PacBioRS单分子实时测序系统
pacbio测序原理
pacbio测序原理PacBio测序原理。
PacBio测序是一种基于单分子实时测序技术的第三代测序方法，它具有高通量、长读长、低假阳性率等特点，在生物医学研究、基因组学和生物信息学等领域有着广泛的应用。
PacBio测序的原理主要包括DNA样品制备、DNA聚合酶链反应、测序反应和数据分析等步骤。
首先，DNA样品制备是PacBio测序的第一步。
DNA样品可以来源于各种生物组织或细胞，如血液、细胞培养物等。
在这一步骤中，需要对DNA样品进行纯化和质量检测，确保样品的纯度和完整性，以保证后续的实验顺利进行。
接下来是DNA聚合酶链反应（PCR）。
PCR是一种体外扩增DNA的方法，通过PCR可以将少量的DNA扩增成足够用于下游实验的量。
在PacBio测序中，PCR主要用于扩增目标DNA片段，以便进行后续的测序反应。
测序反应是PacBio测序的核心步骤。
PacBio测序采用的是单分子实时测序技术，其原理是将目标DNA片段连接到一种特殊的DNA聚合酶上，形成DNA聚合酶-DNA复合物。
然后，将DNA聚合酶-DNA复合物固定在测序芯片上，通过激光逐个测序DNA片段，实现对DNA序列的高通量测序。
最后是数据分析。
PacBio测序生成的数据量大，需要进行复杂的数据分析和生物信息学处理。
数据分析的步骤包括测序数据的质控、序列拼接、基因组注释等，最终得到目标DNA序列的完整信息。
总的来说，PacBio测序原理是基于单分子实时测序技术，通过DNA样品制备、PCR扩增、测序反应和数据分析等步骤，实现对DNA序列的高通量、长读长、低假阳性率的测序。
这种测序方法在基因组学研究、临床诊断、药物开发等领域有着广泛的应用前景，将为生命科学领域的研究和发展带来新的机遇和挑战。
Pacbio 第三代测序仪
第三代测序-单分子实时测序一，PacBio RS平台介绍二，PacBio RS测序仪系统服务领域1，动植物复杂基因组测序2，真菌基因组完成图3，细菌基因组完成图4，BAC克隆完成图5，从头组装（DE Novo Assembly）三，天津生物芯片提供的PACBIO RS系统测序方案四，PacBio RS测序仪系统优势五，PacBio RS测序仪系统原理一，PacBio RS平台介绍PacBio RS测序仪系统是太平洋生物技术公司（Pacific Biosciences）基于单分子实时（SMRT）测序技术的第三代测序平台，可以在一天内完成从样品制备到测序和读取序列的全过程。
天津生物芯片利用PacBio RS测序仪系统全面解决了二代测序几大困扰：海量数据拼接难，变异检测假阳性高，稀有突变被淹没，高GC含量区域无法跨越，高度片段无法准确测定等，得到高质量，完整的数据信息，为合作伙伴提供优质的基因组组装，目标区域测序，碱基修饰检测等技术服务。
二，PacBio RS测序仪系统服务领域1，动植物复杂基因组测序(1)杂合基因组：杂合基因组主要指杂合率高于0.5%的二倍体基因组，如大部分水产类和昆虫等；(2)高重复基因组：主要指重复序列比例高于50%的二倍体基因组，大部分林木；(3)超大基因组：基因组大小大于3G，甚至是10G以上的物种，如两栖类，部分林木；(4)多倍体基因组：如四倍体、六倍体植物等。
图1 主要技术策略示意图2，真菌基因组完成图(1)适用于所有真菌菌株；(2)尤其适合超高GC/超低GC真菌;(3)其它用传统方法测序比较困难真菌；(4)真菌基因组草图或精细图补洞。
3，细菌基因组完成图(1)普通细菌快速完成图构建；(2)尤其适合超高GC/超低GC细菌;(3)其它用传统方法测序比较困难细菌菌株通过采用第三代测序技术，直接进行细菌基因组的完成图绘制。
4，BAC克隆完成图通过PacBio RS平台进行单分子实时测序，可以快速得到超长读长。
第三代测序技术的三种技术平台介绍
第三代测序技术的三种技术平台介绍随着生物学的发展，人们对基因的功能研究更加透彻，为了进一步研究和改造基因的目的需要详细了解生物的基因组全序列，因为DNA序列是改造基因的基础，这就要求具有高效的DNA测序技术。
DNA测序技术到目前为止已经发展到了第三代测序技术。
最早的Sanger测序在人类基因组计划中立下赫赫战功，但也给基因组测序贴上了数亿美元的价格标签，让人生畏。
这两年发展迅猛的第二代测序仪——Illumina的Genome Analyzer、Roche 454的GS系列以及ABI的SOLiD系统——让人类基因组重测序的费用蹭地降低到10万美元以下。
现在，能对单个DNA分子进行测序的第三代测序仪也加入到这场比赛中，让竞争更加激烈。
目前，第三代测序主要有三种技术平台。
两种通过掺入并检测荧光标记的核苷酸，来实现单分子测序。
Helicos的遗传分析系统已上市，而Pacific Biosciences准备在明年推出单分子实时(SMRT)技术。
第三种Oxford Nanopore的纳米孔(nanopore)测序还尚未有推出的时间表，但有可能是这三种当中最便宜的。
纳米孔测序的优势在于它不需要对DNA进行标记，也就省去了昂贵的荧光试剂和CCD照相机。
最近，Oxford Nanopore T echnologies的Hagan Bayley及他的研究小组正致力于改善纳米孔。
根据他们之前的工作，他们以a-溶血素来设计纳米孔，并将环式糊精共价结合在孔的内侧(下图)。
当核酸外切酶消化单链DNA后，单个碱基落入孔中，它们瞬间与环式糊精相互作用，并阻碍了穿过孔中的电流。
每个碱基ATGC以及甲基胞嘧啶都有自己特有的电流振幅，因此很容易转化成DNA序列。
每个碱基也有特有的平均停留时间，它的解离速率常数是电压依赖的，+180 mV的电位能确保碱基从孔的另一侧离开。
a-溶血素纳米孔(剖面图)以及共价结合的环式糊精(浅蓝色)瞬间结合落入孔中的碱基(红色)。
picbio三代测序原理
p i c b i o三代测序原理集团标准化工作小组 [Q8QX9QT-X8QQB8Q8-NQ8QJ8-M8QMN]三代测序之PacBio SMRT技术全解析2017-05-11 11:29 来源:气温回升，天气渐暖，花儿开了一簇又一簇~在这美好的季节里，我们准备聊点新话题。
今天小编要来和你分享：PacBio SMRT测序那些事儿~测序技术在近几年中又有里程碑的发展，Pacific Biosciences公司成功推出商业化的第三代测序仪平台，让三代测序正式走入我们的视线。
与前两代相比，第三代测序有什么不同呢今天小编带大家详细了解测序界新宠-PacBio SMRT 测序平台。
PacBio SMRT测序原理Pacific Biosciences公司研发的单分子实时测序系统（Single Molecule Real Time，SMRT）应用了边合成边测序的原理，并以SMRT芯片为测序载体。
基本原理如下：聚合酶捕获文库DNA序列，锚定在零模波导孔底部4种不同荧光标记的dNTP随机进入零模波导孔底部荧光dNTP被激光照射，发出荧光，检测荧光荧光dNTP与DNA模板的碱基匹配，在酶的作用下合成一个碱基统计荧光信号存在时间长短，区分匹配碱基与游离碱基，获得DNA序列酶反应过程中，一方面使链延伸，另一方面使dNTP上的荧光基团脱落聚合反应持续进行，测序同时持续进行PacBio SMRT测序原理PacBio SMRT的单分子测序和超长读长是如何实现的我们重点看一下该技术的两点关键创新：分别是零模波导孔（zero-mode waveguides, ZMWs）和荧光标记在核苷酸焦磷酸链上（Phospholinked nucleotides）。
SMRT Cell含有纳米级的零模波导孔，每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序，并实时检测插入碱基的荧光信号。
ZMW是一个直径只有10~50 nm的孔，当激光打在ZMW底部时，只能照亮很小的区域，DNA聚合酶就被固定在这个区域。
picbio三代测序原理
三代测序之PacBio SMRT技术全解析2017-05-11 11:29 来源:基因谷技术气温回升，天气渐暖，花儿开了一簇又一簇~在这美好的季节里，我们准备聊点新话题。
今天小编要来和你分享：PacBio SMRT测序那些事儿~测序技术在近几年中又有里程碑的发展，Pacific Biosciences公司成功推出商业化的第三代测序仪平台，让三代测序正式走入我们的视线。
与前两代相比，第三代测序有什么不同呢？今天小编带大家详细了解测序界新宠-PacBio SMRT测序平台。
PacBio SMRT测序原理Pacific Biosciences公司研发的单分子实时测序系统（Single Molecule Real Time，SMRT）应用了边合成边测序的原理，并以SMRT芯片为测序载体。
基本原理如下：聚合酶捕获文库DNA序列，锚定在零模波导孔底部4种不同荧光标记的dNTP随机进入零模波导孔底部荧光dNTP被激光照射，发出荧光，检测荧光荧光dNTP与DNA模板的碱基匹配，在酶的作用下合成一个碱基统计荧光信号存在时间长短，区分匹配碱基与游离碱基，获得DNA序列酶反应过程中，一方面使链延伸，另一方面使dNTP上的荧光基团脱落聚合反应持续进行，测序同时持续进行PacBio SMRT测序原理PacBio SMRT的单分子测序和超长读长是如何实现的？我们重点看一下该技术的两点关键创新：分别是零模波导孔（zero-mode waveguides, ZMWs）和荧光标记在核苷酸焦磷酸链上（Phospholinked nucleotides）。
SMRT Cell含有纳米级的零模波导孔，每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序，并实时检测插入碱基的荧光信号。
ZMW是一个直径只有10~50 nm的孔，当激光打在ZMW底部时，只能照亮很小的区域，DNA聚合酶就被固定在这个区域。
只有在这个区域内，碱基携带的荧光基团被激活从而被检测到，大幅地降低了背景荧光干扰。
pacbio三代测序原理
pacbio三代测序原理随着生物学的发展，对于基因组的研究和分析也越来越重要。
在基因组研究中，测序是必不可少的一步。
测序技术的发展使得人们能够更加深入地了解基因组和生物学的本质。
PacBio三代测序技术是近年来新兴的一种测序技术，其原理和流程与传统的二代测序有很大的不同。
本文将详细介绍PacBio三代测序的原理和流程。
PacBio三代测序是基于单分子实时测序技术的。
其使用的测序仪是PacBio RS II或Sequel，这些测序仪能够实现单分子实时测序。
与传统的二代测序技术不同，PacBio三代测序能够在单个分子水平上进行测序，因此无需进行PCR扩增和文库构建等步骤，从而避免了PCR扩增引入的偏差和文库构建过程中的损失。
此外，PacBio三代测序还具有长读长优势，能够产生数千到数万的bp长的reads，从而大大提高了测序的准确性和覆盖度。
PacBio三代测序的原理是基于SMRT（Single Molecule Real Time）技术，该技术基于荧光信号实现单分子实时测序。
具体来说，PacBio 测序仪利用荧光标记的四种不同核苷酸（A、T、C、G）在DNA合成过程中的释放来进行测序。
当DNA合成时，DNA聚合酶会在荧光标记的核苷酸加入到新合成的链中时释放荧光信号。
这些荧光信号被PacBio 测序仪捕获并转化为序列信息。
由于荧光标记的核苷酸释放荧光信号的速度是非常快的，因此PacBio测序仪可以实时监测DNA合成的过程，从而实现单分子实时测序。
PacBio三代测序的流程主要分为三个步骤：样品准备、测序反应和数据分析。
首先，需要从样品中提取DNA，并将其质量和浓度进行检测。
接下来，将DNA片段直接加入到PacBio测序仪中，不需要进行PCR扩增和文库构建等步骤。
在测序反应中，PacBio测序仪会将荧光标记的核苷酸加入到新合成的DNA链中，并实时监测荧光信号。
最后，将测序得到的数据进行分析，包括序列拼接、错误校正和注释等步骤，从而得到高质量的基因组序列。
PacBio原例及应用
技术原理
荧光标记位点 NGS 标记位置 5’端甲基 在合成过程中，荧光标记物的一 部分保留在DNA链上，随DNA链 的延伸会产生三维空间阻力，导 致DNA链延长到一定程度后会出 现错读 PacBio 3’端磷酸键 新的碱基加入时，在3’端磷酸键 的标记会随磷酸键断裂自动被打 断，标记物被弃去，即合成的 DNA链不带荧光标记，和天然的 DNA链合成产物一致，可以达到 很长的读长
数据特点
应用方向
• • • • •
细菌，真菌完成图 辅助基因组组装 16s全长测序 甲基化测序 CNV，SV检测
应用方向-完成图
应用方向——辅助De novo 组装
PacBio+Hiseq
组装策略 Hiseq only PacBio+Hiseq
小片段组装
Hiseq 组装
PacBio+Hiseq 联合组装
Num_Scaffold/Num_Contig Total_Length(bp) Gap_Length N50 PE比对率（500bp）
2/2 5426943 0 4174487 97.92% 6
可能有结构错误的区域的 个数
应用方向—甲基化测序
应用方向——甲基化测序
应用方向
应用方向——SV ,CNV 检测
案例分析二
案例分析二
Example gene (ACD) with two unannotated isoforms shown by CSMMs（consensus split-mapped molecule）
案例分析二
• All CSMMs (blue) mapping to AUP1 (annotation in black).
特点
单分子测序PacBio技术和应用解决方案
单分子测序PacBio技术和应用解决方案一、技术原理SMRT：single molecular real time SequencingPacBio RS，RS表示Real time Sequencing关键之一：DNA聚合酶基本原理：DNA聚合酶和模板结合，4色荧光标记4种碱基，经过Watson配对后不同的碱基加入，会发出不同光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。
和其他基本测序技术一样，在反应管中进行的是大规模平行的多分子反应，怎样在其中进行单分子反应检测？周围有大量的荧光标记的游离碱基，怎样将反应信号与周围游离碱基的强大荧光背景区别出来？通过一个物理现象解释：ZMW（zero-mode waveguides，零模波导孔）。
例如微波炉壁上可看到有很多密集的小孔。
小孔直径有考究，如果直径大于微波波长，能量就会穿透面板泄露。
如果孔径小于波长，能量不会辐射外部，起保护作用。
在一个反应管（SMRTCell：单分子实时反应孔）中有许多这样的圆形纳米小孔，即ZMW（零模波导孔），外径100多纳米，比检测激光波长小（数百纳米），激光从底部打上去后不能穿透小孔进入上方溶液区，能量被限制在一个小范围（体积20X 10-21L）里，正好足够覆盖需要检测的部分，使得信号仅来自这个小反应区域，孔外过多游离核苷酸单体依然留在黑暗中，将背景降到最低。
单个ZMW底部固定有一个结合了模板DNA的聚合酶，当加入测序反应试剂后，每个碱基配对合成后会发出相应的光并被检测。
一个SMRTCell中有15万个ZMW，每个孔中有一个单分子DNA链在高速合成，如众星闪烁。
原始检测数据的结果，每合成一个碱基即显示为一个脉冲峰，每分钟>100个碱基的速度，配上高分辨率的光学检测系统，就能实时检进行检测。
关键点之二：荧光标记位点。
这是影响测序长度的非常关键的因素。
二代测序都标记在5…端甲基上，在合成过程中，荧光标记物保留在DNA链上，随DNA链的延伸会产生三维空间阻力导致DNA链延长到一定程度后会出现错读。
测序技术的发展历程
测序技术的发展历程随着1953年沃森和克里克发现了DNA的双螺旋结构，到2001年，首个人类基因组图谱的绘制完成，人们越来越多的认识到测序在生物医学中的重要作用。
测序技术的发展历史Sanger测序技术1975年由桑格和考尔森开创的链终止法测序技术标志着人类第一代DNA测序技术的诞生。
1977年，人类历史上第一个基因组序列噬菌体X174由桑格团队测序完成。
自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。
SangerJ.D. Waston、F.Crick虽然第一代测序技术的测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。
因而第一代测序技术并不是最理想的测序方法。
从那时起人们开始了二代测序技术的探索。
第二代测序技术第二代测序技术的核心思想是边合成边测序（Sequencing by Synthesis)，在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。
现有的技术平台主要包括Roche/454 FLX（已宣布停产）、Illumina Hiseq Miseq等系列和Applied Biosystems SOLID system。
Roche/454 FLX Illumina Hiseq 2500 AB SOLID第三代测序技术第二代测序技术虽然较Sanger测序有了巨大的突破，但是其测序的理论基础仍然建立在PCR扩增的基础之上。
为了有效的避免测序过程中由于PCR扩增带来的偏差，科学家们积极投身到第三代单分子测序仪研究当中。
目前最具代表性的包括Heliscope单分子实时合成测序法，纳米孔测序技术等。
现有的商用的技术平台主要是Pacific Biosciences公司的PacBio RS测序仪系统。
pacbio三代测序原理
pacbio三代测序原理随着基因组学的发展，测序技术也在不断地进步和完善。
其中，第三代测序技术因其高通量、高准确性、长读长等优势，被越来越多的科研人员所关注和使用。
PacBio三代测序技术是目前最先进的单分子实时测序技术之一。
本文将介绍PacBio三代测序的原理、优势和应用。
一、PacBio三代测序原理PacBio三代测序技术主要基于SMRT（Single Molecule Real Time）技术，其基本原理是将DNA分子固定在聚合酶上，通过单分子实时监测DNA聚合酶的扩增过程，从而实现对DNA序列的测定。
具体过程如下：1. DNA样本制备：将DNA样本进行适当处理，使其适合于PacBio 测序。
2. DNA聚合酶固定：将DNA聚合酶固定在透明的聚合酶盘上，并在盘底部加入荧光素和底物。
3. DNA扩增：加入DNA样本，DNA聚合酶开始扩增，同时荧光素也被释放出来。
4. 荧光检测：荧光素被激发后会发出荧光信号，通过摄像头实时捕捉荧光信号，记录DNA聚合酶扩增的过程。
5. 数据分析：通过计算机处理荧光信号，得到DNA序列信息。
由于PacBio三代测序技术采用单分子实时监测技术，因此其读长可以达到10kb以上，比第二代测序技术要长得多。
此外，PacBio三代测序技术还可以实现单分子级别的准确性，能够准确地检测到DNA序列中的各种变异。
二、PacBio三代测序优势1. 长读长：PacBio三代测序技术的读长可以达到10kb以上，比第二代测序技术要长得多。
这使得PacBio三代测序技术可以检测到更多的基因组结构变异和复杂序列。
2. 高准确性：PacBio三代测序技术可以实现单分子级别的准确性，能够准确地检测到DNA序列中的各种变异。
3. 高通量：PacBio三代测序技术可以在短时间内完成大量的测序工作，提高了测序效率和产出量。
4. 适用范围广：PacBio三代测序技术可以用于各种样本类型的测序，包括基因组、转录组、表观基因组等。
pacbio 简书
pacbio 简书PacBio是一家生物技术公司，其核心技术是第三代单分子实时DNA测序技术。
PacBio公司的全称是Pacific Biosciences of California，成立于2004年，总部位于美国加利福尼亚州门洛帕克（Menlo Park）。
PacBio公司的创始人是Stephen Turner和Joseph Jacobson。
PacBio公司的第三代单分子实时DNA测序技术第三代单分子实时DNA测序技术是指直接将DNA单分子放在测序仪上进行测序，不需要进行PCR扩增和文库构建等复杂的前处理步骤。
这种技术可以避免PCR扩增过程中的偏差和错误，可以直接读取单个DNA分子的信息，因此能够获得更准确、更完整的DNA序列信息。
PacBio公司的第三代单分子实时DNA测序技术的原理是利用Zero-Mode Waveguide（ZMW）孔技术，该技术可以将单个DNA分子限制在一个非常小的空间内，使其在光学激发下发出荧光信号，从而实现DNA序列信息的读取。
PacBio公司的测序仪可以读取每个ZMW孔中的荧光信号，从而实现对单个DNA分子的读取。
PacBio公司的第三代单分子实时DNA测序技术的优点是可以获得长读长、高准确度的DNA序列信息。
相比于第二代测序技术，PacBio 公司的测序仪可以获得几十kb甚至上百kb的长读长，可以避免DNA 序列中的重复区域和高GC区域等难以测序的区域，从而获得更完整的DNA序列信息。
此外，PacBio公司的测序仪可以根据荧光信号的强度和时间信息来判断DNA碱基的类型和位置，因此可以获得更高的准确度。
PacBio测序技术的应用PacBio测序技术可以应用于基因组学、转录组学、表观基因组学等领域。
在基因组学领域，PacBio测序技术可以获得更完整的基因组序列信息，可以发现新的基因和功能区域，可以研究基因组结构和进化等问题。
在转录组学领域，PacBio测序技术可以获得更准确的转录本信息，可以发现新的剪接形式和非编码RNA等信息，可以研究基因调控和信号通路等问题。
picbio三代测序原理
p i c b i o三代测序原理集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#三代测序之PacBio SMRT技术全解析2017-05-11 11:29 来源:气温回升，天气渐暖，花儿开了一簇又一簇~在这美好的季节里，我们准备聊点新话题。
今天小编要来和你分享：PacBio SMRT测序那些事儿~测序技术在近几年中又有里程碑的发展，Pacific Biosciences公司成功推出商业化的第三代测序仪平台，让三代测序正式走入我们的视线。
与前两代相比，第三代测序有什么不同呢今天小编带大家详细了解测序界新宠-PacBio SMRT 测序平台。
PacBio SMRT测序原理Pacific Biosciences公司研发的单分子实时测序系统（Single Molecule Real Time，SMRT）应用了边合成边测序的原理，并以SMRT芯片为测序载体。
基本原理如下：聚合酶捕获文库DNA序列，锚定在零模波导孔底部4种不同荧光标记的dNTP随机进入零模波导孔底部荧光dNTP被激光照射，发出荧光，检测荧光荧光dNTP与DNA模板的碱基匹配，在酶的作用下合成一个碱基统计荧光信号存在时间长短，区分匹配碱基与游离碱基，获得DNA序列酶反应过程中，一方面使链延伸，另一方面使dNTP上的荧光基团脱落聚合反应持续进行，测序同时持续进行PacBio SMRT测序原理PacBio SMRT的单分子测序和超长读长是如何实现的我们重点看一下该技术的两点关键创新：分别是零模波导孔（zero-mode waveguides, ZMWs）和荧光标记在核苷酸焦磷酸链上（Phospholinked nucleotides）。
SMRT Cell含有纳米级的零模波导孔，每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序，并实时检测插入碱基的荧光信号。
ZMW是一个直径只有10~50 nm的孔，当激光打在ZMW底部时，只能照亮很小的区域，DNA聚合酶就被固定在这个区域。
第三代测序技术(单分子实时DNA测序)与第二代测序技术(高通量测序技术)简介
第三代测序技术（单分子实时DNA测序）与第二代测序技术（高通量测序技术）简介第三代测序技术(单分子实时DNA测序)与第二代测序技术(高通量测序技术)简介第三代测序技术简介如果有人告诉你用显微镜实时观测单分子DNA聚合酶复制DNA，并用它来测序，你一定会认为他异想天开，没有一点生物的sense。
我最初就是这样认为的，然而它不仅可以实现，而且已经实现了～这个就是被称为第三代的测序技术，Pacific Biosciences公司推出的“Single Molecule Real Time(SMRT) DNA Sequencing”(单分子实时DNA测序)。
我有幸在NIH听到了这个技术发明人Stephen Turner博士的讲座，根据自己粗浅的理解记录整理一下。
要实现单分子实时测序，有三个关键的技术。
第一个是荧光标记的脱氧核苷酸。
显微镜现在再厉害，也不可能真的实时看到“单分子”。
但是它可以实时记录荧光的强度变化。
当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。
当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。
这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。
第二个是纳米微孔。
因为在显微镜实时记录DNA链上的荧光的时候，DNA链周围的众多的荧光标记的脱氧核苷酸形成了非常强大的荧光背景。
这种强大的荧光背景使单分子的荧光探测成为不可能。
Pacific Biosciences公司发明了一种直径只有几十纳米的纳米孔[zero-mode waveguides (ZMWs)]，单分子的DNA聚合酶被固定在这个孔内。
在这么小的孔内，DNA链周围的荧光标记的脱氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G这四种荧光标记的脱氧核苷酸非常快速地从外面进入到孔内又出去，它们形成了非常稳定的背景荧光信号。
而当某一种荧光标记的脱氧核苷酸被掺入到DNA链时，这种特定颜色的荧光会持续一小段时间，直到新的化学键形成，荧光基团被DNA聚合酶切除为止(见图)。
三大检验医学创新技术中，你不得不了解的知识点
三大检验医学创新技术中，你不得不了解的知识点检验医学，是一门专业化的学科，临床上主要是通过对所选择的材料进行各个方面的检验，如依据微生物学、生物化学、细胞学等理论知识，从而得出最新的检验结果，为疾病的预防、治疗以及评估健康状态来提供有效的依据。
例如可以检测出患者是否有贫血症状，其肝脏功能是否无碍等等。
总体而言，检验医学是专业性较强的学科，往往需要结合不同种类的光电仪器，或是化学类试剂，这就要求进行检验的人员具备过硬的理科知识与技能。
作为一门与其他多门学科有紧密联系的应用技术型学科，随着经济发展，各类高新技术也应运而生，因此，检验医学的应用范围变得更广。
尤其是许多体外诊断的产品不断发展，使得临床检验的工作效率被大大提升，诊断水平也有了提高。
在2016年7月，国务院颁布了《“十三五”国家科技创新规划》，其中明确地指出，要研究出一批适用于基层医院的高精度的诊断产品，其作用是能够提升许多重大疾病的诊断概率，从而能够及时制定治疗对策，保障了患者的健康。
在此研究过程中，测序技术、微流控技术等，已是检验医学中新型的科学技术，具有重要的运用价值。
据此，文章主要从三类典型的新型技术进行阐述，总结如下。
1.化学发光免疫分析技术1.1技术的发展历程化学发光免疫技术，其实起步于上个世纪，由于其特异性强、灵敏度高，干扰小，对人体和环境没有影响，且能够实现自动化等优点，因此被广泛运用在各个领域中。
当然，也成为临床免疫检测中，一项非常有价值的技术。
而随着时间的推移，科学技术不断发展，直接化学发光、电化学发光、光激化学发光技术等，已经成为新的分析技术，且逐渐占据市场中的主导地位。
而光激化学发光技术便开始成为现阶段中具有创新性的技术之一。
1.2技术的优势及特点关于此技术的特点，主要包括以下三种：首先，灵敏度有所提升。
是由于纳米级微粒本身的形态相对更大，能够促进抗原及抗体间的相互作用，使其能够更快实施反应，因此也为检测带来了便捷。
pacbio 发展史
Pacific Biosciences of California, Inc.（PacBio）是一家专注于开发和商业化单分子实时（Single Molecule, Real-Time，简称SMRT）测序技术的美国生物技术公司。
以下是PacBio发展历史的关键里程碑：1. **成立与早期阶段**：- PacBio成立于2004年，由Stephen Turner博士与其他科学家共同创立。
-公司的核心技术基于Turner博士在斯坦福大学的研究成果，即通过零模波导孔（Zero Mode Waveguides, ZMWs）进行单分子测序。
2. **技术研发与突破**：- 2009年前后，PacBio开始研发其第一代商业测序平台——RS（the PacBio RS System），该系统能够实现长读长、无需PCR扩增的DNA测序，这标志着第三代测序技术的重大进步。
-随后的几年中，PacBio持续改进其SMRT技术，提高数据质量、降低成本，并增加通量。
3. **产品发布与市场扩张**：- 2011年，PacBio RS测序仪正式投入市场，尽管初期成本较高且错误率相较于第二代测序有所偏高，但因其独特优势，在基因组组装、复杂结构变异检测等方面迅速获得应用。
- 2015年以后，PacBio相继推出了更新迭代的产品，如Sequel系列测序仪，提高了测序效率和准确性。
4. **业务扩展与合作**：- PacBio积极拓展全球市场，与众多科研机构和企业建立合作关系，包括在中国与百迈客等公司联合建立实验室，推动三代测序技术的应用和发展。
-在微生物组学研究领域，PacBio技术也发挥了重要作用，尤其是对于肠道微生物全基因组测序分析。
5. **技术创新与提升**：-PacBio不断优化其SMRTbell文库构建技术和数据分析方法，以解决更广泛的生物学问题，例如在人类基因组测序、动植物基因组组装、转录组研究以及表观遗传学等领域取得显著进展。
测序技术的发展历程
测序技术的发展历程随着1953年沃森和克里克发现了DNA的双螺旋结构，到2001年，首个人类基因组图谱的绘制完成，人们越来越多的认识到测序在生物医学中的重要作用。
测序技术的发展历史Sanger测序技术1975年由桑格和考尔森开创的链终止法测序技术标志着人类第一代DNA测序技术的诞生。
1977年，人类历史上第一个基因组序列噬菌体X174由桑格团队测序完成。
自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。
SangerJ.D. Waston、F.Crick虽然第一代测序技术的测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。
因而第一代测序技术并不是最理想的测序方法。
从那时起人们开始了二代测序技术的探索。
第二代测序技术第二代测序技术的核心思想是边合成边测序（Sequencing by Synthesis)，在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。
现有的技术平台主要包括Roche/454 FLX（已宣布停产）、Illumina Hiseq Miseq等系列和Applied Biosystems SOLID system。
Roche/454 FLX Illumina Hiseq 2500 AB SOLID第三代测序技术第二代测序技术虽然较Sanger测序有了巨大的突破，但是其测序的理论基础仍然建立在PCR扩增的基础之上。
为了有效的避免测序过程中由于PCR扩增带来的偏差，科学家们积极投身到第三代单分子测序仪研究当中。
目前最具代表性的包括Heliscope单分子实时合成测序法，纳米孔测序技术等。
现有的商用的技术平台主要是Pacific Biosciences公司的PacBio RS测序仪系统。
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第三代测序技术
第 X 代
公司
平台名 称
测序 方法
检测方法
大约读长 (碱基数)
ห้องสมุดไป่ตู้
优点
相对局限性
并不能高效地将DNA聚 合酶加到测序阵列中； 准确性一次性达标的机 会低（81-83%）；DNA 聚合酶在阵列中降解； 总体上每个碱基测序成 本高（仪器昂贵）；
第 三 代
太平洋 生物科 学公司
PacBio RS
第 三 代
全基因 组学公 司
GeXP遗 传分析 系统
复合 探针 锚杂 交和 连接 技术
荧光/光 学
10
低读长； 模板制备妨碍 长重复序列区域测序； 样品制备费事；尚无商 业化供应的仪器
第 三 代
Ion 个人基 Torrent/ 因组测 生命技 序仪 术公司 （PGM）
合成 测序 法
以离子敏 感场效应 晶体管检 测pH值 变化
PacBio RS
单分子实时测序系统
报告内容
• 测序技术发展简介 • PacBio RS技术
测序原理 流程和策略 优势
应用
第一代测序方法
第 X 公司 平台名 称 大约读 测序方法 检测方法 长(碱基 优点 相对局限性
代
数)
高读长，准确
第 一 代
ABI/生 命技术 公司
3130xL3730xL
桑格-毛细 管电泳测 序法
荧光/光 学
6001000
度一次性达标 率高，能很好 处理重复序列 和多聚序列 高读长，准确
通量低；样品制备成本高， 使之难以做大量的平行测 序
第 一 代 贝克曼
GeXP遗 传分析 系统
桑格-毛细 管电泳测 序法
度一次性达标 荧光/光 学 6001000 率高，能很好 处理重复序列 和多聚序列； 易小型化 通量低；单个样品的制备 成本相对较高
PacBio RS系统的优势
1、单分子实时检测，每条碱基链的数据都得到评估，更易发现稀有变异；
100-200
一步步的洗脱过程可导 致错误累积；阅读高重 复和同种多聚序列时有 潜在困难；
PacBio RS技术
• 核心技术：单分子实时DNA测序技术 (Single Molecule Real Time, SMRT) • 三个关键：
1.荧光标记的脱氧核苷酸；
2.ZMW（zero-mode waveguides，零模波导孔）；
•
频闪测序：由于激光连续照射会对 DNA聚合酶活性造成一定影响，因此，可以通过将 激光器按照一定间隔打开和关闭，获得相对标准测序来说更长时间的聚合酶活性。这 样可获得一系列分散的读取序列从而增加对超长插入片段的物理覆盖率。适合长度高 达 10K的插入片段。主要用于结构变异的鉴定或者对复杂重复区域的拼接。
二
代
Illumina
00/miSe
q
止物和合
成测序法
2x150
很高测序通量
很高测序通量； 在广为接受的 第 二 代 ABI/SO LiD 5500xlS OLiD系 统 连接测序 法 荧光/光 学 几种第二代平 25-35 台中，所要拼 接出人类基因 组的试剂成本 最低 测序运行时间长；读长 短，造成成本高，数据 分析困难和基因组拼接 困难；仪器昂贵
实时 单分 子 DNA 测序
荧光/光 学
~1000
高平均读长，比第一 代的测序时间降低； 不需要扩增；最长单 个读长接近3000碱基 在第三代中通量最高； 在所有测序技术中， 用于拼接一个人基因 组的试剂成本最低； 每个测序步骤独立， 使错误的累积变得最 低 对核酸碱基的掺入可 直接测定；在自然条 件下进行DNA合成 （不需要使用修饰过 的碱基）
3.实时监测
• 共聚焦显微镜； • 实时监测并分析单分子测序反应； • 快速地对集成在板上的无数的纳米小孔同 时进行记录。
PacBio RS流程和策略
材料：全基因组DNA、cDNA 1、构建• 片段化：3-10kb； • 连接：粘末端修复成平端，连接环状单链，得到类似哑铃（“套马 环”）的结构，称为SMRT Bell。
• 一个单分子实时反应孔（SMRT Cell）有7.5万纳米小孔， 即ZMW； • 底部固定DNA聚合酶；
•
直径几十纳米，DNA链周围少量脱氧核苷酸非常快速扩散，形成稳定的背景 荧光信号；
• •
激光能量正好覆盖需要检测的部分，将背景降到最低； 聚合酶检测到正确的核苷酸时，便将其掺入新生链中，这个过程需要几毫秒， 而扩散只需要几微秒。这种时间差使掺入的核苷酸产生了很高的信号强度， 通过ZMW，可以在荧光标记核苷酸的背景下检测单个掺入事件。
•
环形比对测序： circle consensus read，从插入片段的一端测到另一端后，由于模板是哑 铃状结构的，因此，继续测序将得到互补链的序列信息，从而可通过对插入片段的反 复测序来获得高准确度的单分子测序结果。适合插入片段在 250-500bp，主要用于发现 和确定稀有变异； 每合成一圈，2x覆盖度；聚合酶持续循环多圈，得到高覆盖度； 对非常低的频率的片段获得很高的准确度；
无需扩增，没有 扩增偏向性，高 或低GC含量区域 覆盖均匀，不会 湮没稀有突变。
• 2、引物退火：• 3、结合聚合酶（固定在ZWM底部 ）；
• 4、测序 ：加入荧光标记的核苷酸，聚合酶边合成边测序；
• 5、荧光捕获分析得到基因序列信息；
测序方案
•
标准测序： continuous long read，从插入片段的一端测到另一端，只测一次。适合插入 片段在 1-6Kb间，主要应用于再测序和重头测序；
第二代测序方法
第 X 代 公司 平台名称 测序方法 检测方法 大约读长 (碱基数) 优点 相对局限性
第
二 代 第
基因组 罗氏 /454 测序仪 FLX系 统 HiSeq20 可逆链终 荧光/光 学 焦磷酸测 序法 光学 230-400
在第二代中最 高读长；比第 一代的测序通 量大
样品制备较难；难于处 理重复和同种碱基多聚 区域；试剂冲洗带来错 误累积；仪器昂贵 仪器昂贵；用于数据删 节和分析的费用很高
3.实时监测：共聚焦成像系统。
1.荧光标记的脱氧核苷酸
• DNA合成过程中，荧光探测； • 将荧光染料标记在核苷酸的磷酸链而不是碱基上， 被DNA聚合酶切除；
• 合成的DNA链和天然的DNA链一致，不影响DNA
聚合酶的活性，达到很长的读长。
2. ZMW（zero-mode waveguides， 零模波导孔）