葡萄酒微生物

1. 绪论葡萄酒微生物学研究现状与发展趋势
2. 谈谈葡萄酒微生物的作用

第二章
1.酵母菌的基本特征
①个体一般以单细胞状态存在；
②多数以出芽方式繁殖，也有的可进行裂殖或产子囊孢子；
③能发酵多种糖类；
④细胞壁常含有甘露聚糖；
⑤喜在含糖较高、酸性的环境中成长。
2.酵母菌的形态
酵母菌为单细胞真菌，无鞭毛、不运动。形态主要有球形、椭圆形、卵形、柠檬形和腊肠形，有的酵母能产假菌丝，有的则产真菌丝。酵母菌比细菌大，大小一般为（1～10） ×（5～30）um。
3.酵母菌的细胞结构 ：
真核生物，有细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核、液泡、内质网、核糖体、线粒体及各种贮藏物。
4.酵母菌的繁殖方式
①无性繁殖（营养繁殖） 是大多数酵母的主要繁殖方式。①出芽生殖 分为多边芽殖和两端芽殖。②裂殖
②有性繁殖 有些酵母菌可以以形成子囊孢子的形式进行有性繁殖。产生子囊可分3种方式：同形结合、异形结合、孤雌生殖。
5.酵母细胞的典型结构（图）
6.酵母菌的鉴定方法
首先要收集酵母的形态学特征（细胞形态及繁殖方式，是否具有真、假菌丝以及形态；子囊孢子的特征；培养特征）和生理学特征（糖类发酵，对不同碳源和氮源的利用能力） 等方面的信息，然后检索酵母鉴定表，先对酵母的出芽方式，然后对分离株利用糖和氮源能力差别进行区分。
7.与葡萄酒和葡萄汁相关酵母的鉴定指标
①细胞形态：理想状态是将新分离的待鉴定菌株转移到营养充足的液体培养基培养，然后在25℃条件下培养72小时（或直到菌落形成），然后镜检。在葡萄酒生产条件下，对绝大部分种的酵母的形态观察需要3～4d，而酒香酵母和德克氏酵母的形态鉴定则需更长时间。在显微镜下对细胞形状（球形、椭圆形、卵形、腊肠形、柠檬形等）、相对大小以及出芽方式进行观察。
②菌落颜色：琼脂培养基上典型的菌落颜色是不透明的奶油色。红酵母产肉红色的菌落；黑酵母为淡黄色→褐色→橄榄绿→黑色，菌落呈粘胶状，边缘呈手指状。
③营养繁殖：在葡萄酒和汁中，出芽繁殖是唯一的增殖方式。出芽繁殖方式有多边芽殖（酵母属酵母的特征）和严格的顶端芽殖（柠檬形酵母的特征），偶尔见裂殖酵母（如栗酒裂殖酵母）。
④假菌丝形成
⑤有性繁殖（子囊孢子形成）：能生成有性孢子的酵母为完全酵母，子囊孢子的形态对酵母鉴定也具有重要价值，包括孢子形状（球形、帽形、盔形、土星形、月牙形、椭圆形等）、每个子囊中孢子的数目、孢子的表面饰物（边缘、环、

疣状物等）和颜色、子囊的物理特性（
如是否易破碎）。
⑥氮源和碳源同化：酵母分离株能（或不能）氧化利用单个氮源和碳源的能力，在酵母鉴定中最常用。
8.酒精发酵过程中酵母菌种类的变化。
①在不添加二氧化硫的情况下，野生酵母迅速繁殖，起初哪种酵母群首先大量增殖取决于原料葡萄上野生酵母菌群的构成比例及初始菌数。KA群和T群酵母繁殖（最初阶段）→ S群酵母成为发酵的优势菌群（发酵力强）→酿酒酵母独霸天下（发酵结束后）。
②在添加二氧化硫（50-100mL）的情况下，野生酵母受杀伤，S群有耐受性，很快恢复活性，2-3天后开始发酵。如在S群酵母恢复活性前，游离二氧化硫降低到10mg╱L左右时（约8～12小时之后）加入纯培养的酵母，它们会在1-2天后就开始发酵，并占压倒优势（95%以上）。
添加二氧化硫比不添加时向S群酵母转换速度快。
9.酒精发酵过程中酿酒酵母的数量变化
①迟滞期：当酿酒酵母进去新的环境中后，群体生长首先经过一个迟滞期，长短为数分钟到数小时不等。在该阶段酵母通过测试环境条件是否适合其生长。
②快速繁殖期：如果条件适宜，在迟滞期末期，酵母开始快速繁殖。在良好的生长条件下，酵母繁殖力惊人，细胞数呈对数增加。
③稳定期：当培养液中酵母菌密度达到10∧8个细胞╱mL时，菌体就会沉淀并保持相对稳定的菌密度。
④衰减期：酵母在生长繁殖过程中逐渐利用完基质中的氧和营养物质并产生酒精，此后绝大部分酵母逐渐死亡。

第三章
1.酵母的酒精发酵中EMP途径的特点
葡萄糖分子经转化成1,6-二磷酸果糖后，在醛缩酶的催化下，裂解成2个三碳化合物分子，由此再转变成2分子的丙酮酸。在该途径中，由于葡萄糖被转化为1,6-二磷酸果糖后开始裂解，故又称之为双磷酸己糖途径。
2.HMP途径的特点和生理意义
① HMP途径是从6-磷酸葡萄糖酸脱羧开始降解的，与EMP途径（在双磷酸己糖基础上开始降解） 是不同的；
②该途径中有两种特征酶：转酮酶和转醛酶；
③ HMP途径不产生NADH2，却产生大量的NADPH2，它可以 为酵母细胞生物合成脂肪酸、固醇等重要物质提供还原力，也可以通过呼吸链氧化产生大量能量。这是EMP途径和TCA循环所无法完成的；
④反应中的赤藓糖-4-磷酸可用于合成芳香氨基酸，如苯丙氨酸，酪氨酸、色氨酸和组氨酸；
⑤由于在 HMP途径中存在着C3-C7的各种糖，使具有 HMP途径的微生物的碳源利用范围更广；
⑥通过本途径而产生的重要发酵产物很多，例如核苷酸、若干氨基酸、辅酶和乳酸（异型乳酸发酵）等；
⑦ HMP途径

中的酶系定位于细胞质中。
3.HMP途径的生理意义
在某些种的酵母中，可进行戊
糖的厌氧降解，与酵解酶类协同作用，可使磷酸单糖进行各种非氧化性的和氧化性的反应。因此 HMP途径的不是只产生单一终产物的途径，而是一条具有很高代谢适应性的、产物差异很大的途径。
4.酵母糖代谢的调节方式
①糖酵解的调节：在葡萄糖酵解过程中，有三步酶促反应是不可逆的，催化这三步的酶依次是己糖激酶，磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶，这三步反应是酵母糖代谢重要的控制位点，通过对催化不可逆反应的酶的活力控制，来决定糖代谢的方向——分解代谢（糖酵解）和合成代谢（糖的异生）。②巴斯德效应：氧对发酵的抑制。③ Crabtree效应：发酵作用对呼吸作用的抑制。④葡萄糖效应：葡萄糖比果糖优先被酵母菌利用。
5.酒精发酵副产物，产生途径，对葡萄酒品质的影响
①甘油：酒精发酵早期，酵母的糖代谢过程。它能使葡萄酒口感圆润，并增加口感复杂性。
②乙酸：对葡萄酒的风味影响是负面性的。
③非挥发性有机酸：对感官品质无大影响。
④高级醇（杂油醇）：途径是葡萄糖代谢和氨基酸的脱氨作用。是葡萄酒重要的呈香物质。
⑤挥发性酯类物质：氨基酸代谢等。产生发酵香气（怡人的水果香）。
⑥双乙酰与乙偶姻：双乙酰产生不良风味。

第四章
1.对葡萄酒酿造过程中非酵母属酵母进行研究的意义
非酵母属酵母是引起葡萄酒病害的主要病原菌；是葡萄酒非接种发酵的主要参与菌群，其代谢和发酵作用影响葡萄酒的成分和风味品质。故了解非酵母属酵母的微生物学特性和酿造学特性，对葡萄酒的病害防治和发酵控制有指导作用。
2.非酵母属酵母包括：
㈠毕赤氏酵母属
㈡汉逊氏酵母属
㈢假丝酵母属
㈣红酵母属
㈤德巴利酵母属
㈥隐球酵母属
㈦克勒氏酵母属与有孢汉逊酵母
㈧ 酒香酵母属
前六种是结膜酵母，后两种是柠檬形酵母。
3.非酵母属酵母在葡萄酒酿造中的作用
在控制条件下，非酵母属酵母的生长代谢有助于葡萄酒的结构与风味复杂性；而大多数情况下，非酵母属酵母是导致葡萄酒败坏的主要原因，非酵母属酵母产生的各种胞外酶类，对酿造也有重要意义。

第五章
1.嗜杀酵母
是指某些酵母在其生长繁殖过程中，能向菌体外分泌毒素蛋白的菌株。分泌的毒素蛋白被称作嗜杀毒素，又称致死蛋白。
2.嗜杀酵母对葡萄酒酿造的影响
①延滞酒精发酵 其繁殖对接种酵母的嗜杀作用，能够导致酒精发酵的延滞，甚至使发酵终止。
②净化发酵体系 如果通过人工

育种手段，将嗜杀酵母中决定分泌嗜杀毒素的质粒转移到生产用的优良酵母中去，使生产用酵母菌株也获得嗜杀活性，从
而避免野生酵母危害，且发酵特性不改变。

第六章
1.了解葡萄酒酿造过程中乳酸菌的群体和数量变化规律
①葡萄汁从压榨到酒精发酵前：种类为植物乳杆菌、干酪乳杆菌、肠膜状明串株菌、有害片球菌；菌密度10∧3-10∧4个╱mL。
②酒精发酵过程中：种类为酒类酒球菌、有害片球菌、植物乳杆菌；菌密度每毫升数个。
③主导菌为酒类酒球菌，pH较高时还有片球菌和乳杆菌；菌密度可达10∧6-10∧8个。
④贮酒期间：片球菌和乳杆菌（pH高，二氧化硫浓度低），与酒类酒球菌拮抗。数量因清除和抑制略低。
2.葡萄酒乳酸菌主要种属特征
①乳杆菌属：一般形成链，不运动，运动者则周生鞭毛。无芽孢，革兰氏染色阳性，微好氧，耐酸。
②片球菌属：细胞圆球形，在垂直的两个平面交替分裂成四联状，一般细胞呈对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，不形成芽孢，兼性厌氧。
③明串珠菌属：细胞球形，通常呈豆状，革兰氏阳性，不运动，不形成芽孢，兼性厌氧，菌落直径常小于1㎜，光滑，圆形，灰白色。
④ 酒球菌属：嗜酸
3.葡萄酒乳酸菌的鉴定
①革兰氏染色（阳性）；
②过氧化氢酶试验（阴性）；
③属难养菌，有些种细菌还要求番茄汁因子；
④异型乳酸发酵或同型乳酸发酵；
⑤甘露醇的形成（异型乳酸菌能将果糖还原为甘露醇）；
⑥精氨酸产氨试验；
⑦苹果酸-乳酸发酵能力。
此外还可以采用双歧式检索表。

第七章
1. 苹果酸—乳酸发酵 对酒质的影响
①降酸作用；②增加细菌学稳定性；③风味修饰；④降低色度；⑤细菌可能引起葡萄酒病害。
2.苹果酸—乳酸发酵 过程中葡萄酒成分的变化
①有机酸：苹果酸↓，乳酸↑，酒石酸↓；②对己糖的代谢：主要通过6-磷酸果糖途径和磷酸戊糖途径进行的，代谢产物主要有乳酸、醋酸、酒精和二氧化碳；③ 含氮化合物的代谢：利用酵母菌分泌的肽酶或蛋白酶及酵母菌自溶后释放了相关酶类的结果。
3.影响乳酸菌在葡萄酒中生存与生长的因素
⒈葡萄酒的理化特性与组成①pH②二氧化硫③酒精④氧和二氧化碳⑤温度；
⒉相关的酿造工艺①二氧化硫的使用②生酒与酒脚的接触时间③换桶次数④热浸处理；
⒊ 乳酸菌与葡萄酒中其他种类的微生物的相互关系①拮抗：酵母菌、噬菌体②互利共生：灰霉菌、醋酸菌③乳酸菌种间相互影响

第八章
1.醋酸菌的鉴定方法 p175
2.影响醋酸菌生存与生长的

葡萄酒环境因子
①pH：随着pH降低生存能力下降；
②温度：最适温度25-30℃；
③二氧化硫
④酒精：成醋能力受酒精浓度的制约耐受力10%-15%；
⑤氧气：乳酸菌专
性好氧。
3.醋酸菌的代谢与生长
①碳水化合物：
②甘油
③酒精
④其他醇类
⑤有机酸
⑥含氮化合物
⑦生长因子

第九章
1.菌种选育的一般原理
⒈优良变异系的分离筛选①采样②增殖培养③纯化
⒉ 性能鉴定①发酵特性②工艺学特性
2.葡萄酒酵母选种的一般方法
⒈选种目标的确定⑴快速启动发酵⑵酒精耐受性⑶二氧化硫耐受性⑷低温耐受性⑸絮凝作用⑹泡沫形成能力低⑺产生最少的不良副产物⑻良好的风味物质形成能力⑼转化效率⑽代谢产酸⑾分解有机酸⑿嗜杀免疫
⒉酵母的分离和筛选⑴分离：划线分离培养法和稀释平板分离培养法⑵筛选：①考察供选菌株对二氧化硫的抗性、嗜杀表型、高温生长能力、低泡形成能力②基于供选菌株产生挥发性酸的能力、酒精产率、残糖发酵能力
⒊发酵试验
3.酵母菌原生质体融合的一般原理（p206示意图）和过程
主要步骤为①亲本选择②原生质体制备③原生质体融合④原生质体再生⑤融合子的筛选。
4.基因工程的基本方法
①目的基因的分离
②载体选择
③目的基因与载体DNA体外重组
④载体引入受体细胞