季节里，我们准备聊点新话题。
今天小编要来和你分享：PacBio SMRT测序那些事儿~测序技术在近几年中又有里程碑的发展，Pacific Biosciences公司成功推出商业化的第三代测序仪平台，让三代测序正式走入我们的视线。
与前两代相比，第三代测序有什么不同呢？今天小编带大家详细了解测序界新宠-PacBio SMRT测序平台。
PacBio SMRT测序原理Pacific Biosciences公司研发的单分子实时测序系统（Single Molecule Real Time，SMRT）应用了边合成边测序的原理，并以SMRT芯片为测序载体。
基本原理如下：聚合酶捕获文库DNA序列，锚定在零模波导孔底部4种不同荧光标记的dNTP随机进入零模波导孔底部荧光dNTP被激光照射，发出荧光，检测荧光荧光dNTP与DNA模板的碱基匹配，在酶的作用下合成一个碱基统计荧光信号存在时间长短，区分匹配碱基与游离碱基，获得DNA序列酶反应过程中，一方面使链延伸，另一方面使dNTP上的荧光基团脱落聚合反应持续进行，测序同时持续进行PacBio SMRT测序原理PacBio SMRT的单分子测序和超长读长是如何实现的？我们重点看一下该技术的两点关键创新：分别是零模波导孔（zero-mode waveguides, ZMWs）和荧光标记在核苷酸焦磷酸链上（Phospholinked nucleotides）。
SMRT Cell含有纳米级的零模波导孔，每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序，并实时检测插入碱基的荧光信号。
ZMW是一个直径只有10~50 nm的孔，当激光打在ZMW底部时，只能照亮很小的区域，DNA聚合酶就被固定在这个区域。
只有在这个区域内，碱基携带的荧光基团被激活从而被检测到，大幅地降低了背景荧光干扰。
pacbio三代测序原理
pacbio三代测序原理随着生物学的发展，对于基因组的研究和分析也越来越重要。
在基因组研究中，测序是必不可少的一步。
测序技术的发展使得人们能够更加深入地了解基因组和生物学的本质。
PacBio三代测序技术是近年来新兴的一种测序技术，其原理和流程与传统的二代测序有很大的不同。
本文将详细介绍PacBio三代测序的原理和流程。
PacBio三代测序是基于单分子实时测序技术的。
其使用的测序仪是PacBio RS II或Sequel，这些测序仪能够实现单分子实时测序。
与传统的二代测序技术不同，PacBio三代测序能够在单个分子水平上进行测序，因此无需进行PCR扩增和文库构建等步骤，从而避免了PCR扩增引入的偏差和文库构建过程中的损失。
此外，PacBio三代测序还具有长读长优势，能够产生数千到数万的bp长的reads，从而大大提高了测序的准确性和覆盖度。
PacBio三代测序的原理是基于SMRT（Single Molecule Real Time）技术，该技术基于荧光信号实现单分子实时测序。
具体来说，PacBio 测序仪利用荧光标记的四种不同核苷酸（A、T、C、G）在DNA合成过程中的释放来进行测序。
当DNA合成时，DNA聚合酶会在荧光标记的核苷酸加入到新合成的链中时释放荧光信号。
这些荧光信号被PacBio 测序仪捕获并转化为序列信息。
由于荧光标记的核苷酸释放荧光信号的速度是非常快的，因此PacBio测序仪可以实时监测DNA合成的过程，从而实现单分子实时测序。
PacBio三代测序的流程主要分为三个步骤：样品准备、测序反应和数据分析。
首先，需要从样品中提取DNA，并将其质量和浓度进行检测。
接下来，将DNA片段直接加入到PacBio测序仪中，不需要进行PCR扩增和文库构建等步骤。
在测序反应中，PacBio测序仪会将荧光标记的核苷酸加入到新合成的DNA链中，并实时监测荧光信号。
最后，将测序得到的数据进行分析，包括序列拼接、错误校正和注释等步骤，从而得到高质量的基因组序列。
第三代PacBio测序技术的测序原理和读长
第三代PacBio测序技术的测序原理和读长针对PacBio单分⼦测序——第三代测序技术的测序原理和读长DNA基因测序技术从上世纪70年代起，历经三代技术后，⽬前已发展成为⼀项相对成熟的⽣物产业。
测序技术的应⽤也扩展到了⽣物、医学、制药、健康、农林、园艺、花卉、环保、法医等许多领域，并成为⼀项与我们⾐⾷住⾏密切相关的⾼技术产业。
据最新统计，2012年全球基因测序市场的产值已超过百亿，按最近⼏年增长速度，预计2017年市场产值将加倍。
因此可以说，基因测序在我国⽣物科技领域具有⾮常重要的战略意义。
“第三代测序技术”的研发已有近⼗年时间，商业化的第三代测序仪上市也有三年,⽬前，国内对Pacbio单分⼦测序研究也有了最新进展：⼀，中科院药植所采⽤PacBio单分⼦测序揭⽰丹参叶绿体DNA修饰之间复杂的相互作⽤：编码及⾮编码RNA的表达2014年6⽉10⽇，中科院药⽤植物研究所（IMPLAD）刘昶团队在《PLOS ONE》杂志上发表了利⽤PacBio测序技术揭⽰丹参（Salvia miltiorrhiza）叶绿体DNA修饰之间复杂相互作⽤的相关⽂章，该⽂章报道了丹参叶绿体中编码及⾮编码RNA的表达情况。
这也是国内PacBio第三代测序⽤户在国际性杂志发表的第⼀篇⽂章。
丹参是最⼴泛使⽤的药⽤植物之⼀。
作为基于叶绿体基因⼯程⼿段开发使丹参活性成分过表达⽅法的第⼀步，该研究团队从基因组，转录组，和碱基修饰三⽅⾯对丹参叶绿体进⾏了分析。
先从新鲜叶⽚中提取总基因组DNA和RNA，然后进⾏链特异性RNA测序和PacBio 公司的单分⼦实时（Single-Molecule Real-Time, SMRT）测序分析。
实验先是将RNA测序得到的reads mapping到基因组，使该研究⼩组确定了80个蛋⽩质编码基因的相对表达⽔平。
此外，还明确了19个多顺反⼦转录单元和136个假定反义和基因间⾮编码RNA（ncRNA）基因。
pacbio三代测序原理
pacbio三代测序原理随着基因组学的发展，测序技术也在不断地进步和完善。
其中，第三代测序技术因其高通量、高准确性、长读长等优势，被越来越多的科研人员所关注和使用。
PacBio三代测序技术是目前最先进的单分子实时测序技术之一。
本文将介绍PacBio三代测序的原理、优势和应用。
一、PacBio三代测序原理PacBio三代测序技术主要基于SMRT（Single Molecule Real Time）技术，其基本原理是将DNA分子固定在聚合酶上，通过单分子实时监测DNA聚合酶的扩增过程，从而实现对DNA序列的测定。
具体过程如下：1. DNA样本制备：将DNA样本进行适当处理，使其适合于PacBio 测序。
2. DNA聚合酶固定：将DNA聚合酶固定在透明的聚合酶盘上，并在盘底部加入荧光素和底物。
3. DNA扩增：加入DNA样本，DNA聚合酶开始扩增，同时荧光素也被释放出来。
4. 荧光检测：荧光素被激发后会发出荧光信号，通过摄像头实时捕捉荧光信号，记录DNA聚合酶扩增的过程。
5. 数据分析：通过计算机处理荧光信号，得到DNA序列信息。
由于PacBio三代测序技术采用单分子实时监测技术，因此其读长可以达到10kb以上，比第二代测序技术要长得多。
此外，PacBio三代测序技术还可以实现单分子级别的准确性，能够准确地检测到DNA序列中的各种变异。
二、PacBio三代测序优势1. 长读长：PacBio三代测序技术的读长可以达到10kb以上，比第二代测序技术要长得多。
这使得PacBio三代测序技术可以检测到更多的基因组结构变异和复杂序列。
2. 高准确性：PacBio三代测序技术可以实现单分子级别的准确性，能够准确地检测到DNA序列中的各种变异。
3. 高通量：PacBio三代测序技术可以在短时间内完成大量的测序工作，提高了测序效率和产出量。
4. 适用范围广：PacBio三代测序技术可以用于各种样本类型的测序，包括基因组、转录组、表观基因组等。
第三代基因测序技术的开发和应用
第三代基因测序技术的开发和应用随着科学技术的不断发展，基因测序也发生了很大的变化。
第一代基因测序技术是基于手动方法的，需要大量时间和人力完成，效率很低。
第二代基因测序技术的问世，极大地促进了生物医学领域的研究和发展。
然而，第三代基因测序技术的开发和应用，将会为我们的医疗技术和生物技术带来更为革命性的变化。
第三代基因测序技术是什么？第三代基因测序技术是一种全新的DNA测序技术，它与前两代的技术不同，可以说是一个飞跃。
与前两代相比，第三代基因测序技术具有更快的测序速度，更高的准确性，以及更低的成本。
这一技术的最大优点是可以获得更长的连续序列，比前两代技术获得的序列长得多。
第三代基因测序技术的开发第三代基因测序技术的开发历时几十年。
2005年，比利时的Pacific Biosciences公司发表了第一篇关于单分子实时测序的论文，标志着第三代测序技术的诞生。
该公司于2011年推出了自己的产品PacBio RS，这是市场上首个商业化的第三代基因测序仪器。
2012年，Oxford Nanopore Technologies公司推出了MinION这一开创性的超长读取基因测序仪，真正实现了第三代基因测序技术的商业化。
第三代基因测序技术的应用第三代基因测序技术的应用非常广泛，可以推动各个领域的研究和发展。
例如：1.医疗领域：第三代基因测序技术对医疗领域有着深远的影响，可以应用于基因诊断、疾病预防和治疗等方面，例如癌症基因测序、遗传性疾病基因诊断等。
同时，它还可以为定制化医疗提供技术支持，开创了个性化医疗的新时代。
2.农业领域：第三代基因测序技术可以用于植物和动物的基因组分析和注释，研究杂交种的产生和进化规律等。
此外，它还可以为农业生产提供技术支持，例如肉牛的繁殖规划、豆科作物种质资源维护等。
3.环境领域：第三代基因测序技术可以用于环境样品的DNA分析，研究微生物和真菌群落结构和功能等，对环境微生物的种类和数量进行监测和评估等。
第三代测序技术介绍
第三代测序技术介绍目前，主要的第三代测序技术包括单分子测序技术和纳米孔测序技术。
单分子测序技术是指将DNA样本直接读取成单个分子的测序技术。
这种技术的一个典型代表是PacBio Single Molecule Real-Time（SMRT）测序技术。
这种技术基于真核生物DNA聚合酶的特点，通过监测单个DNA分子的合成过程来实现测序。
在PacBio SMRT测序技术中，DNA分子被固定在悬浮在荧光物质中的微小光子学平台上，随着DNA合成的进行，DNA聚合酶会释放出光子，从而可以实时监测到DNA的合成过程。
这种技术能够实现长读取长度和高保真度，具有快速、高效、高通量的特点，被广泛应用于基因组学、转录组学等研究领域。
纳米孔测序技术是指通过将DNA样本引导通过一个纳米孔，并通过监测DNA分子在纳米孔中电信号的变化来实现测序的技术。
这种技术的一个代表是Oxford Nanopore Technologies（ONT）的MinION测序技术。
在MinION测序技术中，DNA样本通过纳米孔时，会引起电信号的变化，这种变化可以被转化成测序信息进行读取。
这种技术具有实时、长读取长度、低成本的特点，可以在实验室和户外等多种场合进行测序，被广泛应用于移动基因组学、环境监测等领域。
第三代测序技术的出现极大地推动了基因组学、转录组学等研究领域的发展。
它们不仅提高了测序的速度和准确性，还降低了测序的成本，使得大规模基因组和转录组的测序成为可能。
在人类基因组计划中，第三代测序技术被广泛应用于完成全基因组的测序任务，为研究人类基因组提供了重要的数据资源。
同时，第三代测序技术也被广泛应用于微生物学、农业科学、生物多样性研究等领域，为相关研究提供了有力的支持。
然而，尽管第三代测序技术在测序速度和准确性上有了巨大的进步，但其仍然存在一些挑战和限制。
比如，第三代测序技术在读取长度和错误率等方面仍有改进的空间，同时对于复杂的基因结构和重复序列的测序仍然存在困难。
三代测序技术的应用以及与二代技术的比较
微生物组
无需打断、无需组装，转录本直接反转录得全长cDNA
平均读长15K，无需PCR，均匀覆盖基因组
测序同时直接检测各种碱基修饰、脉冲间隔持续时间IPD不同来识别
快速获得基因组完成图
根据长度不同，会建600bp（Hiseq测）【HGAP、MHAP、Falcon】
Params.xml
二代、三代测序平台比较
三代测序技术
二代测序技术
A经PCR扩增后形成分子簇，变合成边测序
测序对象
单分子DNA
PCR扩增后的DNA分子簇
测序读长
平均15K，最长45K
PE150、PE300
测序准确率
单次测序准确率87.5%，测序深度15X准确度达到Q40，30X达到Q50
通常Q30
通量
一个run(8个SMRT cell) 8G
一个Lane 60G [Hiseq PE150]
一个Lane 15G[Miseq PE300]
代表
PacBio、Oxford Nanopore
三代测序也叫单分子实时测序（SMRT），PacBio SMRT技术，不需要进行PCR扩增，具备超长读长、高准确率、高敏感性、无GC偏向性和直接检测修饰碱基等特点，能解决二代测序的海量数据拼接困难、稀有突变被淹没、高GC区域无法跨越、高重复片段无法准确测定的困扰。
三代测序应用范围
全长转录组
全基因组De novo
Hiseq、Miseq
基因组组装
二代补洞、三代辅助组装提升contig N50；IRYS光学图谱，提升Scaffold N50到染色体水平【将Scaffold N50再浓缩提升延长】
读长较短，只能组做表达鉴定（可以检测低丰度、同源基因、超家族基因或等位基因表达的转录本
pacbio 简书
pacbio 简书PacBio是一家生物技术公司，其核心技术是第三代单分子实时DNA测序技术。
PacBio公司的全称是Pacific Biosciences of California，成立于2004年，总部位于美国加利福尼亚州门洛帕克（Menlo Park）。
PacBio公司的创始人是Stephen Turner和Joseph Jacobson。
PacBio公司的第三代单分子实时DNA测序技术第三代单分子实时DNA测序技术是指直接将DNA单分子放在测序仪上进行测序，不需要进行PCR扩增和文库构建等复杂的前处理步骤。
这种技术可以避免PCR扩增过程中的偏差和错误，可以直接读取单个DNA分子的信息，因此能够获得更准确、更完整的DNA序列信息。
PacBio公司的第三代单分子实时DNA测序技术的原理是利用Zero-Mode Waveguide（ZMW）孔技术，该技术可以将单个DNA分子限制在一个非常小的空间内，使其在光学激发下发出荧光信号，从而实现DNA序列信息的读取。
PacBio公司的测序仪可以读取每个ZMW孔中的荧光信号，从而实现对单个DNA分子的读取。
PacBio公司的第三代单分子实时DNA测序技术的优点是可以获得长读长、高准确度的DNA序列信息。
相比于第二代测序技术，PacBio 公司的测序仪可以获得几十kb甚至上百kb的长读长，可以避免DNA 序列中的重复区域和高GC区域等难以测序的区域，从而获得更完整的DNA序列信息。
此外，PacBio公司的测序仪可以根据荧光信号的强度和时间信息来判断DNA碱基的类型和位置，因此可以获得更高的准确度。
PacBio测序技术的应用PacBio测序技术可以应用于基因组学、转录组学、表观基因组学等领域。
在基因组学领域，PacBio测序技术可以获得更完整的基因组序列信息，可以发现新的基因和功能区域，可以研究基因组结构和进化等问题。
在转录组学领域，PacBio测序技术可以获得更准确的转录本信息，可以发现新的剪接形式和非编码RNA等信息，可以研究基因调控和信号通路等问题。
如何理解PacBio的准确度
Understanding Accuracy in SMRT Sequencing介绍第三代测序中的PacBio单分子实时（Single Molecule Real-Time, SMRT）DNA 测序可以实现超过99.999%（QV50）的高度精确测序，且不受DNA序列中GC和AT含量的影响，平均读长可达10-15kb（最长>40kb），这是如何实现的呢？这是因为SMRT技术在与DNA测序精确度相关的三个方面均有独到之处：1. Consensus accuracy（一致性准确性）2. Sequence context bias（测序偏好性）3. Mappability of sequence reads（测序reads的map表现）本文将从专业客观的角度从这三方面详细阐述SMRT测序技术的表现，图文并茂，数据详实，请各位看官留步，细细品味。
1. Consensus accuracy（一致性准确性）一个典型的测序过程通常包括三个基本步骤：（i）生成测序reads，（ii）将生成的reads mapping到已知的参考序列上，（iii）为了得到最终的序列而生成consensus。
如果DNA样本是未知起源的，那么第（ii）步就会被de novo基因组组装所代替，以便生成一个新的参考基因组。
最后一步是将原始测序reads mapping到assembly结果。
为了使大家更好的理解SMRT测序技术是怎样达到准确度>99.999%的，图1我们先来review一下在second-generation sequencing系统中，测序结果是怎样得到的。
在这个例子中，一条120bp的read被mapping到参考基因组上，红色箭头表示与参考基因组不一致的碱基。
但是我们不能单凭这一条read的mapping结果就给出生物学结论，因为我们不知道这种不一致究竟来自于真正的生物学变异还是仅仅是由于测序错误导致的。
第三代测序技术(单分子实时DNA测序)与第二代测序技术(高通量测序技术)简介
第三代测序技术（单分子实时DNA测序）与第二代测序技术（高通量测序技术）简介第三代测序技术(单分子实时DNA测序)与第二代测序技术(高通量测序技术)简介第三代测序技术简介如果有人告诉你用显微镜实时观测单分子DNA聚合酶复制DNA，并用它来测序，你一定会认为他异想天开，没有一点生物的sense。
我最初就是这样认为的，然而它不仅可以实现，而且已经实现了～这个就是被称为第三代的测序技术，Pacific Biosciences公司推出的“Single Molecule Real Time(SMRT) DNA Sequencing”(单分子实时DNA测序)。
我有幸在NIH听到了这个技术发明人Stephen Turner博士的讲座，根据自己粗浅的理解记录整理一下。
要实现单分子实时测序，有三个关键的技术。
第一个是荧光标记的脱氧核苷酸。
显微镜现在再厉害，也不可能真的实时看到“单分子”。
但是它可以实时记录荧光的强度变化。
当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。
当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。
这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。
第二个是纳米微孔。
因为在显微镜实时记录DNA链上的荧光的时候，DNA链周围的众多的荧光标记的脱氧核苷酸形成了非常强大的荧光背景。
这种强大的荧光背景使单分子的荧光探测成为不可能。
Pacific Biosciences公司发明了一种直径只有几十纳米的纳米孔[zero-mode waveguides (ZMWs)]，单分子的DNA聚合酶被固定在这个孔内。
在这么小的孔内，DNA链周围的荧光标记的脱氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G这四种荧光标记的脱氧核苷酸非常快速地从外面进入到孔内又出去，它们形成了非常稳定的背景荧光信号。
而当某一种荧光标记的脱氧核苷酸被掺入到DNA链时，这种特定颜色的荧光会持续一小段时间，直到新的化学键形成，荧光基团被DNA聚合酶切除为止(见图)。
picbio三代测序原理
p i c b i o三代测序原理集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#三代测序之PacBio SMRT技术全解析2017-05-11 11:29 来源:气温回升，天气渐暖，花儿开了一簇又一簇~在这美好的季节里，我们准备聊点新话题。
今天小编要来和你分享：PacBio SMRT测序那些事儿~测序技术在近几年中又有里程碑的发展，Pacific Biosciences公司成功推出商业化的第三代测序仪平台，让三代测序正式走入我们的视线。
与前两代相比，第三代测序有什么不同呢今天小编带大家详细了解测序界新宠-PacBio SMRT 测序平台。
PacBio SMRT测序原理Pacific Biosciences公司研发的单分子实时测序系统（Single Molecule Real Time，SMRT）应用了边合成边测序的原理，并以SMRT芯片为测序载体。
基本原理如下：聚合酶捕获文库DNA序列，锚定在零模波导孔底部4种不同荧光标记的dNTP随机进入零模波导孔底部荧光dNTP被激光照射，发出荧光，检测荧光荧光dNTP与DNA模板的碱基匹配，在酶的作用下合成一个碱基统计荧光信号存在时间长短，区分匹配碱基与游离碱基，获得DNA序列酶反应过程中，一方面使链延伸，另一方面使dNTP上的荧光基团脱落聚合反应持续进行，测序同时持续进行PacBio SMRT测序原理PacBio SMRT的单分子测序和超长读长是如何实现的我们重点看一下该技术的两点关键创新：分别是零模波导孔（zero-mode waveguides, ZMWs）和荧光标记在核苷酸焦磷酸链上（Phospholinked nucleotides）。
SMRT Cell含有纳米级的零模波导孔，每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序，并实时检测插入碱基的荧光信号。
ZMW是一个直径只有10~50 nm的孔，当激光打在ZMW底部时，只能照亮很小的区域，DNA聚合酶就被固定在这个区域。
pacbio sequel ⅱ测序原理
序号： 1主题：PacBio Sequel Ⅱ测序原理随着基因组学和生物学研究的不断发展，测序技术也在不断更新和进步。
PacBio Sequel Ⅱ是一种新型的单分子实时测序技术，具有高准确性和长读长，能够应用于基因组测序、转录组测序以及表观基因组测序等领域。
本文将介绍PacBio Sequel Ⅱ测序原理及其在生物学研究中的应用。
序号： 2PacBio Sequel Ⅱ测序原理PacBio Sequel Ⅱ测序技术是基于单分子实时测序的原理。
其核心是通过监测DNA聚合酶在合成新链时释放的荧光信号，实现直接测序单个DNA分子。
相比传统的Illumina测序技术，PacBio Sequel Ⅱ能够获得更长的读长，最大读长可达100 kb，极大地提高了测序的准确性和覆盖度。
序号： 3PacBio Sequel Ⅱ测序的步骤PacBio Sequel Ⅱ测序主要包括DNA准备、DNA修饰、DNA连接、SMRT Cell加载、实时测序和数据分析等步骤。
需要对待测DNA进行修饰处理，包括环化修饰和连接适配体。
然后将修饰后的DNA加载至SMRT Cell中，SMRT（Single Molecule Real Time）Cell是PacBio Sequel Ⅱ测序的载体，具有微小的孔道用于单分子测序。
DNA加载后，荧光标记的DNA聚合酶将在SMRT Cell中对DNA进行合成，并产生荧光信号。
通过数据分析软件将荧光信号转化为DNA 序列。
序号： 4PacBio Sequel Ⅱ测序的应用PacBio Sequel Ⅱ测序技术在基因组学和生物学研究中具有重要的应用价值。
PacBio Sequel Ⅱ能够实现长读长的测序，适用于基因组的组装和结构变异检测。
PacBio Sequel Ⅱ能够实现实时测序，可以用于转录组测序和表观基因组测序，揭示基因表达和修饰的全貌。
PacBio Sequel Ⅱ还可以应用于微生物的全基因组测序、重组体的测序以及植物和动物的进化研究等领域。
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PacBio RS II单分子实时测序原理
➢ PacBio RS II单分子实时测序（single molecule, real-time，SMRT）测序反应是 在其专利SMRT cell中进行的，每个SMRT cell中有150,000个ZMW（纳米级的零模波 导孔zero-mode waveguides）,每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链， SMRT Cell能够平行检测大约75,000个单分子测序反应。
➢ 测相邻两个碱基之间的测序时间，来检测一些碱基修饰情况，如果碱基
PacBio RSII 测序优势
• NGS读长在35-700bp 之间，而PacBio RS II 平均测序读长能得到
更完整精确的组装结
果达到3-10kb，最长 的序列能达到20kb， 超长读长可轻松跨越
重复序列，轻松；
1.超长的 测序读长
• 对基因组组装和基因组 变异检测，可以最多达
到99.999%的准确率； 选用特殊测序模式，测
序准确率可以在达到单
2.极高的准个 件分 下子 ，读99长%准超确过率经的典条的 确率 Sanger测序法；
4.无PCR 扩增偏向
性
• 样本不需要进行PCR扩 增，避免了覆盖度不均
一和PCR artifacts.
的最大体积不得超过130ul，溶解用的缓冲液中不含EDTA。
2. 纯化的DNA样品非常稳定，建议以冷冻（干冰）的方式运输样品，一方面保证无细菌 污染，另一方面也可以减少样品的挥发。
四 、操作DNA时的注意事项
1. 乙醇沉淀后避免DNA过于干燥，让DNA在空气中自然干燥。 2. 应使用RNA ase-free的水或其他适合的溶液溶解DNA。 3. 为帮助DNA溶解，可小心翻转小管数次，或用手指轻弹管的底部，或者也可以将
同时，我们是目前国内做微生物测序最多的单位之一，已经完成了400多株微生物基 因组测序，近100株细菌的完成图，合作单位发表的 SCI 文章已有30余篇，具有丰富 的专业分析经验。
全长转录组测序
转录组测序是指利用高通量测序技术对cDNA进行测序从而得到一个样品中所有RNA的 信息，得到基因的全长转录本是科学研究工作者梦寐以求的测序结果，但碍于现有 序列拼装技术限制，得到全长转录本的数量、准确度和完整性大打折扣，PacBio RS II测序平完整的全长转录本。
2. DNA样品浓度：对于PacBio测序的样品，建议使用PicoGreen染色或用Qubit分光光度 计（Life Technology）进行检测
3. 确保样品为双链DNA。单链DNA不能进行SMA品多次冻融，确保样品没有在大于65度的环境中放置，没有暴露在高酸性
PacBio RS II 第三代单分子实时测序
2014-04
PacBio RS II单分子实时测序系统具有超常读长、组装结 果高准确度、可检测碱基修饰等优势特点，可广泛应用 于基因组测序、甲基化测序、全长转录本测序等项目。 详见：/zh-
CN/hanyumarketing/e3/e3.html
3.最小的 GC偏向性 （GC bias）
• 在极端高GC和极端低GC区域， 可以轻松测定，从而保证序列的
均匀覆盖度；
PacBio RS II 测序的应用
基因组测序
PacBio RS II测序系统无需PCR的建库技术，大大减少了高GC基因组所带来的偏好影响； 领先的超长测序，reads 读长>4kb，有效提高基因组组装精准度和完整性，可更精确 检测基因组变异及修饰情况，更适用于生物基因组研究。
➢ 专利DNA 聚合酶不受激光对其造成的损伤及核苷酸标记荧光影响，可较长时间保持 酶活性，实现超长读长，且当荧光标记的脱氧核苷酸与DNA链形成化学键时，DNA聚 合酶可切除其荧光基团，荧光消失。ZMW外径比检测激光波长小，激光从底部打上去 后不能穿透小孔进入上方溶液区，能量被限制在一个小范围(体积20X 10-21 L)里, 正好足够覆盖需要检测的部分，使得信号仅来自这个小反
样品放置于2-8度的环境下过夜溶解。 5. 请勿涡旋震荡DNA样品，因为该操作会导致DNA片段化。 6. 将DNA样品在65度加热10分钟，以使DNASE失活。确保加热时间不超过10分钟，否
则可能导致DNA的损伤。同时，请勿反复冻融DNA样品。
➢ 当测序进行时，专利的包被技术保证DNA 聚合酶和模板形成的复合体被锚定在 ZMW 的底部，反应溶液中带有标记着不同荧光磷酸基团的高浓度核苷酸，检测装置则透 过ZMW 底部的基层来实时观察 DNA 的合成过程，不同荧光标记的脱氧核苷酸被掺入 DNA链时，其荧光可在DNA链检测到，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。
碱基修饰测序
表观遗传学研究是现代科学研究热点，全基因组上的甲基化修饰检测更是热点中的焦点， PacBio RS II根据修饰碱基与未修饰碱基通过聚合酶的动力学变化，识别碱基修饰情况。 PacBio RS II目前可检测甲基化修饰类型包括：4mC,6mA,5mC；
优势：
无需进行DNA扩增，可检测甲基化与半甲基化位点； 单碱基分辨率； 无需专门处理，可直接进行碱基修饰检测测序； 可发现未知修饰；
PacBio RS II样本准备要求
一、测序所需样品量
所需的测序样品的量会根据SMARTBell模板制备时插入片段的大小不同 而不同。根据样品的提取质量，在片段化以及检测浓度的过程中，大 概会有20%的样品损失。因此，请确保有足够的起始DNA样品从而可以 进行后续的流程。
二、样品要求
1. DNA样品纯度：260/280比值接近1.8，260/230比值为2.0~2.2
或高碱性条件下(PH <6或>9)和UV环境下。
5. 确保样品不含有不溶的物质，RNA，螯合剂（如EDTA），二价金属阳离子（如Mg2+），
变性剂（如胍盐，苯酚）或去污剂（SDS，Triton-X 100）。
三、样品储存和运输要求
1. DNA样品可溶解于Tris缓冲液中（如10mM Tris，PH为7.0~8.0）或无核酸酶的水中，样品
➢ 应区域，孔外过多游离核苷酸单体依然留在黑暗中，从而实现将背景降到最低。相 机以15ms速度快速扫描整个阵列，检测特异性结合到DNA片断上的荧光碱基。
➢ 此外，PacBio RS II测序可以通过检存在修饰，则通过聚合酶时的速度会减慢，相 邻两峰之间的距离增大，可以通过这个来之间检测甲基化等信息。