7_色谱图常见问题分析-waters
高效液相色谱仪使用中常见问题及对策
高效液相色谱仪使用中常见问题及对策高效液相色谱（HPLC）作为一种分离技术和方法，目前已经发展到一个全新的阶段。
高精度的输液泵，应用广泛的色谱分离柱，低噪音、高灵敏度的各种检测器和功能强大的数据处理软件系统的出现，都推动了液相色谱技术的迅猛发展。
液相色谱仪正以它分辨率高、分析速度快和应用广泛的优点倍受仪器分析工作者的青睐，广泛地应用于医药卫生、环境监测、食品检测等领域。
作者本人从事液相色谱分析工作二十多年，应用HPLC技术在血药浓度、生物胺、核苷酸、蛋白质浓度测定等实际工作中，积累了许多的方法和经验，在这里与大家交流，希望能对同行们有所帮助和借鉴，共同促进液相色谱分析技术的发展。
1高效液相色谱仪的基本工作原理高效液相色谱仪如图1所示，是由溶液贮器、高压泵、进样系统、色谱分离柱、检测器和数据处理系统几部分组成。
高压泵从溶液贮器中抽走流动相，流经整个仪器系统，形成密闭的液体流路。
样品通过进样系统注入色谱分离柱，在柱内进行分离。
柱流出液进入检测器，使已被分离的组分逐一被检测器收集，并将响应值转变为电信号后经放大被数据处理系统记录色谱峰，通过数据处理系统对记录的峰值进行存储和计算[1]。
液相色谱仪是依靠色谱柱进行分离的。
研究证明：物质的色谱过程是指物质分子在相对运动的两相（液相和固相）中分配“平衡”的过程。
液相色谱是以具有吸附性质的硅胶颗粒为固定相，各种洗脱液为流动相。
当液体样品在载体流动相的推动下，在液-固两相间作相对运动时，由于各组分在两相中的分配系数（K）不同，则使各自的移动速度不同，即产生差速迁移。
各组分在两相间经过多次分配，从而达到使混合物分离的目的。
上式反映了物质在两相中进行吸附、解吸、再吸附、再解吸…过程中，由于在两相中浓度的不同，而存在分配系数上的差异。
既然分配系数及其差异是引起组分在液相色谱柱分离的根本原因，那么，必然地也会同色谱理论中可测宏观量之间存在着某种定量关系，事实上，色谱理论中通常用容量因子k’的概念来反映物质在两相中的分配关系：k’值可以非常方便地表达组分在两相的分配，又很容易从色谱实验数据中直接测得，是色谱理论中重要的基本参数之一[2]。
waters超高效色谱仪峰面积不稳定的原因
waters超高效色谱仪峰面积不稳定的原因waters超高效色谱仪是一种常用的分析仪器，广泛应用于各个领域的分析实验中，但是有时候会出现峰面积不稳定的情况。
峰面积不稳定会对分析结果产生影响，因此了解不稳定原因并采取相应的措施是十分重要的。
1.流体系统问题：waters超高效色谱仪的流体系统包括进样器、气泡陷阱、节流阀等，其中任何一个部件出现问题都可能导致峰面积不稳定。
常见的问题包括管道漏气、气泡过多、进样器泄漏等。
对于管道漏气，可以仔细检查连接处是否紧密，如果发现问题及时更换连接件。
对气泡过多的情况，可以通过适当调整进样速度或者提高分析柱前的压力来解决。
如果进样器泄漏，建议及时更换进样器密封件。
2.柱温不稳定：柱温的稳定对于峰面积的准确测量至关重要。
waters超高效色谱仪在工作过程中，移动相通过柱子时会引发吸热，对柱子进行恒温控制可以提高分析结果的准确性。
如果柱温不稳定，可以检查柱箱是否循环冷却，调整柱箱的温度控制参数，如温控模式、温度上下限等，以确保柱温的稳定。
3.柱压不稳定：waters超高效色谱仪的柱子工作在一定的背压下，背压不稳定可能会导致峰面积不稳定。
柱头固定不牢、进样量过大、废液处理不及时等问题都可能导致柱压不稳定。
对于柱头固定不牢的情况，可以拧紧连接螺丝；对于进样量过大的情况，可以减小进样量或者调整进样器参数；对于废液处理不及时的情况，建议及时更换或清洗废液垃圾桶。
4.电子信号问题：waters超高效色谱仪的信号检测系统对于峰面积的测量十分重要，不稳定的电子信号会导致峰面积不稳定。
常见的问题包括信号杂波、信噪比低、波长漂移等。
为了解决这些问题，可以适当调整信号放大倍数，降低杂波的影响；增加信号平滑等参数，提高信号质量。
5.校准问题：waters超高效色谱仪的准确性需要通过校准进行保证。
如果仪器校准不准确，可能会导致峰面积计算不准确。
建议定期对仪器进行校准，并确保校准溶液浓度的准确性。
WATERS HPLC常见故障分析
保护柱的填料应该与分析色谱柱一致
实际上，设计、装填良好的保护柱将改善分析色谱柱的分离效率
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色谱柱问题
双峰
前沿峰
所有的峰都有变化 色谱柱
— 连接
— 更换筛板
— 再生或者更换色谱柱
色谱柱被破坏
— pH<2, 键合相水解 — pH>8, 硅胶基质溶解
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无样品峰
进样器未进样，样品瓶放置不正确或者未达到所需要样品量
泵未工作或泵液不正常，没有流速或者流速变小
系统漏液 流动相或样品的问题 柱子或保护柱的问题
最简单快捷的检查 - 泵是否工作, 系统是否漏液, 进一针丙酮溶液检查 检测器读数及数据单元是否有响应
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4）其它光路问题，需要维修
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“Lamp data not found” “System not calibrated” “Method not found” 电池耗尽，更换电池
操作时注意断电，防止静电损坏仪器
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开机过程中反复重启 1）电源线老化，断电情况 下反复插拔几下
2）5V电压偏低，调整电压
R43到 5V左右，不能超 过5.2V
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Alliance 常见故障 “Bubble found on compression”
--- 压缩比超过1.5倍以上出现错误 1）Wet Primer 系统 2）流动相脱气，打开在线脱气机 3）检查溶剂过滤头，清洗或者更换 4）检查单向阀，清洗
Waters常见故障分析及日常保养知识
感谢您的观看
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详细描述
这类故障可能与样品、试剂或仪器内部组件有关。首先检查样品和试剂是否符合 仪器要求，然后检查仪器内部组件是否正常工作，如泵、阀、检测器等。如果问 题依然存在，可能需要进一步检查仪器硬件或联系技术支持进行维修。
仪器显示故障
总结词
仪器显示故障通常表现为仪器屏幕无显示、显示异常或数据显示不准确。
详细描述
详细描述
这类故障可能与硬件问题或软件故障有关。首先检查仪器各 部件是否正常连接，特别是与主机连接的端口和电缆。如果 仪器自检失败并显示错误代码，应参考Waters仪器的用户手 册或联系技术支持获取解决方案。
仪器运行故障
总结词
仪器运行故障表现为仪器在运行过程中出现异常情况，如数据不准确、流路异常 等。
清洗进样阀
根据需要清洗进样阀，特 别是使用高粘度样品后， 以防止进样阀堵塞。
仪器部件更换与维修
更换密封圈
仪器密封圈老化或损坏时，应及时更换以保证仪器密 封性。
更换过滤器
定期更换仪器内部的过滤器，以防止杂质和颗粒物进 入仪器内部。
维修与保养
如遇到仪器故障，应及时联系专业维修人员进行维修 保养，以确保仪器正常运行。
waters常见故障分析及日常 保养知识
目录
• Waters仪器常见故障分析 • Waters仪器日常保养知识 • Waters仪器故障排除方法 • Waters仪器保养建议
01
Waters仪器常见故障分析
电源故障
总结词
电源故障是Waters仪器最常见的故障之 一，可能导致仪器无法正常启动或运行 。
VS
详细描述
电源故障可能由于电源线损坏、电源插头 松动或电源供应不稳等原因引起。当仪器 无法正常启动时，首先应检查电源是否正 常连接，并确保电源插头紧固。如果仪器 在运行过程中突然断电，可能会导致数据 丢失或仪器损坏，因此建议使用UPS（不 间断电源）来保证仪器稳定运行。
Waters高效液相色谱维护与保养ppt课件
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10
第二部分HPLC的组成
输液系统 泵以及流 动相
进样系统 进样阀
分离系统 -色谱柱
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4
术语
• 8、色谱峰：色谱柱流出组分通过检测器时产 生的响应信号的微分曲线。
• 9、峰底：峰的起点与终点间的直线
• 10、峰高：在峰的两侧拐点处所作切线与峰底 相交两点之间的距离。 11、半峰宽（W1/2）：通过峰高的中点做平 行与峰底的直线，与其峰两侧相交两点间的距 离。 12、峰面积（A）：峰与峰底间的面积，又称 作响应值。
• 13、拖尾峰：后沿较前沿平缓的不对称峰。
• 14、前伸峰：前沿较后沿平缓的不对称峰
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5
术语
• 15、死时间（t0）:不被固定相滞留的组分， 从进样到出峰最大之所需的时间
• 16、保留时间（tR）：组分从进样到出峰最 大之所需的时间。
• 17、死体积（V0）：不被固定相滞留的组分， 从进样到出峰最大之所需的流动相的体积
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2
第一部分术语
• 1、液相色谱法：就是用液体作为流动相的 色谱法。
• 2、固定相：在色谱法中，静止不动的一相 （固体或液体）称为固定相
• 3、流动相：能运动的一相（一般是气体或 液体）称为流动相
• 4、色谱图：色谱柱流出物通过检测器时所
产生的响应信号对时间的曲线图。纵坐标
为信号强度（通常我们所说的样品浓度），
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8
第一部分术语
22、面积归一法：将所有峰的面积总和定 为1，测量各峰的面积和色谱图上除溶剂 峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积 占总峰面积的百分率。是包含水分在内 的一个计算结果。
液相色谱系统常见故障与维护
液相色谱系统常见故障与维护沃特世科技（上海）有限公司常见分析型液相色谱系统溶剂管理器常见故障与维护样品管理器常见故障与维护检测器常见故障与维护仪器准备操作流程Seal wash—Needle wash—wet prime—purge工作环境:–如电源及地线,湿度,灰尘,环境温度等化学因素:–如溶剂质量,样品状况,色谱柱/保护柱状况等仪器状态:–泵,进样器,检测器,在线过滤器,管路连接质量等操作保养:–正确的操作程序,完善的日常及定期保养保障HPLC正常工作的几个要素HPLC实验的一般流程HPLC系统的启动–打开计算机，待Windows完成自检后,打开仪器电源和检测器，待设备通过自检后，启动色谱管理软件(例如:Empower 3)准备流动相–过滤,脱气仪器准备操作流程–Seal wash—Needle wash—wet prime—balance30min—purge inject—balance 30min准备样品–用流动相溶样或重组样品,过滤–制备空白样品编制仪器方法,开始实验Prime Seal washPrime Seal washWet prime湿灌注选择A 、B 、C 、D ，时间设定为4分钟，按start 按钮Wet prime 湿灌注故障提示与解决方法白色溶剂进管可以看到不断产生气泡如果滤头因为脏导致堵塞，进入系统的流动相中就会有气泡，该溶剂过滤头需要定期清洗，清洗步骤为：将溶剂过滤头从流动相溶剂管中拔下来，用色谱级异丙醇超声清洗10min，倒掉异丙醇后，用色谱级甲醇：超纯水=1:1超声清洗15min，最后将滤头装回即可.Dry prime Dry prime 干灌注操作Dry prime2695报错Lost prime ，开机设置流速，泵也运行，但压力为0，没有流速流出，Dry prime操作示意图故障提示与解决方法波动大,从1000到几百PSI变动e2690/5 故障提示与解决方法2695报错:Plunger homing over pressureACQUITY Arc QSM-R 正面压力传感器比例阀脱气机单向阀柱塞清洗排液阀主动泵蓄积泵Arc Multi Flow Path Technology™Flow Path 1 (1100µL) & 2 (700µL)过滤滤芯H-CLASS 溶剂管理Primary Head Accumulator Head Vent Valve100 µl MixerGradient Proportioning Valve PairsLow Pressure Mixing ManifoldDegasser ChambersSeal Wash Pump输液泵的准备灌注溶剂管理器–用于排除泵头及管路中的气泡–用于更换从储液瓶到泵头之间的溶剂在下列情况下需要Prime溶剂管理器–启用新的溶剂管理器或新的系统–停机4小时后再次开机–更换流动相使用输液泵的一般建议使用高质量的溶剂, 缓冲盐和添加剂有机溶剂质量是最稳定的使用超纯水缓冲液要过滤(0.2 m 滤膜),但不要使用尼龙材料的膜不要阻塞脱气机的排空管路(不要将其放到废液瓶中)使用完缓冲液后要用水将其从系统中冲洗干净(用10-20%有机溶剂的水溶液保存)使用输液泵的一般建议保持全部流路溶剂管路全都灌注过(未使用的管路用10-20%有机溶剂的水溶液灌注)保持柱塞清洗管路是灌注过的(90-95%水)启动仪器之前重新灌注溶剂管路如在低波长下用TFA/ACN 梯度最好用100 L或更大混合器Purge Injector 2695 Purge Injector冲洗进样器2695样品管理器流路图进样针FTN样品管理器的准备选择“Wash Solvent”，设定时间为15秒 选择“Purge Solvent”，设定5-7个循环单击OK. 当系统状态是“Idle(待机)” ,就表示灌注已经完成 提示: 每做一次灌注大约需要2－4分钟FTN 样品管理器的准备样品管理器FTN示意图-洗针Wash SolventPurge Solvent灌注进样器灌注洗针液和样品注射器的目的是：–准备样品管理器–冲洗里面的进样针–排除管路中的气泡提示:–确保用于灌注的溶剂有合适的组成，它应该是高纯的，并且几种溶剂是互溶的选择清洗进样针的溶剂 清洗溶液(Wash Solvent)的选择取决于样品和所使用的流动相，确保流动相和缓冲液是互溶的。
液相色谱仪保留时间漂移的故障排出 液相色谱常见问题解决方法
液相色谱仪保留时间漂移的故障排出液相色谱常见问题解决方法保留时间不重现有两种不同的情况：既保留时间漂移和保留时间波动。
前者是指保留时间仅沿单方向发生变化，而后者指保留时间无固定规律的波动。
将此两种情况区分开来对找到问题的原因往往很有帮忙。
如，保留时间的漂移往往由柱老化引起；而柱老化不可能引起保留时间的无规律波动。
事实上，保留时间漂移的多半原因是不同机理的色谱柱老化，如固定相流失（例如通过水解），色谱柱污染（由样品或流动相所致）等。
保留时间漂移的几种常见的原因如下：一色谱柱平衡假如我们察看到保留时间漂移，首先应考虑色谱柱是否已用流动相完全平衡。
通常平衡需要10—20个柱体积的流动相，但假如在流动相中加入少量添加剂（如离子对试剂）则需要相当长的时间来平衡色谱柱。
流动相污染也可能是原因之一、溶于流动相中的少量污染物可能渐渐富集到色谱柱上，从而造成保留时间的漂移。
应注意：水是很简单污染的流动相成分。
二固定相稳定性固定相的稳定性都是有限的，即使在推举的PH范围内使用，固定相也会渐渐水解。
例如，硅胶基质在pH4时水解稳定性更好。
水解速度与流动相类型和配体有关。
双官能团配体和三官能团配体比单官能团配体的键合相要稳定；长链键合相比短链键合相稳定；烷基键合相比氰基键合相稳定的多。
常常清洗色谱柱亦会加速色谱柱固定相的水解。
其他硅胶基质键合相在水溶液环境中也可以发生水解，如氨基键合相等。
三色谱柱污染保留时间漂移的另一个常见原因是色谱柱污染。
HPLC色谱柱是特别有效的吸附性过滤器，它可以过滤并吸附流动相携带的任何物质。
污染源可以是：流动相本身，流动相容器，连接管、泵、进样器和仪器密封垫，以及样品等。
通常通过试验可判定污染的来源。
样品中假如存在色谱柱上保留很强的组分，就可能是使保留时间漂移的潜在根源。
这些根源通常是样品基质。
如：配药中的赋形剂，生化样品（如血清）中的蛋白及类脂类化合物，食品样品中的淀粉，环境水样中的腐殖酸等。
液相色谱常见的问题及改进
Base
Base
拖尾且 在HPLC中 保留过长
上述实验使用了两个相同的普通C8色谱柱 ©2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 19
碱性物质拖尾的解决方案
色谱柱或填料的品牌/流动相的pH值
中性物质
中性物质 0
碱性物质
普通 C18
碱性物质 Time (min) pH 7
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采样速率
Absorbance
0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0
A=10
0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0
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传统硅胶基质填料的pH局限性 键合相水解
10
硅胶溶解
1
0
2
Байду номын сангаас
4
6 pH 8
10
12
14
XTerra 杂化填料 — 宽pH范围
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(60:40)
Detection:
UV at 210 nm
Flow Rate: 1 mL/min
Inj. Volume: 30 µ L
ST溶RO剂N强GE度R强SA于M流PL动E 相SOLVENT
3
15
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waters故障排除及解决方法
Wei HaoWaters China Limited.HPLC常见故障分析及排除方法确定故障现象用排除法寻找问题原因分析可能引起问题的因素用基准的方法验证系统从简单问题入手色谱故障排除步骤寻求帮助一次只变化一个因素，以使你能够确认所变因素与问题之间的关联。
养成良好的记录习惯。
将来利用记录可以帮助发现问题，强化预防保养工作。
尝试预测将来可能发生的问题。
利用成功的故障排除经验。
恢复原状。
如果使用更换组件的方法来查找问题之所在，完毕后应将原有完好组件安装回原处。
否则，换下来的组件将来很难再利用，造成浪费。
确认问题至少发生两次以上。
如果问题不重复出现，很难证实其确实存在。
色谱故障排除经验规则引起HPLC发生问题的潜在因素: HPLC 常见故障因素环境电源接地线温度湿度清洁程度化学品色谱柱保护柱溶剂样品仪器泵进样器检测器数据处理单元HPLC 常见故障因素（工作环境）工作环境的影响•电源容量、稳定性•地线系统统一电源,统一接地•湿度对光学部件的影响尤为严重•温度空调机的影响•清洁不要轻视灰尘的影响HPLC 常见故障因素（化学品）化学品的影响•已损坏的保护柱、色谱柱•所用溶剂、试剂的品质•化学品使用不当带来的影响•样品前处理方法不当带来的影响•实验前的准备和实验结束后的收尾工作515 5101515/15252690/2695 600正确使用您的色谱泵：•使用高品质的溶剂•溶剂过滤（注意滤膜的选择）•脱气溶剂•柱塞杆清洗•注意调节流量时的变化速度密封圈柱塞杆HPLC 常见故障因素（510泵头）出口单向阀泵头进口单向阀出口阀进口阀参比阀抽液阀右泵头左泵头压力传感器废液溶剂过滤头HPLC 常见故障因素（600泵头）密封圈柱塞杆HPLC 常见故障因素（泵515/1500单向阀）PerformancePLUS Check Valves•易于使用•提高效率•长寿命•溶剂赖受性更好•兼容600, 515, 501 泵进、处口阀•兼容510 、M6000A 泵进口阀PN：700000253Primary HeadAccum.Head PrimaryX -ducerSystemX -ducer Prime/V entValve In-Line F ilter T o Sam pleManagementSystemFromDegasserGPV •注意流动相组分的互溶性！•使用正确的Seal Wash 溶剂！注意箭头方向！HPLC 常见故障因素（2690在线过滤器）2690初始化错误：Plunger homing over pressure在线过滤器HPLC 常见故障因素（进样器）7725i7172690PN:201000119请使用型号正确并且完好的注射器进样！请正确安装手动进样器！√X X请选择正确的转子类型！详情请参考Rheodyne公司网站：www. 正确使用步骤：•选择适当的洗针溶剂（绿管溶剂）和Seal Wash溶剂•清洗进样针（Needle Wash）•清洗柱塞杆密封（Seal Wash）•平衡系统•Purge 进样器•实验操作•清洗系统•Purge 进样器•清洗进样针（Needle Wash）•清洗柱塞杆密封（Seal Wash）其它注意事项：•打开样品仓盖后，等待样品盘停止转动后再取出•关机前取出所有样品瓶，或将样品盘全部取出•注意保持样品仓内和样品盘清洁•请使用Waters 公司认可的样品瓶•使用微量进样瓶请设定正确的针尖高度值（Depth of Needle〕•进样瓶垫损环后，请勿使用其它替代品HPLC 常见故障因素（检测器）2487双波长紫外检测器996二极管阵列检测器474荧光检测器2410示差折光检测器Peak not found: 656 nm DeuteriumLamp lighting failure 氘灯启动失败解决：检查电源检查氘灯使用时间Peak not found: Erbium n nm 波长校验失败解决：清洗检测池错误信息Lamp data not foundSystem not calibrated.Method not found错误信息机内电池的位置原因：机内电池耗尽解决：更换机内电池(CR2032)重新校正仪器注意：关闭并断开电源防止静电损伤2487检测器更换氘灯注意：关闭并断开电源防止静电损伤正常状态：Lamp及Status灯长亮Lamp灯闪烁：检查电源检查氘灯使用时间Status灯闪烁：清洗检测池996 检测器更换氘灯注意：关闭并断开电源防止静电损伤HPLC 常见故障因素（检测器）检测器使用和维护的其它注意事项•不要挡住检测器散热风扇和通风孔•不要随意更改检测器进、出口管路•示差折光检测器使用前、后均应充分清洗参比池(Purge )•长时间停用检测器时，应在检测池中充满甲醇或乙腈，必要时密封检测器进、出口管路HPLC 常见故障因素（色谱柱连接）WatersOtherPEEK 接头PN: PSL 613315√X XWaters PM Kit 介绍Performance Maintenance Kit 性能维护套件515 泵PM Kit600 泵PM KitPerformance Maintenance Kit 性能维护套件717 自动进样器PM Kit2690 系统PM KitPerformance Maintenance Kit 性能维护套件486 UV-Vis检测器PM Kit996 二极管阵列检测器PM KitWaters Quality PartsWaters正品密封圈非Waters密封圈Impropermachiningof sample portProperlychamferedsampleportThird Party Needle Waters QualityInjector NeedleThird Party Needle Waters QualityInjector NeedleImproper surface finish, irregular needle point Properlymachinedpoint andsurfacefinishWATERS 仪器维修/维护合同(TAP)介绍Total Assurance Plan(TAP)内容:★共同制定仪器维修/维护计划，每年定期更换仪器易损部件.如各密封件,光源灯等;★除定期更换的部件外,其他部件若出现故障，包括价格高的部件,维修或更换无需再付费。
WATERS HPLC常见故障分析
漂移
— 平衡 — 固定相的稳定性 — 色谱柱污染 — 疏水塌陷 — 溶剂组成
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检测器自动重启
开机过程中反复重启
1）电源线老化，断电情况 下反复插拔几下
2）5V电压偏低，调整电压 R43到 5V左右，不能超 过5.2V
14
基线噪音大
流动相内含有空气 - 脱气处理 检测池内有气泡 -冲洗检测池或增强检测出口背压（一般只适用UV检测器) 检测池污染 - 冲洗检测池 色谱柱内有未洗脱尽的组份 - 洗脱色谱柱 检测器光源灯能量低 - 更换光源灯
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基线周期性噪声
绝大多数情况下是来源于泵的问题 泵头内有气泡 - 流动相脱气 ,泵头排气 泵进出口阀有问题 – 清洗或更换单向阀组件 柱塞杆有问题 - 更换柱塞杆及其密封圈
HPLC常见故障分析
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故障逻辑判断及处理
问题
化学品
环境
仪器
*色谱柱/保护柱 *流动相 *样品
*电源 *地线 *温度 *湿度 *清洁程度
*泵 *进样器 *检测器 *数据处理单元
故障排除：确定故障至少重复2次出现，从最简单开始排查，且一次只 改变一个条件！如停止流速，拿掉或更换色谱柱，更换样品。。。
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色谱柱问题
双峰
所有的峰都有变化 色谱柱
— 连接 — 更换筛板 — 再生或者更换色谱柱
色谱柱被破坏
— pH<2, 键合相水解 — pH>8, 硅胶基质溶解
液相色谱常见问题及处理办法
液相色谱常见问题及处理办法一、问：用HPLC进行分析时，保留时间有时发生漂移，有时发生快速变化，原因何在？如何解决？关于漂移问题：1．温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定。
2．流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等。
3．柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡。
关于快速变化问题：1．流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定。
2．泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。
3．流动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合。
二、问：色质联用中毛细柱的选择应注意什么问题？1．柱效要高2．热稳定性好3．化学惰性强具体选择应注意：1．柱极性。
根据分析样品选择不同极性的柱子进行分析。
2．柱子内径。
内径大小决定柱容量。
3．液膜厚度。
分析样品温度不一样，对膜厚有不同要求，温度高液膜要厚，温度低液膜要薄。
4．柱长度。
柱越长，柱效越高，分离效果越好，但也存在吸附问题，柱子过长，分析时间长，因此要根据样品考虑柱子长度。
5．外涂层（柱体）的选择。
6．另外还有仪器型号、分析对象等因素。
三、问：液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么？1．筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。
2．存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子。
四、问：从那些方面可以简单判别毛细管柱子的热稳定性好坏？1．分配容量（或容量因子）K，好的柱子在高温运行后，分配容量K不应有明显的下降，否则，说明柱子的热稳定性不好。
2．理论塔板数n，热稳定性好的柱子经受高温后，理论塔板数应基本保持恒定。
3．柱子的极性。
热稳定性好的柱子，高温前后极性变化不大，具体表现为保留指数I 值没有大的变化。
4．噪声。
热稳定性好的柱子在高温下使用后，噪声不能增加。
5．柱子的去活层，毛细管柱子涂固定液前内部一般要用去活性试剂去活以增加惰性。
质量好的毛细管柱子高温后，去活层不应该变化，表现在对强极性样品或酸碱性样品的吸附性不能增加。
waters液相色谱仪的维护与常见故障
更换新柱塞杆
初次请维修工程师帮助解决。
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输液泵（2695）
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输液泵（2690/2695）
System X-ducer Primary X-ducer
注意： 输液泵的垫圈要和流动相匹配协调。 多数垫圈和流动相是协调的,但有的垫圈 适用于甲醇、水、乙腈，在四氢呋喃中 溶解、变粘、变软。 需换垫圈时,应向Waters咨询垫圈的 规格型号。 色谱工作者一般应学会换密封垫圈。
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2、输液泵
柱塞杆故障
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2、输液泵
单向阀
a.球和阀座粘在一起，堵死，打不 出溶剂，(缓冲盐流动相) 用高质量的溶剂冲洗，不同极性 溶剂冲洗,如水、甲醇、异丙醇、 二氯甲烷…，更换新单向阀。
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2、输液泵
b. 球和阀座密封不严，压力不稳， 气泡进入阀中，紧贴在阀体内，使 球难以返回阀座，引起倒流，压力 和流速变化大，可能有小晶体颗粒。 清除气泡的办法：打开排液阀， 大流量冲洗，用脱过气的甲醇冲洗， 一般可解决问题。Wet Prime
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输液泵
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7
输液泵
密封垫易损坏引起故障，每天实验结 束一定要认真冲洗泵,减少密封垫损耗， 并注意防止堵塞,使用缓冲盐流动相时,更 要小心。 使用HPLC级试剂,注意泵压力不要太高, 要适当调整压力,一般压力上限在35004000PSI，下限为50PSI，注意防止因泵堵 塞造成压力过高损坏柱塞杆或烧坏电机 。
WATERSHPLC常见故障分析
WATERSHPLC常见故障分析WATERSHPLC（高效液相色谱）是一种常用的分析方法，用于分离和检测化合物。
然而，HPLC仪器在使用过程中一些常见故障可能会影响分析结果和实验的进行。
在以下的文章中，我们将探讨一些WATERSHPLC常见故障的分析和解决方法。
1.峰形不对称峰形不对称可能是由于流动相、柱等问题引起的。
首先，检查流动相是否正确配置，确保使用的溶剂无气泡和杂质。
其次，检查柱的状态，尽量避免在柱上运行样品时破坏柱的封底。
最后，还可以尝试调整梯度和流速等参数以改善峰对称性。
2.噪声干扰噪声干扰可能是由于仪器的光电检测器或环境因素引起的。
首先，检查光电检测器是否干净，清洁检测器表面以去除灰尘和杂质。
其次，尽量将仪器放置在安静的环境中，避免外部噪声的干扰。
最后，检查样品制备的过程，确保样品中没有杂质或颗粒。
3.漏液漏液可能是由于柱连接不紧密或密封圈老化引起的。
首先，检查柱连接是否紧固，确保连接件没有松动。
其次，检查密封圈的状态，及时更换老化的密封圈。
最后，还可以尝试调整流速和压力以减轻压力对密封的影响。
4.柱堵塞柱堵塞可能是由于样品中的杂质、柱背压增加或柱老化引起的。
首先，可以尝试使用过滤器或微孔过滤膜将样品预处理，去除样品中的颗粒和杂质。
其次，检查流动相的组分，避免出现析出物或结晶。
最后，定期检查柱背压，及时更换老化的柱。
5.柱效降低柱效降低可能是由于柱老化、样品残留或流动相组分改变引起的。
首先，定期检查柱的状态，及时更换老化的柱。
其次，对于含有高糖、脂肪或盐的样品，可以考虑进行前处理或柱后处理以减轻柱效降低的影响。
最后，检查流动相的组分，确保流动相没有杂质和过多的溶剂。
总结而言，WATERSHPLC常见故障的分析和解决方法需要综合考虑多个因素，包括流动相、柱、样品和仪器等。
通过仔细检查和调整这些因素，可以解决大多数故障，并确保HPLC仪器的正常运行和准确的分析结果。
液相色谱教程WATERS
4 3 2 1 2 3
Conventional C18
T
Modern C18 Ideal
4
5 Buffer pH
6
7
8
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色谱图常见问题分析(二)
色谱图多峰少峰问题: –色谱图中未出峰: 进样问题:未进样或样品分解 流动相问题:泵未输液或流动相不正确 检测器设置不正确,或检测器有问题
色谱图常见问题分析(一)
色谱峰峰形异常问题: –双峰或肩峰 进样量或样品浓度过大 保护柱或色谱柱进口堵塞 保护柱或色谱柱污染或失效 –前伸峰 进样量或样品浓度过大 溶样的溶剂相对于流动相太强 保护柱或色谱柱污染或失效
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色谱图常见问题分析(一)
色谱峰峰形异常问题: –平头峰 检测器设置不正确 进样体积太大或样品浓度太高 –拖尾峰 保护柱或色谱柱问题:污染或失效 进样问题 检测器时间常数不正确
色谱图常见问题分析(一)
色谱峰峰形异常问题:
– 所有的峰均为负峰: 信号电缆接反或检测器输出极性设置颠倒 光学装置尚未达到平衡 – 一个或几个峰是负峰 流动相吸收本底高 进样过程中进了空气 离子对分离中的系统峰 样品组分的吸收(RI或UV)低于流动相
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HPLC常见问题分析
• 流路基线噪音问题
–基线漂移 系统不稳或未化学平衡 温度波动 流动相未正确脱气 流动相被污染;流动相中有稳定剂或稳定剂变化 检测器流动池漏;系统中有渗漏 色谱柱污染;固定相渗漏 选用不正确的检测波长(相对于溶剂) 有迟流出的组分
色谱中常出现的问题与解决办法
A所有组分峰变小可能原因建议措施1进样针缺陷使用新针或无缺陷的针2进样后漏夜判断漏夜点，维修之3 MAE UP过大：分流比过大调整气体流速和分流比4 分析物质分子量过大，底挥发样品时提高INJ。
OVEN（主要柱子的最高使样品的汽化温度过低，或柱温度低用温度）5 NPD被污染物（二氧化硅）覆盖更换铷珠6NPD温度过高（使用或环境温度），气体不纯更换铷珠：避免高温使用7不分流进样，分流阀关闭快：初始OVEN温高8 检测器与样品不匹配9样品的挥发调整样品的的浓度或选择合适的溶剂B峰伸舌峰伸舌多右色谱柱过载减小进样量(可能需提高仪器的sensitivty使用大容量柱子：提高OVEN，INJ温度：增大气体流速C峰高峰面积不重复1进样不重复，偏差大自动进样器：加强手动进样的练习2其他峰型变化引起的峰错位，干扰3基线的干扰仪器系统参数设定的改变参数标准化，规范化D负峰1 Detector有数据处理系统信号极性接反信号连接倒置2 TCD中，样品导热系数大于载气导热系数选择数据处理中的“负峰处理”3 ECD被污染，可能在正峰后跟随负峰清洗ECD，更换之（若有必要）E样品的检测灵敏度下降1色谱柱，衬管被污染，使活性物质灵敏度小将清洗衬管：用溶剂（优级纯甲醇）清洗色谱柱：更换之（如有必要）2进样时样品渗漏（对易挥发物质更甚）查找渗漏点3 在splite汽化进样中，OVEN初始温度过高用低于样品溶剂的初始温度；致使样品汽化后扩散加剧，导致撕沸点样品灵敏度下降使用高沸点溶剂F 峰分叉1 进样过激，不稳定，形成二次进样练习手动进样：使用自动进样器2色谱柱安装失败重新安装3 spliteless或柱头进样，样品溶剂的混合使用相同的溶剂4柱子温度波动修理稳控系统5 spliteless进样，量大，时间长。
希望用“溶剂在毛细管色谱柱前端安装5米的去效应“谱带浓缩时，溶剂的固定相的湿润性差活化，未覆盖固定液的毛细管溶剂将在柱子中形成几米长，厚度不等的溶剂带破坏正常的浓缩，使峰拉宽分叉J 峰拖尾1衬管，色谱柱被污染；有活性点清洗，更换之（如有必要）2衬管，色谱柱安装不党，存在死体积注射甲烷，峰若拖尾，则重新安装3色谱柱柱头不平用金刚砂切割，使之平4固定相的极性指标与样品分析不匹配换匹配的柱子5 样品流通路线中有冷井消除路线中的过低温度区6衬管或色谱柱中有堆积切割碎屑清洗更换衬管；切除柱头10cm7 进样时间过长缩短之8分流比低增大分流比（至少大于20/1）9进样量过高减小进样体积或稀释样品10 醇胺，伯胺，叔胺和羧酸类易拖尾用极性大的色谱柱；样品衍生处理H保留时间漂移1 温度变化检查柱温箱的温度2气体流速变化注射甲烷，测定载气线速度3进样口泄露检查进样垫；判断其他泄露处4溶剂条件变化样品，标准品使用相同的溶剂5色谱柱被污染切除柱头10cm；高温老化，清洗I分离度下降1色谱柱被污染方法同上2 固定相被破坏（柱流失）更换之3 进样失败检查泄露，维修之检查吹扫时间检查温度的适应性；检查衬管4样品浓度过高稀释；减少进样量；用高分流比H溶剂峰拉宽1色谱柱安装失败2进样渗漏3进样量高提高汽化温度4分流比低提高分流比5OVEN低6 分流进样时，初始OVEN过高降低初始柱温，使用高沸点溶剂7吹扫时间过长（不分流进样）定义短时间的吹扫程序基线问题A基线向下漂移1 新安装的柱子，基线连续向漂移几分钟继续老化2 检测器未达到平衡延长检测器的平衡时间3 检测器或GC系统中其他部分有沉积物被烤出来清洗之B 基线向上漂移1色谱柱固定相被破坏2 载气流速下降调整载气压力；清洗压力和流量调节阀C噪音1毛细管末插入检测器太深重新安装色谱柱2 使用ECD，TCD气体泄露引发基线噪音检查，维修气路3 FID ，NPD，FPD燃气流速或燃气选择不当高纯燃气，调整流速4进样口被污染清洗进样口；更换搁垫；更衬管中的玻璃纤维或硅烷化5毛细管色谱柱被污染切除首端10cm；用溶剂清洗色谱柱；更换之6检测器发生故障维修，更换之7检测器电路发生故障联系生产商或维修机构（专业）D Offset(基线位置的突然改变1电源电压波动使用稳压器2 电路接口处连接不好检查，清洗其接口处，拧紧接口3进样口被污染4色谱柱被污染5毛细管末端插入检测器太深6 检测器被污染E毛刺1 电磁干扰关闭电磁干扰源2颗粒污染进入检测器3气路密封松动，气体泄露拧紧松动的密封4检测器内部电路接口或输入，输出信号接口松动检查，清洗，拧紧接口，更换之积尘或被腐蚀F Wander（低频率的噪音）1温度，压力等环境条件的波动找到环境因素变化与基线的关系，然后稳定之2温度控制漂移测量检测器的温度3 载气中含杂质（温度稳定时）更换载气或气体净化器4进样口被污染5毛细管被污染6气体流速控制失灵清洗或更换气体气相色谱常见故障检查诊断气相色谱种类很多，性能也各有差别。
waters故障指南(中文版)
目录1 色谱柱使用寿命问：我的色谱柱进样大概100针后峰形变差了，踏板数很低，怎么回事？答：100针确实很少，一般情况下使用时间会长很多的。
首先我们要确认你的使用条件是不是导致色谱柱寿命下降的原因。
两种基本情况：1 在相同实验中以前使用的色谱柱寿命长很多2 在本实验中用过的所有的色谱柱在使用相同次数后全部损坏如果是第一种情况，应该检查一下实验是否保持一致。
样品的组成改变了吗？样品中强吸收的污染物会破坏色谱柱的柱效。
或者管路的密封圈是否完好？脱落的密封圈会堵塞色谱柱过滤器和填料的顶层，从而影响样品的分布。
如果可以确认色谱条件没有变化，那么可以推测是柱床松动的原因。
在实验室和运输过程中色谱柱剧烈的震动都会导致柱床松动。
（色谱柱有没有掉到地上？）或者也有可能使生产商的问题。
而且这种问题标准色谱柱检测中心是检测不出来的，只有在用过一段时间后才会显露出来。
这种情况生产商会免费替换色谱柱。
问：那些生产商真好，但是我的情况不是这样的。
我的色谱柱总是用不了多长时间。
有时候100针，有时候200针。
200针还可以忍受，但是100针太差了。
色谱柱开销太大了，我该怎么办？答：我完全同意你所说的。
我们必须要找到原因然后看看我们能做些什么。
最大可能是样品中的成分吸附在色谱柱的顶端。
可能是在流动相中不溶的沉淀物或者是强吸收的物质。
随着进样的增加这些污染物在色谱柱顶端累积，阻止样品正常吸附和扩散。
从而导致峰形变差。
通常这种问题和柱压升高同时出现。
问：嗯，可能就是这个原因。
我应该怎么避免这种问题呢？答：有几种方法可以采用。
一，采用合适的样品准备技术处理样品。
用和分析柱相似的固相萃取柱进行固相萃取（SPE：solid phase extraction）1效果很好。
另外一种非常有效的方法是使用保护柱。
保护柱是作为牺牲柱装在色谱柱前使用的，出现问题的时候就会被替换掉。
为了获得最好的分析效果，保护柱的填料和装填技术必须和分析柱一样。
如果用不同品牌的填料就不能获得最佳的分析性能和保护作用。
液相色谱基础知识(waters)
寿命 (小时)
Xterra: 快梯度分析
AU
0.00
0.10
0.20
Minutes
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
1.20
1.40
1.60
1.80
2.00
2.20
2.40
Waters特殊应用的色谱柱(1)
糖及其它碳水化合物的分析 离子交换柱(钙基/Ca) 用于单糖、双糖及糖醇等低分子量的糖、及乙醇等的分析。主要用于药厂维生素C的原料分析(sorbitol/mannitol-山梨醇/甘露醇)，酒厂(葡萄酒、啤酒等)的糖及乙醇含量的分析。 柱温~90℃，要求有柱温箱。对流动相(水)的要求较高，要求用户另置超纯水系统。 氨基类型柱 分析单糖、双糖及三糖等多糖的分析，最大到DP10。用途较为广泛，主要用于食品中糖的分析。 反相类型柱 硅胶类型柱 体积排除(凝胶/GPC)类型柱
色谱柱的联接
各种锥箍和管路接头长度示意图:
色谱柱的联接
Stop_depth长度不合适造成柱前死体积
色谱柱的联接
锥箍锥度不合适造成渗漏:
Waters色谱柱的联接
Waters及Phase Separations锥箍及螺母相同，但锥箍前露出的不锈钢管长度不同 其长度被称为：“stop-depth” Waters除Spherisorb以外的各种品牌的色谱柱用的是“Waters”标准，其stop-depth的长度为0.130英寸 Spherisorb品牌的色谱柱及Phase Separations公司的其他品牌色谱柱用的是“Parker-style”标准，其stop-depth为0.090英寸
测柱效-良好的色谱实验习惯
waters 压力过低 色谱柱堵
在分析主题“waters 压力过低色谱柱堵”时，我们首先要了解什么是waters、压力过低、以及色谱柱堵的概念和含义。
我们可以从这三个方面展开深入讨论。
1. Waters是一家专业从事科学仪器和化学品的公司，其产品涵盖了液相色谱仪、质谱仪、色谱柱等多个领域。
在科学研究和实验室工作中，Waters的产品被广泛使用。
压力过低和色谱柱堵都与液相色谱仪的运行状态和色谱分离过程有关。
2. 压力过低可能是由于设备故障、管路堵塞、泵的问题或者柱子不稳定等原因导致的。
压力过低会影响液相色谱仪的正常运行，进而影响分析结果的准确性。
及时发现并解决压力过低的问题对实验结果的可靠性至关重要。
3. 色谱柱堵可能是由于样品残留、固相填料老化或者柱子损坏等原因造成的。
色谱柱堵会导致分析分离效果变差甚至无法正常运行，严重影响实验结果的准确性。
及时更换或者清洗色谱柱、检查管路情况等是非常重要的。
结合以上三个方面的内容，我们可以撰写一篇关于“waters 压力过低色谱柱堵”的有价值文章。
在文章中，可以深入解释waters的产品的重要性，以及压力过低和色谱柱堵对实验结果的影响。
我们可以从简单到复杂，由浅入深地阐述这一主题，让读者能够更加深入地理解。
在文章结尾部分，我们可以对本文的主要内容进行总结和回顾，帮助读者全面、深刻和灵活地理解主题。
从个人观点来看，我认为及时检查和维护液相色谱仪，预防和解决压力过低和色谱柱堵的问题至关重要。
只有保证设备的正常运行和实验的准确性，才能让科学研究和实验工作更加顺利进行。
希望以上内容符合您的要求，如有需要，还请多加指导。
液相色谱技术是一种常用的分离和分析方法，具有高灵敏度、高分辨率和高选择性的优点。
在液相色谱仪中，色谱柱是一个非常关键的组成部分，它直接影响到色谱分离的效果。
色谱柱的堵塞会导致分析分离效果变差，严重影响实验结果的准确性。
及时发现和解决色谱柱堵的问题对于保证实验数据的可靠性非常重要。
色谱柱的堵塞可能是由于样品残留、固相填料老化或者柱子损坏等原因造成的。
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— 温度太高;流速太低 — 泵关闭或保险丝断了 — 泵未输送流动相 — 系统内有渗漏处 — 所用溶剂不正确
— 自动进样器在Purge时卡住
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8
HPLC系统压力问题分析(3)
问题:压力不稳
可能原因:
— 压力传感器问题 — 泵排气不充分 — 泵失效 — 流动相未正确脱气 — 所用溶剂不混溶或易挥发
o
保护柱脏,色谱柱被污染,分辨率下降
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26
额外的色谱峰
等度色谱：额外的色谱峰 - 尖锐 - 污染物
• 污染物来源：样品，样品瓶，瓶垫等
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额外的色谱峰
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3
HPLC实验中常见问题分类
HPLC系统压力问题
– 压力高
– 压力低或没有压力 – 压力不稳 流路基线噪音问题 – 基线不稳定 – 长、短程振荡 – 基线漂移
– 噪音脉冲尖刺
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4
关于色谱系统的反压 反压
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6
HPLC系统压力问题分析(1)
问题:系统压力高
可能的原因:
— — — — —
温度太低 流速太高 流动相粘度大 管路堵塞 仪器或色谱柱堵塞
—
压力传感器问题
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7
HPLC系统压力问题分析(2)
问题:压力低或没有压力
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2
判断故障与故障排除的原则
规则一∶确认问题至少发生两次以上。如果问题不重复出现，很 难证实其确实是问题
规则二∶从最简单的因素入手 规则三∶一次只变化一个因素，以使你能够确认所变因素与问题 之间的关联 规则四∶恢复原状。如果使用更换组件方法来查找问题之所在,完 毕后应将原有完好组件安装回原处。 规则五∶养成记录的好习惯。一个完整的好记录是成功地进行故 障排除的关键
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15
色谱柱状态—机械因素
填料平齐
填装良好的色谱柱
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好的色谱结果
表明:系统、色谱柱、连接状况皆良好
填装良好的色谱柱
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17
峰形问题:色谱柱塌陷
柱头有死体积Channeling
– 中性物质：无影响 – 酸性物质：pH增加，保留降低 – 碱性物质：pH增加，保留增加 – 0.1 pH的变化会导致高达10%的保留时间变化(pH在pKa +/- 1之内保留时 间变化最大)
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32
12
HPLC流路基线噪音问题分析(2)
基线漂移
o o o o o o
系统不稳或未化学平衡 温度波动 流动相未正确脱气 流动相被污染;流动相中有稳定剂或稳定剂变化 检测器流动池漏;系统中有渗漏 色谱柱污染;固定相渗漏
o
o
选用不正确的检测波长(相对于溶剂)
有迟流出的组分
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2
Minutes
4
6
注意：分析与制备之色谱峰的落点位于相同保留时间
20
峰展宽/体积过载
注意： 色谱峰起点相同
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21
峰展宽/体积过载
进样体积对色谱峰形的影响
10 µL
100 µL
300 µL 500 µL
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11
有规律的基线噪音
几乎都由色谱泵引起 泵头中有气泡 – 做泵排气并重做溶剂脱气 单向阀脏或失效- 清洗或更换之
柱塞杆密封垫漏液 - 更换
柱塞杆损坏 - 更换 混合问题- 增加系统体积 电噪音 - 改变电路，去除根源
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什么是反压(Back Pressure) –流动相流经管路及色谱柱时会有阻力,即所谓的反压, 又称系统压力 –Waters习惯用的压力单位是Psi(磅/平方英吋) –其它单位有:Bar,Mpa(1Bar=0.1Mpa=14.5Psi) 影响系统反压的主要因素: –流动相的溶剂组成 –温度 –流速
13
色谱峰常见问题分类
色谱峰常见问题主要有三类:
– 色谱峰峰形异常问题
o
例如负峰,宽峰,肩峰,双峰,峰形不对称等 色谱图未出峰,出峰比预想的多等 保留时间不稳定等
– 色谱图中多峰少峰问题
o
– 色谱峰保留时间问题
o
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14
色谱峰形问题的来源
色谱柱毁坏 溶解样品的溶剂不当 第二种相互作用 色谱柱过载 – 质量过载 – 体积过载 其它柱外效应 – 管路连接 – 采样速率 – 时间常数
保留时间增加或减少(各次运行之间)
o o o o o o
系统不稳定或化学平衡不足 泵流速变化 温度变化 色谱柱污染,柱效下降 流动相被污染 溶剂入口过滤器堵或管路堵塞
o
系统渗漏
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30
色谱峰保留时间问题分析(3)
保留时间改变到一个新的恒定值
o o o
填料塌陷
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18
色谱柱填料塌陷(产生死体积)
可能的原因: –振动使柱床破坏 –高 pH流动相使填料颗粒溶解 所有的峰都变形！
Voids - high back pressure, distorted and/or double peaks
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25
色谱图多峰少峰问题分析(2)
色谱图中出峰比预想的多(鬼峰)
o o o o o o
样品分解或制样时导入了杂质 流动相被污染,或用错流动相 流动相中含有稳定剂或稳定剂发生变化 前次进样的后流出物(某些Rt值特大的组分) 进样器被污染,洗针系统出问题或注射器脏 未充分平衡进样器Loop管
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5
影响色谱系统反压的因素 反压的影响因素
流动相的粘度是产生反压的主要原因,粘度越大,反压越高 流速对反压的影响是线性关系,流速越大,反压越高 温度对反压的影响是反比关系,温度升高,反压降低 反压与色谱柱长度成正比 反压与填料颗粒度的平方成反比 – 3.5μm填料比5μm填料反压高 反压与管路直径的四次方成反比 (1/D4) 反压与管路的长度成正比
峰展宽/浓度(质量)过载
当上样量超过一定限度时发生 – 注意峰起点提前
分析规模上样量 (6µ g)获得良好的 色谱峰形
进样6.25 µ g
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Absorbance Absorbance
2
Minutes
4
6
进样25 mg
制备规模上样量 (25 mg)产生质 量过载的色谱峰 形
等度色谱 - 宽峰 -- 来自以前的进样
28
色谱峰保留时间问题分析(1)
保留时间飘忽不定(各次运行之间)
o o o
系统不稳定或未达化学平衡 泵压力不稳(泵头里有气泡) 进样体积过大或样品浓度过大
o
o o
温度波动
流动相混合不均匀 色谱柱被污染
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29
色谱峰保留时检测器设置不正确,定量环(Loop)体积不正确
检测器输出未置零 用了不正确的检测器输出信号 检测池被污染 检测器的灯可能有问题
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色谱图多峰少峰问题分析(1)
色谱图中未出峰 o 进样问题:未进样或样品分解 o 流动相问题:泵未输液或流动相不正确 o 检测器设置不正确,或检测器有问题 色谱图中出峰比预想的少 o 样品分解 o 色谱柱柱效丧失 o 用错流动相 o 梯度洗脱时平衡不足
流动相不正确或其组成不正确 泵流速变化 实际输液的流速不正确(泵失灵或故障)
o
o o o o
环境温度变化；柱温不正确
色谱柱尺寸或类型不正确 色谱柱被污染 流动相含有稳定剂或稳定剂发生变化 输液系统的梯度滞后体积不正确
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31
保留时间重现性：pH的影响
化学因素
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9
HPLC流路基线噪音问题分析(1)
基线不稳定
o o o o o o
检测池中有大的气泡 流路中有小气泡流过 系统未稳定或未达到化学平衡 流动相被污染 检测器流动池漏 色谱柱污染
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10
无规律基线噪音
气泡-流动相脱气 气体滞留在检测器中 – 流动相脱气 – 对检测池加一定的反压 泄漏-修复泄漏，更换接头 混合问题-增加系统体积 管线阻塞 – 疏通管线，冲洗系统 电问题 – 改变电路，去除根源
22
峰展宽/柱外谱带展宽
连接管线内径对系统谱带展宽的影响 过长的管线亦会造成较大的谱带展宽 .009"