23 生物化学实验--二乙酰一肟显色法测定血清尿素氮

二乙酰一肟显色法测定血清尿素氮

【目的】

1. 掌握二乙酰一肟显色法测定血清尿素氮的实验方法。

2. 熟悉二乙酰一肟显色法测定血清尿素氮的实验原理。

3. 了解血清尿素氮测定的临床意义。

【原理】

在酸性条件下加热，稳定的二乙酰一肟水解成不稳定的二乙酰，后者与血清中的尿素反应合成红色的二嗪化合物，其颜色深浅与尿素含量成正比。与同样处理的尿素标准液比色可求得血清中的尿素含量。其反应式如下：

【器材】

1 ．血清；

2 ．微量移液器；

3 ．刻度吸量管；

4. 沸水浴；

5. 分光光度计。

【试剂】

1 ．血清

新鲜人或动物血清，无溶血。

2 ．酸性试剂（或称尿素氮试剂）

在三角烧瓶中加蒸馏水约 100ml ，再加浓硫酸 4ml 及 85% 磷酸 66ml 。冷至室温，加入氨基硫脲 50mg 及硫酸镉（CdSO 4 ·8H 2 O ） 2g （提高尿素与二乙酰反应灵敏度），溶解后用蒸馏水稀释至 1L 。置棕色瓶在冰箱保存。可稳定半年。

3 ．二乙酰一肟溶液

称取二乙酰一肟 20g 。加蒸馏水约 900ml ，溶解后，再用蒸馏水稀释至 1L 。置棕色瓶中，贮放冰箱内可保存半年不变。

4 ．尿素氮标准液（ 14mmol/L ， 19.6mg/dl ）

称取干燥纯尿素 4 2mg ，加少量蒸馏水溶解后，移入 100ml 容量瓶，加氯仿数滴防腐，再加蒸馏水至刻度，在冰箱中可稳定半年。如用 8mmol/L 苯甲酸溶液代替蒸馏水配制，此标准溶液防腐效果更好。

【操作】

取 3 支试管，标明测定管、标准管及空白管，按下表操作。

试剂（ ml ）测定管标准管空白管

血清0.02 - -

尿素氮标准液- 0.02 -

蒸馏水- - 0.02 二乙酰一肟溶液0.5 0.5 0.5

酸性试剂 5.0 5.0 5.0

混匀后，置沸水浴中加热 12min ，取出，置冷水中冷却 5min 后，用于波长540nm ，以空白管调 0 ，读取并记录标准管及测定管吸光度值。

【计算】

【注意事项】

1 ．本法线性范围达 40mg/dl 尿素氮，即吸光度 0.7 。果遇高于此浓度标本，必须用生理盐水作适当的稀释后重测，然后乘以稀释倍数为结果。

2 ．虽有氨基硫脲和镉离子，但仍有轻度褪色现象（每小时小于 5% ），故加热显色冷却后，应及时比色。

3 ．世界卫生组织推荐用 mmol/L 尿素表示，但我国仍习惯用尿素氮（ mg/dl 或mmol/L ）表示。二者换算关系是， 1mmol/L 尿素氮等于 1/2mmol/L 尿素，

1mg/dl 尿素氮等于 2.14mg/dl 尿素。

4 ．血清尿素氮的正常值参考范围为 3.6 ～ 14.2mmol/L 。

【思考题】

1 ．若肝功能正常，而肾功能下降时，血中尿素氮含量会发生怎样的变化？为什么？

2 ．将尿素氮换算成尿素时， mmol/L 浓度除以 2 ，而 mg/dl 浓度乘以 2.14 ，为什么？