《中国药典》2015年版微生物基本知识
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2015版中国药典微生物检验
• 注：方法选择原则：根据供试品理化特性和微生物限度 标准等因素选择。
培养基适用性检查
• 胰酪大豆胨琼脂：金黄色葡萄球菌、 枯草芽孢杆菌、铜 绿假单胞菌、白色 念珠菌、黑曲霉 • 胰酪大豆胨肉汤：金黄色葡萄球菌、 铜绿假单胞菌、枯草 芽孢杆菌 • 沙氏葡萄糖琼脂、玫瑰红钠琼脂 、白色念珠菌、黑曲霉。
中国药典2015年版相关培养基变化无菌检查法通则1101chp2010chp2015硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基改良马丁培养基胰酪大豆胨液体培养基tsb营养肉汤培养基胰酪大豆胨琼脂培养基tsa营养琼脂培养基沙氏葡萄糖液体培养基sdb改良马丁琼脂培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基sda培养基的适用性检查灵敏度检查无菌性检查中国药典2015年版相关培养基变化无菌检查法通则1101chp2010chp2015硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基改良马丁培养基胰酪大豆胨液体培养基tsb营养肉汤培养基胰酪大豆胨琼脂培养基tsa营养琼脂培养基沙氏葡萄糖液体培养基sdb改良马丁琼脂培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基sda培养基的适用性检查灵敏度检查无菌性检查非无菌产品微生物限度检查
菌数报告规则
• 2、薄膜过滤法：计数方法同平皿计数法，每 张滤膜上的菌落数应不超过100cfu。菌数报告 规则以相当于 1g、1ml或10cm供试品的菌落数 报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以﹤1报告 菌数（每张滤膜过滤1g、1ml或10cm 供试品 ），或﹤1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。 • 3、MPN法：记录每一稀释级微生物生长的管 数，从表3查对每1g或1ml供试品中需氧菌总数 的最可能数。
培养条件
• 描述方式：按计数方法适用性试验确认计 数方法进行供试品中需氧菌总数、霉菌和 酵母菌总数测定。 • 培养条件：胰酪大豆胨琼脂平板在30～ 35℃培养3-5天，沙氏葡萄糖琼脂平板在20 ～25℃培养5~7天；MPN法和供试品接种， 所有试验管在30～35℃培养3～5天。
药品的微生物限度检查
10ml
24～48h
紫红胆盐葡 萄糖平板
10-1
无菌落
18～24h
有菌落
报告未检出
10g/10ml/ 100cm2供试品
3.耐胆盐革兰阴性菌定量检查操作示意图
以TSB为稀释液制供试液
一定量 肠道增菌肉汤
20～25℃, 2h预增菌
1ml
24～48h
紫红胆盐 葡萄糖平板
报告结果
10-1
18～24h
（六）梭菌的检查
梭菌 增菌 培养 基
供试液的制备
书写检 验记录
哥伦比亚琼脂培养基分离
1.梭菌检查程序
无菌落生长
过氧化氢 酶试验
配培养基和稀释液
最终结果判断
有 菌 落
确证 试验
10g/10ml/ 100cm2供试品
2.供试品梭菌检查操作示意图
各10ml
分别接种
一份80℃保温10min后迅速冷却
10-2
10-31ml10-110-210-3
各管加1ml
查可能菌数表
9ml 稀 释 液
有/无菌落
（二）大肠埃希菌检查
大肠埃希菌作为检验供试品是否受粪便污染的指示菌。
2015年版《中国药典》规定经口及呼吸道服给药的制剂，每1g、1ml或10cm2不得检出大肠埃希菌。
TSB 增菌 培养
30℃～35℃
3～5d
1.平皿法
（1）基本程序：
数据 处理
结果观察与计数
书写检 验记录
平板 接种
需氧菌 的培养
供试液 的制备
配培养基和稀释液
倒置 培养 3～5d
30～35℃
TSA
不少于 0.1ml
24～48h
紫红胆盐葡 萄糖平板
10-1
无菌落
18～24h
有菌落
报告未检出
10g/10ml/ 100cm2供试品
3.耐胆盐革兰阴性菌定量检查操作示意图
以TSB为稀释液制供试液
一定量 肠道增菌肉汤
20～25℃, 2h预增菌
1ml
24～48h
紫红胆盐 葡萄糖平板
报告结果
10-1
18～24h
（六）梭菌的检查
梭菌 增菌 培养 基
供试液的制备
书写检 验记录
哥伦比亚琼脂培养基分离
1.梭菌检查程序
无菌落生长
过氧化氢 酶试验
配培养基和稀释液
最终结果判断
有 菌 落
确证 试验
10g/10ml/ 100cm2供试品
2.供试品梭菌检查操作示意图
各10ml
分别接种
一份80℃保温10min后迅速冷却
10-2
10-31ml10-110-210-3
各管加1ml
查可能菌数表
9ml 稀 释 液
有/无菌落
（二）大肠埃希菌检查
大肠埃希菌作为检验供试品是否受粪便污染的指示菌。
2015年版《中国药典》规定经口及呼吸道服给药的制剂，每1g、1ml或10cm2不得检出大肠埃希菌。
TSB 增菌 培养
30℃～35℃
3～5d
1.平皿法
（1）基本程序：
数据 处理
结果观察与计数
书写检 验记录
平板 接种
需氧菌 的培养
供试液 的制备
配培养基和稀释液
倒置 培养 3～5d
30～35℃
TSA
不少于 0.1ml
2015版中国药典四部微生物限度
2015版中国药典四部微生物限度中国药典是我国医药行业的重要规范，其中微生物限度是其中一个关键内容。
微生物限度是指药品中允许存在的微生物数量的上限。
它对药品的质量和安全性提出了严格要求。
2015版中国药典中明确了药品微生物限度的标准和方法，以保障药品的质量和使用的安全性。
一、微生物限度的定义和意义微生物限度是指在药品中存在的微生物数量的上限。
它是衡量药品质量和安全性的重要指标之一。
由于微生物对人体健康有潜在的危害，药品中过多的微生物污染可能导致药品的变质和降解，甚至引起严重的药品安全问题。
因此，微生物限度的控制是确保药品质量和安全性的关键步骤之一。
二、微生物的限度标准和分类微生物限度的标准和分类在2015版中国药典中得到了详细说明。
根据药品的特性和用途不同，微生物限度标准和分类也有所差异。
常见的微生物限度分类包括细菌总数、大肠菌群、霉菌和酵母菌等。
各类微生物的限度标准和方法在药典中都有详细描述，以确保药品的质量和安全性。
三、微生物限度的检测方法为了准确检测微生物限度，2015版中国药典提供了一系列的微生物检测方法。
常见的方法包括菌落总数的测定、大肠菌群的测定、霉菌和酵母菌的测定等。
这些方法要求检测人员具备专业的技术和操作能力，确保检测结果的准确性和可靠性。
四、微生物限度的控制措施为了保证药品的质量和安全性，生产企业需要采取一系列的控制措施来控制微生物限度。
这些措施包括原料和辅料的检验、生产环境的控制、生产工艺的严格执行和产品的质量控制等。
通过全面有效的控制措施，企业可以确保药品的微生物限度在合理的范围内，从而保证药品的质量和安全性。
五、微生物限度的意义和前景微生物限度的控制是保障药品质量和安全性的重要手段，它直接影响着人们的生命健康。
随着人们对药品质量和安全性的要求越来越高，对微生物限度的控制也越来越严格。
中国药典不断完善微生物限度标准和方法，为药品生产和使用提供了规范和指导。
未来，微生物限度的研究和控制将成为药品质量控制的重要方向。
2015版中国药典微生物限度解析
10ml；膜剂为100cm²；贵重药品、微量包
（MPN法） 1.3 计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用
性试验：菌种及菌液制备、培养基适用性检查 、计数方法适用性试验。 1.4 供试品检查：检验量、供试品检查 1.5 结果判断 1.6 稀释液、冲洗液及培养基
1.1 总则：
• 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温 细菌和真菌的计数。
• 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否 符合规定的微生物限度标准时，应按规定进行检 验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有 规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
30～35 ℃ 不超过3天
20～25 ℃ 不超过5天
每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿；接种量50~100cfu ； 同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。 结果判定：
若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落 平均数的70 %，且菌落形态大小与对照培养基上的菌 落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。
1.3 计数培养基适用性检查和供试品计 数方法适用性试验
• 供试品微生物计数中所使用的培养基应进 行适用性检查。
• 供试品的微生物计数方法应进行方法适用 性试验【10版：方法验证】， 以确认所 采用的方法适合于该产品的微生物计数。
• 若检验程序或产品发生变化可能影响检验 结果时， 计数方法应重新进行适用性试 验。
1.3.3计数方法适用性试验
1. 供试液制备 2. 接种和稀释 3. 抗菌活性的去除与灭活 4. 供试品中微生物的回收
– 平皿法 – 薄膜过滤法 – 最可能数法（MPN 法）
5. 结果判断
1.4 供试品检查
• 1.4.1检验量
– 检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml
（MPN法） 1.3 计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用
性试验：菌种及菌液制备、培养基适用性检查 、计数方法适用性试验。 1.4 供试品检查：检验量、供试品检查 1.5 结果判断 1.6 稀释液、冲洗液及培养基
1.1 总则：
• 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温 细菌和真菌的计数。
• 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否 符合规定的微生物限度标准时，应按规定进行检 验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有 规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
30～35 ℃ 不超过3天
20～25 ℃ 不超过5天
每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿；接种量50~100cfu ； 同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。 结果判定：
若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落 平均数的70 %，且菌落形态大小与对照培养基上的菌 落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。
1.3 计数培养基适用性检查和供试品计 数方法适用性试验
• 供试品微生物计数中所使用的培养基应进 行适用性检查。
• 供试品的微生物计数方法应进行方法适用 性试验【10版：方法验证】， 以确认所 采用的方法适合于该产品的微生物计数。
• 若检验程序或产品发生变化可能影响检验 结果时， 计数方法应重新进行适用性试 验。
1.3.3计数方法适用性试验
1. 供试液制备 2. 接种和稀释 3. 抗菌活性的去除与灭活 4. 供试品中微生物的回收
– 平皿法 – 薄膜过滤法 – 最可能数法（MPN 法）
5. 结果判断
1.4 供试品检查
• 1.4.1检验量
– 检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml
《2015版《中国药典》微生物检测与洁净室环境检测技术》-1
育
飞
天
教
育
微生物细胞结构示意图
• 细菌细胞结构图 •
教 真菌细胞结构图 天 飞
育
飞
天
教
育
微生物的五大共性
飞
天
教
育
1、体积小，面积大； 2、吸收多，转化快；
3、生产旺，繁殖快；
4、适应强，易变异； 5、分布广，种类多。
飞
天
教
育
细 菌 形 态 特 征
• 革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的细胞壁结构比较
天
教
育
试管
移液管
先用少许棉花塞于吸口端，然后用纸包好或装入金属吸 管筒内，于121℃高压蒸汽灭菌20min后烘干。
飞
天
教
育
培 养 基 的 基 础 知 识
溶
液体培养 基用滤纸 过滤，固 体培养基 用纱布块 中夹薄层 脱脂棉过 滤
化
校正酸碱度
（1）先将卵磷脂加入少量蒸馏水低温加 热溶解溶、再加吐温80混匀，，加入琼 脂，静置15分钟。
细胞壁结构 G＋ G－
飞
天
教
育
脂多糖（LPS）,包括脂
厚度 强度 糖类含量 脂类含量 磷壁酸 脂多糖
20－80nm 坚韧 约45％ 约2％ 无
10－15nm 疏松 约15％ 约20％ 有 有
蛋白A，核心多糖和特异
性多糖三个部分。LPS对 动物具有毒性作用，它 牢固地结合在细胞表面，
只在菌体融解时才释放，
非细胞类：病毒、亚病毒(类病毒、朊病毒)
飞
天
教
育
细菌（bacteria）
• 细菌是单细胞的原核微生物
• 细菌是所有生物中数量最多的一类，据估计，其总数约有 5×10的三十次方个。 • 细菌主要由细胞壁、细胞膜、细胞质、核质体等部分构成 • 根据形状分为三类，即：球菌、杆菌和螺形菌（包括弧菌、 螺菌、螺杆菌）
《中国药典》2015年版微生物计数法实例
SDA
试验二：需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的计数 （薄膜过滤法）
试验组
（样+菌）
• 取10g供试品加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，制成1:10的供试液，供试 液分装成7支试管，每支9.9mL，每管加0.1mL的菌液，使试管中含菌量不大于 100cfu/mL，吸取1mL进行薄膜过滤，用500mLpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗， 100mL/次，滤膜贴在相应的培养基上。每株试验菌每种培养基至少制备一张滤膜。
水不溶性非油脂类供试品
• pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或TSB溶解或稀释成1:10供试液。分散力较差的 供试品可在稀释液中加入表面活性剂如0.1%的聚山梨酯80，使供试品分散均匀。必要时进一步稀释。
油脂类供试品
• 取供试品加入无菌十四烷酸异丙酯使溶解，或与最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯80或其他无抑菌 性的无菌表面活性剂充分混匀。必要时进一步稀释。
1107 非无菌药品微生物限度标准（3/3）
1107 非无菌药品微生物限度标准----实例
微生物限度标准：需氧菌总数不得过103cfu/g，霉菌和酵母菌总数 不得过102cfu/g，金黄色葡萄球菌不得检出，铜绿假单胞菌不得检 出，大肠埃希菌不得检出，沙门菌不得检出，耐胆盐革兰阴性菌 应小于102cfu/g。
/
/
T/S
0.92
0.91
0.92
1.07
1.08
被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应 在0.5-2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。
实例：霉菌和酵母菌总数计数培养基适用性检查结果（SDA）
菌种
被检培养基菌落数 （T）
中国药典2015版 四部 9202 非无菌产品微生物限度检查指导原则
为更好应用非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法（通则1105）、非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法（通则1106）及非无菌药品微生物限度标准（通则110 7），特制定本指导原则。
非无菌药品中污染的某些微生物可能导致药物活性降低，甚至使药品丧失疗效，从而对患者健康造成潜在的危害。
因此，在药品生产、贮藏和流通各个环节中，药品生产企业应严格遵循GMP的指导原则，以降低产品受微生物污染程度。
非无菌产品微生物计数法、控制菌检查法及药品微生物限度标准可用于判断非无菌制剂及原料、辅料等是否符合药典的规定，也可用于指导制剂、原料、辅料等微生物质量标准的制定，及指导生产过程中间产品微生物质量的监控。
本指导原则将对微生物限度检查方法和标准中的特定内容及应用做进一步的说明。
1. 非无菌产品微生物限度检查过程中，如使用表面活性剂、灭活剂及中和剂，在确定其能否适用于所检样品及其用量时，除应证明该试剂对所检样品的处理有效外，还须确认该试剂不影响样品中可能污染的微生物的检出（即无毒性），因此无毒性确认试验的菌株不能仅局限于验证试验菌株，而应当包括产品中可能污染的微生物。
2. 供试液制备方法、抑菌成分的消除方法及需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法应尽量选择微生物计数方法中操作简便、快速的方法，同时，所选用的方法应避免损伤供试品中污染的微生物。
对于抑菌作用较强的供试品，在供试品溶液性状允许的情况下，应尽量选用薄膜过滤法进行试验。
3. 对照培养基系指按培养基处方特别制备、质量优良的培养基，用于培养基适用性检查，以保证药品微生物检验用培养基的质量。
对照培养基由中国食品药品检定研究院研制及分发。
4. 进行微生物计数方法适用性试验时，若因没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用而导致微生物回收的失败，应采用能使微生物生长的更高稀释级供试液进行方法适用性试验。
此时更高稀释级供试液的确认要从低往高的稀释级进行，最高稀释级供试液的选择根据供试品应符合的微生物限度标准和菌数报告规则而确定，如供试品应符合的微生物限度标准是lg需氧菌总数不得过10 3 cfu，那么最高稀释级是1：10 3 。
2015版中国药典微生物限度培训-2014
27
培养基
环境浮游菌、沉降菌及表面微生物监测用培养基一般采用胰酪大豆 胨琼脂培养基（TSA） 当监测结果有疑似真菌或考虑季节因素影响时，可增加沙氏葡萄糖 琼脂培养基(SDA)。
28
请根据报告内容更新
培养条件GBT 16293-2010 医工业洁净室（区）浮游菌的测试方法
USP1116 无菌工艺环境的微生物控制与监测
41
Presentation title in footer | 00 Month 0000
四、培养基体系
最突出的变化：微生物质控分类及培养基体系 2010版 分类依据 项目1 项目2 按微生物类别分 细菌数 营养琼脂 霉菌及酵母菌数 玫瑰红钠琼脂 2015版 按营养条件分 需氧菌总数 胰酪大豆胨琼脂（TSA） 霉菌及酵母菌总数 沙氏葡萄糖琼脂（SDA）
12
Presentation title in footer | 00 Month 0000
尘埃粒子监测
监测方法：参照GB/T 16292-2010 《医药工业洁净室（区）悬浮粒 子的测试方法》 监测设备：
空气尘埃粒子计数器，多为光散射粒子计数器
工作原理： 当取样气流中的尘埃颗粒通过计数器散射腔的光敏感区时，光 遇到粒子时发生散射，这些光脉冲信号经光电二极管转换成电脉冲 信号，电脉冲次数反映粒子数，脉冲幅值反映粒子的粒径。 一台仪器可同时测定多个粒径通道的粒子。
采样点
不得少于2个
14
请根据报告内容更新
采样量
15
请根据报告内容更新
尘埃粒子标准
16
请根据报告内容更新
容易被忽略的UCL值：
UCL的计算：平均值均值的95%置信上限，微粒每立方米 （粒/m3）
2015版中国药典微生物限度
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– ⑵ 水不溶性非油脂类供试品
• 取供试品， 用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨 缓冲液，或 pH7.2 磷酸盐缓冲液，或胰酪 大豆胨液体培养基制备成 1:10 供试液。 分散力较差的供试品，可在稀释液中加入 表面活性剂如 0.1%的聚山梨酯 80，使供 试品分散均匀。若需要，调节供试液 pH 值至 6～8。必要时，用同一稀释液将供 试液进一步 10倍系列稀释。
1.3.3计数方法适用性试验
1. 供试液制备 2. 接种和稀释 3. 抗菌活性的去除与灭活 4. 供试品中微生物的回收
– 平皿法 – 薄膜过滤法 – 最可能数法（MPN 法）
5. 结果判断
1.4 供试品检查
• 1.4.1检验量
– 检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml
或cm²）。
– 除另有规定外,一般供试品的检验量为10g 或
• 需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的 总菌落数（包括真菌菌落数）；
• 霉菌和酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上 生长的总菌落数（包括细菌菌落数）。
• 若因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌 和酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求，可 使用含抗生素（如氯霉素、庆大霉素）的沙氏葡 萄糖琼脂培养基或其他选择性培养基（如玫瑰红 钠琼脂培养基）进行霉菌和酵母菌总数测定。
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– ⑷需用特殊方法制备供试液的供试品
• 膜剂供试品 • 肠溶及结肠溶制剂供试品 • 气雾剂、喷雾剂供试品 • 贴膏剂供试品
1.4.2供试品检查
1. 平皿法
– 平皿法包括倾注法和涂布法。 – 除另有规定外，取规定量供试品，按方法适用性
试验确认的方法进行供试液制备和菌数测定，每 稀释级每种培养基至少制备2个平皿。 – 培养和计数 除另有规定外，胰酪大豆胨琼脂培养 基平板在30～35℃培养3~5天，沙氏葡萄糖琼脂 培养基平板在20～25℃培养5 ~7天， 观察菌落 生长情况,点计平板上生长的所有菌落数，必要时 可适当延长培养时间至7 天进行菌落计数并报告 。菌落蔓延生长成片的平皿不宜计数。点计菌落 数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌 数报告规则报告菌数。 – 若同稀释级两个平皿的菌落数平均值不小于15， 则两个平皿的菌落数不能相差1 倍或以上。
《中国药典》2015年版微生物测定修订情况
常州药检
一、微生物计数法
分别接种不大于100cfu的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球 菌、枯草芽孢杆菌菌液至胰酪大豆胨琼脂培养基平 板，每一试验菌株平行制备2个平皿，30～35℃培养 不超过3天。同时，用相应的对照培养基代替被检培 养基进行上述试验。 分别接种不大于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉菌液至 胰酪大豆胨琼脂培养基平板，每一试验菌株平行制备 2个平皿，30～35℃培养不超过5天。同时，用相应 的对照培养基代替被检培养基进行上述试验。
常州药检
一、微生物计数法 计数培养基适用性检查
菌种：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽 孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉，不得超过5代。
常州药检
一、微生物计数法
常州药检
一、微生物计数法
常州药检
一、微生物计数法
取其新鲜培养物用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或 0.9无菌氯化钠溶液制成适宜浓度菌悬液。黑曲霉制 备时在缓冲液或氯化钠溶液中加入0.05%（v/v）聚山 梨酯80。 菌液在室温下2小时内使用，2～8℃时可在24h内使用， 黑曲霉孢子悬液可2～8℃保存，在验证过的贮存期内 使用。
MPN法
常州药检
一、微生物计数法
平皿法：包括倾注法和涂布法。每株菌每种培养基 至少制备2个平皿，以算术平均值计算。使用涂布 法应采用适宜的方法使培养基表面干燥，且每个 平皿接种的供试液不少于0.1ml。
常州药检
一、微生物计数法
薄膜过滤法：一般取相当于1g（ml、10cm2）的供试 品，（若供试品中所含的菌数较多时，供试液可 酌情减量）加至适量稀释液中，混匀，过滤。用 适量冲洗液冲洗。 每株菌每种培养基至少制备一张滤膜。 同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。
常州药检
中国药典2015版-微生物限度检查解析
*
*
注*：限度未做统一规定。
控制菌
*
不得检出沙门菌 （10g） ； 耐胆盐革兰阴性菌应小 于104（1 g）
执行及制定标准的注意事项
执行范围： 生产、贮存、销售过程中的药品 药用原料、辅料 中药提取物、中药饮片 新药标准 进口药品标准复核 药品质量考察及仲裁
标准执行的注意事项： 药典标准出处：中国药典通则项下【微生
或菌株已无使用需要时应及时灭菌销毁”； • 管理：应有程序文件，包括申购、操作、转种传代、纯度特性确认记录，注明名称、标准号、
接种日期、代数、培养基和培养条件、保藏的位置和条件等。
环境
• 实验室的布局和运行 • 环境监测 • 清洁、消毒和卫生
设备
建立仪器设备管理制度 清洁保养制度 操作规程 使用、监控的记录
器、天平、量器等等） 3.供应商评估与现场审计 使用正确的、有严格质量保障的产品
《中国药典》2015年版-微生物限度标准修订解析
标准修订内容 修订思路1 《中国药典》2010年版一、二、三部限度标准的相关内容合并。 修订思路2 参考EP7.0，USP35，JP X V标准，修订中国药典的微生物限度标准。
胆盐革兰阴性菌应小102
不含豆豉、神曲等发酵 5×102 原粉
102
液体口服给药
制剂
含豆豉、神曲等
发酵原粉
103
102
不得检出大肠艾希菌 不得检出沙门菌
耐胆盐革兰阴性菌应小 于 101
固体局部给药 表皮或粘膜不完整
104
102
不得检出金黄色葡萄球
制剂
菌、
表皮或粘膜完整
103
102
铜绿假单胞菌 ；阴道、
药品微生物检验的现状与发展
《中国药典》2015年版微生物基本知识
(3)沙氏葡萄糖琼脂：白色念珠菌、黑曲霉。
微生物计数用培养基
2010版
2015版
1、营养琼脂用于细菌计数
2、玫瑰红钠用于霉菌和酵母菌计数
3、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂用于酵 母菌计数
4、菌液制备用稀释液：0.9％氯化钠 溶液
1、胰酪大豆胨琼脂和胰酪大豆胨肉汤用于需氧 菌总数测定
2、沙氏葡萄糖琼脂用于霉菌和酵母菌总数测定
▷ 活动区域的合理规划及区分，提高微生物实验操作的安全性和可靠 性。
控制菌项目变化
培养基体系 明显变化
无明显变化
2010版
大肠菌群 大肠埃希菌
沙门菌 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌
梭菌 白色念珠菌
2015版
耐胆盐革兰阴性菌 大肠埃希菌
沙门菌 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌
梭菌 白色念珠菌
《非无菌产品微生物限度检查： 微生物计数法》
试验菌
2010版
2015版
大肠埃希菌
铜绿假单胞菌
金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、
白色念珠菌、黑曲霉
白色念珠菌、黑曲霉
(1)胰酪大豆胨琼脂：金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞 菌、白色念珠菌、黑曲霉。
(2)胰酪大豆胨肉汤：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆 菌。
培养条件
2010版
2015版
细菌数：营养琼脂 30℃~35℃ 3天
霉菌及酵母菌数：玫瑰 红钠琼脂 23℃~28℃ 5天
需氧菌总数（TAMC）： 胰酪大豆胨琼脂
30℃~35℃ 3~5天
霉菌及酵母菌总数 （TYMC)：沙氏葡萄糖 琼脂
20℃~25℃ 5~7天
结果判断
计数方法
微生物计数用培养基
2010版
2015版
1、营养琼脂用于细菌计数
2、玫瑰红钠用于霉菌和酵母菌计数
3、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂用于酵 母菌计数
4、菌液制备用稀释液：0.9％氯化钠 溶液
1、胰酪大豆胨琼脂和胰酪大豆胨肉汤用于需氧 菌总数测定
2、沙氏葡萄糖琼脂用于霉菌和酵母菌总数测定
▷ 活动区域的合理规划及区分，提高微生物实验操作的安全性和可靠 性。
控制菌项目变化
培养基体系 明显变化
无明显变化
2010版
大肠菌群 大肠埃希菌
沙门菌 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌
梭菌 白色念珠菌
2015版
耐胆盐革兰阴性菌 大肠埃希菌
沙门菌 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌
梭菌 白色念珠菌
《非无菌产品微生物限度检查： 微生物计数法》
试验菌
2010版
2015版
大肠埃希菌
铜绿假单胞菌
金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、
白色念珠菌、黑曲霉
白色念珠菌、黑曲霉
(1)胰酪大豆胨琼脂：金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞 菌、白色念珠菌、黑曲霉。
(2)胰酪大豆胨肉汤：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆 菌。
培养条件
2010版
2015版
细菌数：营养琼脂 30℃~35℃ 3天
霉菌及酵母菌数：玫瑰 红钠琼脂 23℃~28℃ 5天
需氧菌总数（TAMC）： 胰酪大豆胨琼脂
30℃~35℃ 3~5天
霉菌及酵母菌总数 （TYMC)：沙氏葡萄糖 琼脂
20℃~25℃ 5~7天
结果判断
计数方法
2015版中国药典关于微生物检验有关变化的解读
2015版微生物检验有关变化情况解读
黑龙江省食品药品检验检测所
杨利红
目
录
1 2
3
概况及背景 标准修订内容
执行及制定标准的注意事项
4 5
标准与方法 国外药典的标准收载情况
一、概况及背景
参照欧、美药典中“微生物限度”相关内容的组织形 式，将原“微生物限度检查法”修订后拆分为3个附录， 并在药典会网站上公示： -1、非无菌产品微生物检查：微生物计数法（一、二、 三部相同） -2、非无菌产品微生物检查：控制菌检查法（一、二、 三部相同） -3、药品微生物限度标准（一部；二部同三部）
在2005版chp收载微生物限度标准的基 础上，眼用制剂修订为无菌要求；阴 道、尿道给药制剂增加白色念珠菌 的控制；增加了贴膏剂的控制菌检查。
二、标准修订内容
1、药典标准的修订思路 （1）三部药典的合并 现行2010版《中国药典》三部分在微生物限度标准有 重叠，一部多于二部、三部。
一部标准为 基础
二、标准修订内容
非无菌药用原料及辅料微生物限度标准中药提取物及中药饮片微生物限度标准
制剂类型
TAMC
TYMC
控制菌
药用原料及辅料
103
102
未统一要求
中药提取物
103
102
未统一要求
中药饮片
未统一要 未统一要 求 求
不得检出沙门菌(10g)，耐胆盐 的阴性菌应小于104(1g)
二、标准修订内容
（4）实验环境的重大修订 ①无菌检查环境洁净度规定 GMP2010年版对洁净度的规定及确认标准 无菌检查： 2010年版：应在洁净度10000级背景下的局部100级单向流 空气区域内或隔离系统中进行。 2015年版：应在洁净度B级背景下的局部A级单向流空气区 域内或隔离系统中进行。 ②微生物限度检查环境洁净度规定 微生物限度检查： 2010年版：应在洁净度10000级背景下的局部100级单向流 空气区域内进行。 2015年版：应在受控洁净环境下（不低于D级）的局部不 低于B级单向流空气区域内进行。
黑龙江省食品药品检验检测所
杨利红
目
录
1 2
3
概况及背景 标准修订内容
执行及制定标准的注意事项
4 5
标准与方法 国外药典的标准收载情况
一、概况及背景
参照欧、美药典中“微生物限度”相关内容的组织形 式，将原“微生物限度检查法”修订后拆分为3个附录， 并在药典会网站上公示： -1、非无菌产品微生物检查：微生物计数法（一、二、 三部相同） -2、非无菌产品微生物检查：控制菌检查法（一、二、 三部相同） -3、药品微生物限度标准（一部；二部同三部）
在2005版chp收载微生物限度标准的基 础上，眼用制剂修订为无菌要求；阴 道、尿道给药制剂增加白色念珠菌 的控制；增加了贴膏剂的控制菌检查。
二、标准修订内容
1、药典标准的修订思路 （1）三部药典的合并 现行2010版《中国药典》三部分在微生物限度标准有 重叠，一部多于二部、三部。
一部标准为 基础
二、标准修订内容
非无菌药用原料及辅料微生物限度标准中药提取物及中药饮片微生物限度标准
制剂类型
TAMC
TYMC
控制菌
药用原料及辅料
103
102
未统一要求
中药提取物
103
102
未统一要求
中药饮片
未统一要 未统一要 求 求
不得检出沙门菌(10g)，耐胆盐 的阴性菌应小于104(1g)
二、标准修订内容
（4）实验环境的重大修订 ①无菌检查环境洁净度规定 GMP2010年版对洁净度的规定及确认标准 无菌检查： 2010年版：应在洁净度10000级背景下的局部100级单向流 空气区域内或隔离系统中进行。 2015年版：应在洁净度B级背景下的局部A级单向流空气区 域内或隔离系统中进行。 ②微生物限度检查环境洁净度规定 微生物限度检查： 2010年版：应在洁净度10000级背景下的局部100级单向流 空气区域内进行。 2015年版：应在受控洁净环境下（不低于D级）的局部不 低于B级单向流空气区域内进行。
2015年版中国药典微生物限度检查法
1.1 总则：
• 环境： – 微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要 求。(在不低于GMP 现行版要求的D 级洁净环境 、局部洁净度不低于B 级的单向流空气区域内进 行)【10版：在环境洁净度10000级下的局部洁净 度100级的单向流空气区域内】。 – 检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染 ，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检 出。 – 单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监 测。
菌数报告规则
– 需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于 300cfu 的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜 选取平均菌落数小于100cfu 的稀释级，作为 菌数报告（取两位有效数字）的依据。取最 高的平均菌落数，计算1g、1ml 或10 cm² 供 试品中所含的微生物数。 – 如各稀释级的平皿均无菌落生长，或仅最低 稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小 于1 时，以﹤1 乘以最低稀释倍数的值报告菌 数。
1.4.2供试品检查
• 供试液制备 – ⑴ 水溶性供试品
• 取供试品，用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨 缓冲液，或pH7.2 磷酸盐缓冲液，或胰酪 大豆胨液体培养基溶解或稀释制成 1:10 供试液。若需要，调节供试液 pH 值至 6 ～8。必要时，用同一稀释液将供试液进 一步 10倍系列稀释。水溶性液体制剂也 可用混合的供试品原液作为供试液。
1.3.1菌液制备及使用
试验菌株 试验菌液的制备
金黄色葡萄球菌 〔CMCC(B) 26 003)〕
铜绿假单胞菌 〔CMCC（B)10 104〕 枯草芽孢杆菌 〔CMCC(B) 63 501〕 白色念珠菌 〔CMCC(F) 98 001〕
胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培 养基 【10版：营养肉汤或营养琼脂培养基】 30～35℃，18～24小时
微生物限度检查操作规程(中国药典2015版四部通则)
一、范围：本标准规定了微生物限度的检查方法和操作要求；适用于检品需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、控制菌的检查。
二、引用标准：《中国药典》2015年版(通则1105-1106)三、目录1．微生物限度标准2．设备、仪器及用具3．消毒液、稀释剂、试液及培养基4．检查总则（通则1105：非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法，通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法）5．微生物计数法检查6．控制菌检查法7．实验技术8. 附件1．微生物限度标准非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准*未做统一规定。
(1)．“—”为不得检出。
(2)．目测霉变者以不合格论。
说明：1．“—”为每100 cm中不得检出。
2．目测霉变者以不合格论。
3．“无”为标准依据或无相应规定。
2．设施、仪器及用具2.1、设施：2.1.1．微生物限度检查室及相关设施：微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
2.1.2．其他设备：高压蒸汽灭菌器；细菌培养箱（30~35℃）；霉菌培养箱（25~28℃）；电炉（或其他适宜的加热装置）；恒温水浴；电热干燥箱（250~300℃）；电冰箱。
生化试剂储存箱。
2.2仪器及器皿2.2.1．菌落计数器；显微镜（1500X）；电子天平或药物天平（感量0.1g）；pH系列比色计。
2.2.2．玻璃器皿：锥形瓶（250~300ml，内装玻璃珠若干）、研钵（玻璃或陶瓷制，∮10~12cm）、培养皿（∮9 cm）、量筒（100 ml）、试管（18×180mm）及塞、吸管（1ml分度0.01，10 ml分度0.1）、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）。
2.2.3新购的玻璃器皿的清洁：先用流水冲洗，浸泡于1%~2%盐酸（工业用）液中约2~6小时，除去游离碱质，再用流水冲洗。
用于化学分析的玻璃仪器，需用重铬酸钾清洁液浸泡数分钟后，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2~3次，晾干备用。
中国药典2015版微生物检测所用菌种和培养基
编号1 2 3 4 5 6
名称
胰酪大豆胨液体培养基(TSB)
胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)
沙氏葡萄糖液体培养基(SDB)沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA) 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA 玫瑰红钠琼脂培养基
硫乙醇酸盐流体培养基
肠道菌增菌液体培养基
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基
麦康凯液体培养基
麦康凯琼脂培养基
木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基
三糖铁琼脂培养基(TSI)
溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基(十六烷基三甲基溴化铵培养基)
甘露醇氯化钠琼脂培养基(甘露醇盐琼脂培养基
哥伦比亚琼脂培养基
梭菌增菌培养基
沙门菌增菌液体培养基
念珠菌显色培养基
用途
药品或生物制品中总需氧菌计数药品或生物制
品中总需氧菌计数药品或生物制品中真菌的
培养药品抑菌剂效力检测中真菌检测—
霉菌、酵母菌计数
霉菌、酵母菌计数
药品、生物制品无菌试验，和需氧菌、厌氧菌的培养
耐胆盐革兰氏阴性菌的增菌培养多
用于检验食物和动物饲料中的肠杆菌
肠道菌计数和肠杆菌科鉴别
肠道致病菌的增菌培养
肠道致病菌的选择性分离、培养—
沙门氏菌、志贺氏菌的选择性分离培养
肠杆菌糖发酵及硫化氢反
绿脓杆菌的选择性分离培养—
金黄色葡萄球菌选择性分离培养
梭菌的选择性分离培养
梭菌增菌培养
药品或生物制品中沙门氏菌选择性增菌
念珠菌分离和鉴定。
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USP36〈1227〉推荐 细菌及酵母菌计数范围:25250cfu/皿 霉菌计数范围：8-80cfu/皿
供试品检查部分 2、培养
2010版
（1）描述方式：计数方 法包括平皿法和薄膜过滤 法，检查时，按已验证计 数方法进行供试品细菌、 霉菌和酵母菌数测定。 （2）培养条件：细菌 30~35℃培养3天，霉菌和 酵母菌23~28℃培养5天， 必要时可适当延长7天。
2010版
无规定
2015版
例如：当标准为10cfu，不同于以往10cfu规定的以10的指数规 定标准，考虑了微生物计数结果的可变性，即计数结果的精密 度，而非类似化学检验结果。故要求我们需要在结果判断时或 制定内控标准时，对于结果的判断或历史数据的分析需要用风 险分析的手段进行评估。制定标准时需要依据历史数据，工艺 过程，用药人群等进行相应分析，制定合理的内控标准，即总 原则为在内控标准的控制下产品无任何质量风险。
简便、严谨
评价
微生物检测环境变化
2010版
检测环境 应在洁净度10000级背景 下的局部100级单向流空 气区域内进行
2015版
应在受控洁净环境（不低于 D级洁净环境）下的局部洁 净度不低于B级单向流空气 区域内进行
·其他要求：
▷ 检验过程及环境既要最大可能防止样品受污染，又要防止检验过程 对环境和人员造成的危害。 ▷ 活动区域的合理规划及区分，提高微生物实验操作的安全性和可靠 性。
白色念珠菌、黑曲霉于20~25℃培养不大于5天。与对照培养基 适用性检查 比较，恢复率在50%~200%之间。 枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌应不得生长。
计数方法适用性试验
1、常用的供试液制备方法 (1)水溶性供试品 (2)水不溶性非油脂类供试品 (3)油脂类供试品 (4)需要特殊方法制备供试液的供试品：①膜剂、②肠溶及结肠溶制剂、③ 气雾剂喷雾剂、④贴剂。
不含中和剂及灭活剂的相应稀释液 替代供试液，按试验组操作。 中和剂、灭活剂及表面活性剂的稀 释液中加入规定量菌液
接种和稀释
消除供试品的抑菌活性的方法
（1）增加稀释剂和培养基的用量； （2）加入中和剂或灭活剂； （3）采用薄膜过滤法和冲洗； （4）综合上述措施。
●根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则，在不影响
2010版
若营养琼脂培养基上长有霉 菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂 培养基上长有细菌，则应分 别点计霉菌和酵母菌、细菌 菌落数。然后将营养琼脂培 养基上的霉菌和酵母菌数或 玫瑰红钠琼脂培养基上的细 菌数，与玫瑰红钠琼脂培养 基中的霉菌和酵母菌数或营 养琼脂培养基中的细菌数进 行比较，以菌落数高的培养 基中的菌数为计数结果。
检验结果判断的前提下，应采用能使微生物生长的更高稀释级的 供试液进行方法适用性试验。若方法适用性试验符合要求，应以 该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检测。
培养条件
2010版
细菌数：营养琼脂 30℃~35℃ 3天
2015版
需氧菌总数（TAMC）： 胰酪大豆胨琼脂 30℃~35℃ 3~5天Fra bibliotek2015版
若因沙氏葡萄糖琼脂培养基 上生长的细菌使霉菌及酵母 菌的计数结果不符合微生物 限度要求，可使用含抗生素 （如氯霉素、庆大霉素）的 沙氏葡萄糖琼脂培养基或选 择性培养基（如玫瑰红钠琼 脂培养基）进行霉菌和酵母 菌总数测定。使用选择性培 养基时，应进行培养基适用 性检查。如采用MPN法，测 定结果为需氧菌总数。
供试品检查部分-结果判断
2010版
供试品的细菌数、霉菌数和酵母 菌数其中任何一个不符合该品种 项下的规定，应从同一批样品中 随机抽样，独立复试两次，以三 次结果的平均值报告菌数。
2015版
无相关内容描述。在实际操作过 程应依据附录9203药品微生物实 验室质量管理指导原则：结果的 判断和检测报告----异常结果出现 时，应进行偏差调查。
培养基适用性检查
2010版
检查范围
加菌量
2015版
微生物计数用的成品培养基、由脱水培 养基或按处方配制的固体和液体培养基
固体培养基
50~100CFU
不大于100CFU
培养温度 营养琼脂：30~35℃ 胰酪大豆胨琼脂TSA：30~35℃培养 玫瑰红钠：23~28℃ 胰酪大豆胨肉汤TSB： 30~35℃培养
微生物检查体系的调整
2010版
分类依据 质控分类 检验体系 项目1 按微生物类别分 细菌、真菌 选择培养、或者人为区分 细菌数 营养琼脂
2015版
按营养条件分 需气、厌气菌 直接与培养条件对应 需氧菌总数 胰酪大豆胨琼脂 （TSA）
项目2
霉菌及酵母菌总数 玫瑰红钠琼脂
容易造成漏检
霉菌及酵母菌总数 沙氏葡萄糖琼脂 （SDA)
试验菌
2010版
大肠埃希菌
2015版
铜绿假单胞菌
金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、 白色念珠菌、黑曲霉 白色念珠菌、黑曲霉
(1)胰酪大豆胨琼脂：金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞 菌、白色念珠菌、黑曲霉。 (2)胰酪大豆胨肉汤：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆 菌。 (3)沙氏葡萄糖琼脂：白色念珠菌、黑曲霉。
基于数据 分析和风 险评估制 定标准尽管未超 过标准规 定，但是 有风险。 -累积数 据，建立 风险评估 体系
《非无菌产品微生物限度检查： 控制菌检查法》
通用要求要点： (1)控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存 在特定的微生物。本检查法可采用替代检查方法，包括自动检测 法，但必须证明其替代方法等效于药典规定的检查方法。（9201） 药品微生物检验替代方法验证指导原则。 (2)供试液制备及实验环境要求同《非无菌产品微生物检查：微生物 计数法》参考USP〈1117〉实验室分区原则。 (3)前处理：供试品的抗菌活性，中和剂和灭活剂的有效性及无毒性。 表面活性剂的无毒性及与相容性。 (4)在各控制菌项下：生化实验和“应进行分离、纯化及适宜的鉴定 实验。”改为较少的生化实验或“采用其它适宜方法进一步鉴 定。”
需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的总菌落数（包括真 菌菌落数）；霉菌及酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长 的总菌落数（包括细菌菌落数）。若因沙氏葡萄糖琼脂上生长的细 菌使霉菌及酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求，可使用含抗 生素（如氯霉素、庆大霉素）的沙氏葡萄糖琼脂或选择性培养基 （如玫瑰红钠琼脂培养基）
供试品检查部分-计数标准
2010版
无规定
2015版
增加： 各品种项下要求执行的微生物限度标准解释如下： 101cfu为可接受的最大限度为20； 102cfu为可接受的最大限度为200； 103cfu为可接受的最大限度为2000；以此类推。 若供试品的需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数的检查结果均符 合该品种项下的规定，判供试品符合规定；若其中任何一项不 符合该品种项下的规定，判供试品不符合规定。
培养基适用性检查
培养基名称 沙氏葡萄糖琼脂+抗生素 （当细菌超标引起霉菌和酵母菌总数超标用） 无菌性检查 取已灭菌的SDA注皿，用于20~25℃培养5~7天，应无菌落生长。 抑菌性检查：枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 试验用菌种 促生长能力：白色念珠菌、黑曲霉 1、庆大霉素：广谱。对G-，G+菌有比较好的抗菌作用 常用抗生素 2、氯霉素：广谱。对G-菌作用强；对G+菌作用不及青霉素与 四环素。 接种方法 抑菌性：接种不小于100cfu试验用菌。 促生长能力：接种不大于100cfu试验用菌。
微生物计数用培养基
2010版
1、营养琼脂用于细菌计数 2、玫瑰红钠用于霉菌和酵母菌计数 3、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂用于酵 母菌计数 4、菌液制备用稀释液：0.9％氯化钠 溶液
2015版
1、胰酪大豆胨琼脂和胰酪大豆胨肉汤用于需氧 菌总数测定 2、沙氏葡萄糖琼脂用于霉菌和酵母菌总数测定 3、沙氏葡萄糖琼脂+抗生素用于细菌超标引起 霉菌和酵母菌总数超标用 4、菌液制备用培养基：PH7.0无菌氯化钠-蛋白 胨缓冲液或0.9％无菌氯化钠溶液
若采用上述方法还存在一株或多株试验菌的回收达不到要求， 那么选择回收最接近要求的方法和试验条件进行供试品检查。
MPN法的精密度和准确度不及薄膜过滤法和平皿计数法，仅在 供试品需氧菌总数没有适宜计数方法的情况下使用，本法不适 用于霉菌计数。
供试品检查部分 1、操作
2010版 2015版
按计数方法的验证试验确认 按照计数方法适用性试验确 的程序进行供试液的制备， 认的计数方法进行供试品中 用稀释液稀释成1:10、1:102、需氧菌总数、霉菌和酵母菌 1:103等稀释级的供试液 总数的测定。
控制菌项目变化
培养基体系 2010版
大肠菌群
大肠埃希菌
2015版
耐胆盐革兰阴性菌
大肠埃希菌 沙门菌
明显变化
沙门菌
铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌
梭菌
铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌
梭菌 白色念珠菌
无明显变化
白色念珠菌
《非无菌产品微生物限度检查： 微生物计数法》
通用要求要点： (1) 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。 本 检查法可采用替代检查方法，包括自动检测法，但必须证明其替代方法 等效于药典规定的检查方法。（9201）药品微生物检验替代方法验证指 导原则 (2) 环境洁净度应符合要求。定期检测：不低于B级的单向流空气区域、工作 台面、环境。参考USP〈1117〉实验室分区原则。 (3) 前处理：供试品的抗菌活性，中和剂和灭活剂的有效性及无毒性。表面 活性剂的无毒性及与相容性。 (4) 方法选择：根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择。（平皿 法、薄膜过滤法和MPN法） (5) 菌种管理：（9203）药品微生物实验室质量管理指导原则关于菌株管理 的要求。 (6) 阴性对照：微生物检查需进行阴性对照试验。如果对照有菌生长，应进 行偏差调查。