葡萄糖氧化酶生物传感器的构建和性能研究

７ ０磷酸缓冲液 中， ． 再加入 １ｍＬ３ ０ ． ％苯 酚。溶 液 Ｂ：． ％ ６５ 葡 萄糖溶液 。 葡萄糖 氧化 酶 酶活 力 单 位 （ 定 义 为 ： 分钟 氧 化 １ ｕ） 每
。
本文筛选了几种不同类型的材料作 为固定化酶 的载体 ，
［ 金 项 目］ 国家 “ ６ ” 目 （０ １ Ａ ２ １ ） 基 ８３ 项 ２ １Ａ Ｏ Ａ１４
１２ １ 酶 的 固定 化 利 用 打 孑 器 将 各 种 膜 切 割 成 直 径 为 ９ ． ． Ｌ
－
３１ ・ ２
优 化 载 体 及 戊 二 醛
交联 固定化条件 ， 制备性 能 良好 的葡萄糖氧化酶酶膜 ， 究固定化酶 的性 能并用于构 建葡萄糖传感 器。结果 固定化 葡 研
萄糖 氧 化 酶 的 最 适 催 化 温度 为 ４ ０℃ 、Ｈ 为 ７ ０ 葡 萄糖 生 物传 感 器 的 响 应 时 间 小 于 ２ ， ０～１５ｇ・ 葡 萄 糖 浓 度 ｐ ．； Ｏｓ在 ． Ｌ
Ｋｅ ｒ ｓ Ｇ ｕ ｏ ｅ ｏ ｉ ａ ｅ Ｉ ｙ ｗｏ ｄ ： ｌ ｃ ｓ ｘｄ ｓ ；ｍｍｏ ｉ ｚ ｔ ｎ Ｇ Ｕ Ｏ ｅ ｄ ｔｒ ｎ ｔ ｎ ｂ ｏ ｅ ｓ ｒ ｂ ｌ ａｉ ； １ Ｏ Ｓ ｅｅ ｍｉ ａｉ ｉ ｓ ｎ ｏ ｉ ｏ ｏ
葡萄糖 的定量测 定在 临床 医学 、 生物 化学 、 品科学 等 食
测 范 围 普 遍 较 小 ， 应 时 间 较 长 且 抗 干 扰 能 力 较 弱 －］这 响 ６，
ｆ ｍＡｐｒｉｕ ｎ ｅ，０ ・ ｇ ） 于 Ｓｇ 公 司 ， 血 清 ｒ ｏ ｓ ｇｌｓ ｉ ｒ１０Ｕ ｍ 购 ｅ ｌ ｇ ｉ ｍａ 牛 白蛋 白（ Ｓ ） ２ ％ 戊 二醛 购 于 上 海 生 工 生 物 工 程 有 限 公 ＢＡ 和 ５
１ ． ０００
依次吸取 １ ５
葡 萄糖 氧化酶 （ Ｏ 溶 液 ， Ｇ Ｄ） ４
牛 血
清 白蛋 白（ Ｓ 溶液 于 １ｍ Ｂ Ａ） Ｌ离心管 中混合均匀 ， 然后加入 １
戊 二 醛 溶 液 迅 速 混 匀 ， ２ 。吸 取 混 合 液 于 预 处 理 过 共 ０
差 ８ ｏ ＿ ０ 器０ ６ ． ｏ
ｏ ｎ ． ｒ ｓ ｅ ｔ ｅｙ Ｔ ｅ ｒ ｓ ｏ ｓ ｍｅ ｏ ｌ ｃ ｓ ｉ ｓ ｎ ｏ ｓｌｓ ｈ ｎ ２ ， ｅ ｌ ｅ ｒｒ ｎ ｅ ｏ ｌ ｃ ｓ ｏ ｃ ｎ ｒｔ ｎ ｗａ Ｃ ａ ｄ ７ ０，ｅ ｐ ｃｉ ｌ ． ｈ ｅ ｐ ｎ ｅ ｔ ｆ ｕ ｏ ｅ ｂ ｏ ｅ ｓ ｒ ｖ ｉ ｇ ｗａ ｅ ｓｔ ａ ０ Ｓ ｔ ｉ ａ ａ ｇ ｆ ｕ ｏ ｅ ｃ ｎ ｅ ｔａｉ ｓ ｈ ｎ ｇ ｏ ０ ～１ ５ ｇ ・Ｌ ． ． ｎ ａ ｉｈ ａ ｔ —ｉｔ ｒ ｒ ｎ ｅ ａ ｄ ｓａ ｉ ｔ ． ｎ ｌ ｓｏ Ｔ ｅ ｉ ｔｇ ａｅ ｌ ｃ ｓ ｅ ｅｍｉａ ｉｎ ｂｏ ｅ ｓ ｒｈ ｄ ａ ｄ ｈ ｄ ｈ ｇ ｎ ｉ ｎ ｅ ｅ ｅ ｃ ｎ ｔ ｂｌ ｙ Ｃｏ ｃｕ ｉ ｎ ｆ ｉ ｈ ｎ ｅ ｒ ｔｄ ｇｕ ｏ ｅ ｄ ｔｒ ｎ ｔ ｉｓ ｎ ｏ ａ ｏ
４０ Ｏ ． ２０ ０ ．
的膜片上 ， 布均匀 后置 于 ４ｏ 静置 反应过夜 。取 出置 于 涂 Ｃ，
００ ｏ ・ ．５ｔ ｌ Ｌ～， Ｈ ７ ０磷 酸 缓 冲 液 中 浸 泡 并 振 荡 洗 去 未 固 ｏ ｐ ．
定 的酶 。
Ｏ 尼龙 膜 ． ０
鸡 蛋壳膜
混纤膜
聚碳酸酯膜
ｃ ｒｉ ｒ ｎ ｔ ｅ ｉ ｍｏ ｉｉａｉｎ ｃ ｎ ｉｉ ｎ ｆｇｕ ａ ａ ｃｏ ｓ— ｌｎ ｎ Ｔｈ ｈ ｒ ｃｅ ｉｔ ｆｉ ｍｏ ｉｉｅ ｎ ｙ ｓ ｓｕｄｅ ａ ａ ｒｅ ｓａ ｄ ｈ ｍ ｂ ｌ ｔｏ ｏ ｄ ｔｏ ｓ ｏ ｌｔ ｒｌ ｒ ｓ ｚ ｉ ｋｉｇ． ｅ ｃ ａ ａ ｔｒｓｉ ｏ ｍ ｃ ｂ ｌ ｄ ｅ ｚ ｍｅ ｗａ ｔ ｉｄ， ｎｄ ｚ ｕ ｅ ｏｃ ｎ ｔｕｃ ｌ ｃ ｓ ｉ ｅ ｓ ｒ Ｒｅ ｕｌｓ Ｔｈ ｐ ｉ ｌｃ ｔ ｌｔｃｔ ｍｐ ｒ ｔ ｅ ａ ｄ ｐＨ ｆｉ ｍｏ ｉｉａｉｎ ｇ ｕ ｏ ｅｏ ｉ ａ ｅ ｗｅ ｅ４ ｓ ｄ ｔ ｏ ｓｒ ｔｇ ｕ ｏ ｅ ｂｏｓ ｎ ｏ ． ｓ ｔ ｅ ｏ ｔｍａ ａ ａｙｉ ｅ ｅ ａｕｒ ｎ ｏ ｍ ｂｌｚ ｔｏ ｌ ｃ ｓ ｘ ｄ ｓ ｒ ０
Ｃｏ ｔ ｕ ｔｏ ｄ ｅ ｆ ｒ ａ ｅ ｓｕ ｎ ｌ ｏ ｅ ｄｅ ｅ ｍｉ ｔｏ ｏ ｅ ｏ ｎｔ ｇ ａｔｄ ｎｓｒ ｃ ｉ ｎ ａｎ ｐ ｒ ｏ ｍ ｎｃ ｔ ｄｙ ｏ ｇｕｃ ｓ ｔ ｒ ｎａ ｉ ｎ ｂｉ ｓ ｎｓ ｒ ｉ ｅ ｒ ｅ
ｗ ｉｈ ｉ ｍ ｏ ｌｚ ｄ ｌ ｃ ｓ ｘｉ ｓ ｔ ｍ ｂｉ ｅ ｇ ｕ ｏ ｅ ｏ ｄａ ｅ ｉ
司， 聚碳酸酯膜 （ ． ｍ） ０２ 购于 Ｗｈｔ ａ ａｍ ｎ公 司， 醋酸 一硝酸混
合 纤 维 素 滤膜 （ ．２ ｍ、．５ ｐ ０ ８ ｍ） 购 于 上 海 兴 亚 ０ ２ ０４ ． ． ｍ、 ， 净 化 材 料 厂 ， 龙 ６ 微 孔 滤 膜 （ ． ２ ｍ、 ． ５ ｔ ０ ８ 尼 ６ ０ ２ ０ ４ ｚ ｍ、 ． Ｉ ， 于 杭 州科 诺 过 滤 器 材 有 限 公 司 ， 蛋 壳 膜 自制 。 ｘ ｍ） 购 鸡
萄糖 氧化酶膜的葡萄糖 生物传感 器的性能及其 应用 。
１ 材 料 和 方 法
１１ 实验材料 ．
葡 萄 糖 氧 化 酶 （ Ｏ Ｅ ． ． ． ， ｙｅ Ｇ Ｄ， Ｃ １ １３ ４ ． ｐ Ⅶ ｒ
快 、 择性好 、 选 体积小 、 易操作等 优点 ， 受到众 多研究 者 的重
视 。目前 ， 葡萄糖生物传感器的研究 日益增多 ， 但是其检
１２ 实 验 方 法 ．
些缺点使其在实 际检测应 用 中受到 限制较 多。提高 该传感
器 的 检 测 范 围和 灵 敏 度 是 亟 待 解 决 的 问 题 。 其 中 ， 为 葡 萄 作 糖 生 物 传 感 器 重 要 组 成 元 件 — — 固 定 化 葡 萄 糖 氧 化 酶 是 影
响传感器性能的重要因素
ａ ｔ ｒ ｔ ｆｂｏ ｅ ｓ ｒ Ｍ ｅ ｈ ｄ Ｐ ｅ ａ ｅ ｍｍｏ ｉ ｚ ｄ ｇｕ ｏ ｅ ｏ ｉ ａ ｅ ｗｉ ｏ ｄ ｐ ｒ ｒ ｎ ｅ ｂ ｐ ｉ ｚｎ ｈ ｍｍｏ ｉ ｚ ｄ ｃｅ ｉ ｉ ｏ ｉ ｓ ｎ ｏ ． ｓｃ ｔｏ ｓ ｒ ｐ ｒｄ ｉ ｂ ｌ ｅ ｌ ｃ ｓ ｘ ｄ ｓ ｔ ｇ ｏ ｅ ｏ ｍａ ｃ ｙ ｏ ｔ ｉ ｈ ｆ ｍｉｉｇ ｔ ｅ ｉ ｂｌ ｅ ｉ
范围内有 良好 的线性 ， 具有很 强抗干扰 和稳 定性 。结论
定。
该 葡萄糖 生物传感 器性能 良好 ， 可用于 生物 样品 中葡萄糖 测
关 键 词 ： 萄糖 氧 化 酶 ； 葡 固定 化 ； 萄糖 测 定 传 感 器 葡
中 图分 类 号 ： ５ ． 文献 标 识 码 ： 文 章 编 号 ：６ ２— ７ ８ ２ １ ０ ０ １ ０ ０６ ８ ９ Ａ １ ７ ７ ３ （ ０ ２） ６— ３ １— ５
（． １ 南京林业 大学森林资 源与环境 学院， 江苏 南京 ２ ０３ ；． 江大学化 学工程与 生物 工程 学系， １０ ７ ２ 浙 浙江 杭 州 １０ ７ Ｉ ０２ ） ３
摘要 ： 目的 以 固定化 葡 萄糖 氧化 酶 酶 膜 构 建 葡 萄糖 生 物 传 感 器 ， 并对 其 性 能进 行 评 价 。方 法
领域有极其重要 的作 用。可 以用分光 光度 法 、 流测 定法 、 电
在不同条件下通过交联法固定葡萄糖氧化 酶 ， 以期 获 得 高 比 活 、 稳 定 性 的葡 萄 糖 氧 化 酶 膜 。并 着 重 研 究 基 于 固 定 化 葡 高
高效液相色谱 法 、 极谱 法 及 毛细 管 电泳 法等测 定 葡 萄糖含 量…， 但是 ， 这些 方法 有的需要 复杂的前 处理过程 ， 分析速度 慢， 仪器设备成本较 高 ，ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ而生 物传感 器法 由于具 有检 测速度
和 ３ ５ｍ ． ｇ４一氨 基 安 替 吡 啉 ， 于 ２ Ｌ０ ２ｍ ｌ・ ～， Ｈ 溶 ０ ｍ ． ｏ Ｌ ｐ
料为载体时固定化 酶活最高 ， 其次是 孔径 为 ０４ ｍ 的， ．５ 孔 径为 ０ ８ ｍ的固定化 效果最差 ， 明孔 径大 的膜 表面 可 固 ． 说
定 化 的 蛋 白量相 对 较 少 ， 是 以孔 径 为 ０ ２ ｍ 的 材 料 为 载 但 ．２
齐 鲁 药 事 ・Ｑｌ Ｐ ａ ａ ｕｃ ｆｉ ２ １ ｏ ３ ， ． ｉ ｈｒ ｃ ｔ ｌ ａｓ ０ ２ Ｖ１ １Ｎｏ６ ｕ ｍ ｅｉ Ａ ｒ ａ ．
・
３１１ ・
・
药物研究 ・
葡 萄 糖 氧 化 酶 生 物 传 感 器 的 构 建 和 性 能 研 究
韩文 彪 ， 蔡 谨 石 ， 瑞 黄 ， 磊 徐 志 南 ，
Ａ ｓｒｃ ： ｊｃｉｅ Ｔ ｏｓ ｕｔ ｌｃｓ ｅ ｒ ｉａｏ ｉ ｅｓｒ ｉ ｍ ｂｌｅ ｌｃｓ ｉ ｓ ｎ ｖｌａｅ ｈ ｈｒ ｂｔａ ｔ０ｂｅｔ ｏｃｎｔ ｃ ｇｕｏｅｄｔ ｍｎ ｔｎｂｏ ｎｏ ｔ ｉ ｏｉｚｄｇｕｏｅｏ ｄ ｅａ ｄｅａｕｔ ｔｅｃａ— ｖ ｒ ｅ ｉ ｓ ｗｈｍ ｉ ｘａ
ｇ ｏ ｅ ｏｍ ａ ｅ ａ ｄ ｃ ｎ ｂ ｅ ｏ ｈｅ ｄ ｔｒ ｎ ｔｏ ｆｇｕｃ ｓ ｎ ｂ ｏｏ ｉａ ａ ｌ ｓ ｏ ｄ ｐ ｒ ｒ ｎｃ ｎ ａ ｅ ｕｓ ｄ ｆ ｒｔ ｅｅ ｍｉ ａ ｉｎ ｏ ｌ ｏ ｅ ｉ ｉｌ ｇｃ ｌｓ ｍｐ ｅ ． ｆ
齐鲁 药 事 ・Ｑｌ Ｐ ａ ａ ｕｃ Ａ ａｓ ０２ Ｖ１ １Ｎｏ６ ｉ ｈｒ ｃ ｔ ｌ ｆｉ １ ｏ ３ ， ． ｕ ｍ ｅｉ ａ ｒ２ ．
１ ０． ２ ０
ｍ 的 圆 片 （ 积 Ｓ＝ ．３ ｍ ） 分 别 用 ０ １ｍ ｌ Ｌ ｐ ｍ 面 ０ ６５９ｃ ， ． ｏ ・ ～，Ｈ ７ ０的磷 酸 缓 冲液 浸 泡 清 洗 ， 出用 蒸 馏 水 冲洗 干 净 ， 干 ， ． 取 晾 备用。
ＨＡ Ｗｅ —ｉｏ ， Ａ ｉ。 Ｓ ｕ ＨＵ ＮＧ Ｌ ｉ， Ｎ ｎ ｂａ Ｃ ＩＪｎ ， ＨＩＲ ｉ ， Ａ ｅ ＸＵ ｈ —ａ Ｚ ｉｎ ｎ
（ Ｃ ｌｇ ｏｅ ｅ ｕｃｓａ ｄＥ ｖ ｏ ｍ ｎ ｃ ｎｅ Ｎ ｎｉ ｏｅｔ ｎｖｒｔ， ａｆ ｇ２ ０ ３ ， ｈｎ ； ． ｏ ｅｅｏ Ｆ ｒ ｔ ｓ ｒ ｎ ｎｉ ｎ ｅｔ ｉ ｃ， ａｊ ｇＦ ｒ ｒ Ｕ ｉ ｓｙ Ｎ ｎ ｎ １ ０ ７ Ｃ ｉａ ｌ ｆ ｓＲ ｏ ｅ ｒ Ｓｅ ｎ ｓｙ ｅｉ ｉ ２ Ｄ ｐ ｒ ｅｔ ｈｍ ｃｌ ｎ ｉｌ ｉ ｌ ｎ ｉｅｒ ｇ Ｚ ｅａ ｇ Ｕ ｉ ｒｔ ， ａ ｇｈ ｕ３ ０ ２ ，ｈｎ ） ． ｅａｔ ｎ ｏ Ｃ ｅ ｉ ｄＢｏ ｇｃ ｇｎｅ ｎ ， ｈ ｉ ｎｖ ｓｙ Ｈ ｎ ｚｏ １ ０ ７ Ｃ ｉａ ｍ ｆ ａａ ｏ ａＥ ｉ ｊｎ ｅｉ
１ ２２ 酶活测定 ．．
酶 活性测 定 ： ３ 取 ５℃预 保温 的 １５ ｍ ． Ｌ
载体材 料
图 ２ 载 体 材 料 对酶 固定 化 的 影 响
溶 液 Ａ 和 １ ５ｍ ． Ｌ溶 液 Ｂ， １ ｍ 比色 皿 中混 合 ， 入 一 定 量 于 ｅ 加
溶液酶 或剪碎 的固定 化酶膜 ， 温反应 ２ｍ ｎ 测定其在 ５ ０ 保 ｉ， ０ ｎ ｍ处的吸光值 。其 中 ， 溶液 Ａ： 称取 ３５ｍ 辣根过氧化物酶 ． ｇ