蛋白质质谱数据 绝对定量
蛋白质定量分析了解生物体内蛋白质表达的方法
蛋白质定量分析了解生物体内蛋白质表达的方法蛋白质是生物体内重要的组成成分，它们在维持生命活动以及调节生理功能等方面起着关键作用。
了解生物体内蛋白质的表达水平对于研究生物体的功能与疾病机制具有重要意义。
在实验室中，科学家们常常需要进行蛋白质定量分析来准确测量生物体内蛋白质的表达水平。
本文将介绍几种常见的蛋白质定量方法。
一、BCA（巴氏反应）法BCA法是一种常用的蛋白质定量方法，它基于巴氏反应原理，通过将被测蛋白质样本与BCA试剂反应生成可着色的络合物，然后利用分光光度计测定络合物的吸光度来确定蛋白质浓度。
BCA法具有操作简单、反应时间短、灵敏度高的特点，被广泛应用于生物科学研究领域。
二、Lowry法Lowry法是另一种常用的蛋白质定量方法，它利用蛋白质在碱性条件下与铜离子和碱式碳酸铜反应生成可测量的蓝色复合物，再利用比色法测定复合物的吸光度来确定蛋白质浓度。
Lowry法具有较高的敏感性和较宽的线性范围，在分析蛋白质样品时非常可靠。
三、Bradford法Bradford法是一种相对快速且便于操作的蛋白质定量方法。
该方法利用考马斯亮蓝G250（Coomassie Brilliant Blue G-250）与蛋白质之间的非共价相互作用形成蓝色复合物，再通过比色法来测定蛋白质样品的吸光度。
Bradford法具有灵敏度高、线性范围广等优点，常被用于较快速的蛋白质定量。
四、荧光定量法荧光定量法是一种常用于测定蛋白质浓度的灵敏度高的方法。
该方法利用特定的荧光染料与蛋白质发生非共价相互作用，生成荧光染料-蛋白质复合物，进而通过测量荧光信号的强度来确定蛋白质浓度。
相比于上述几种方法，荧光定量法的线性范围更广，并且对于小样本量也能获得可靠结果。
五、质谱分析法质谱分析法是一种利用质谱技术对蛋白质进行定量分析的方法。
此方法通常结合先进的液相色谱技术与质谱仪器，通过将样品中的蛋白质分离和离子化，进而测量离子化蛋白质的质量-电荷比（m/z），最终得到蛋白质的浓度。
蛋白半定量,定量,绝对定量
百泰派克生物科技
蛋白半定量，定量，绝对定量
在蛋白质分析中主要对定性分析和定量分析进行研究，定量分析就是对蛋白样品的含量进行鉴定，可以分为定量、半定量、相对定量和绝对定量。
蛋白定量很容易理解，那什么又是半定量、相对定量和绝对定量呢？今天小编就和大家聊聊这个问题。
蛋白定量就是对某蛋白样品进行精确的定量鉴定，其测定结果较接近真实值，可信度高。
通常利用标记（iTRAQ、TMT、SILAC等）或非标记（Label Free）策略进行
蛋白定量研究。
蛋白半定量不是指对一半的蛋白质进行定量研究，而是指在某些特殊情况下，如难以直接对蛋白质含量进行测定或蛋白含量易发生周期性波动时，只能对蛋白质的含量进行粗略的、大致的鉴定，所得到的结果是近似的测量值，精确度远不如定量分析。
蛋白相对定量，又称为比较定量，是将两种蛋白质在不同状态下的表达量或含量进行相对比较分析，常用于检测不同生理或病理状态下蛋白含量的变化。
蛋白绝对定量是对各类蛋白进行浓度或含量的绝对分析，可以对组织、体液或细胞蛋白质组中的每一种蛋白质进行绝对含量和浓度分析，是一种靶向定量蛋白组学技术，常用于蛋白质或其修饰状态的定量分析。
目前主要利用内标法或基于质谱的非标记方法进行蛋白绝对定量研究。
百泰派克生物科技基于高分辨率质谱仪结合丰富的生物信息学分析经验，提供高效精准的蛋白质定量服务技术包裹，能够实现蛋白质定量、半定量、相对定量、绝对定量、标记定量以及非标记定量等分析，欢迎免费咨询。
蛋白质质量分析与定量方法的发展与应用
蛋白质质量分析与定量方法的发展与应用蛋白质是一种重要的生物大分子，它在生物体内具有重要的生物学功能。
随着生物技术的飞速发展，对蛋白质质量分析和定量技术的研究也越来越深入。
一、蛋白质的质量分析蛋白质的质量分析方法包括凝胶电泳、质谱和高效液相色谱等。
其中，凝胶电泳是常见的蛋白质分析方法，它可以将蛋白质分离出不同大小的条带，从而确定蛋白质的分子量。
然而，由于凝胶电泳操作繁琐、需要大量时间和样品，因此在实际应用中有一定的局限性。
质谱分析技术可以通过分析蛋白质分子的质量、荷电量和空间结构等信息，来确定蛋白质的结构和分子量。
其中，质谱分析技术的发展为蛋白质质量分析和鉴定提供了更加准确、高效和灵敏的手段。
高效液相色谱技术（HPLC）是一种分离、纯化和定量蛋白质的常见方法。
它可以通过样品的不同性质，如大小、亲水性和电性等，使之在不同条件下分离。
HPLC技术的发展，不但改善了蛋白质的质量分析效率和准确度，而且也可以为研究人员提供更加便利的技术支持。
二、蛋白质的定量方法对于蛋白质的定量，传统的方法包括比色法、二级离子质谱法、凝胶电泳定量法等。
这些方法都具有操作简单但精确性不高的特点。
近年来，蛋白质的定量方法也在不断发展。
其中，最常用的方法是基于质谱的定量方法，如多重反应监测和绝对定量。
多重反应监测是一种常见的质谱定量方法，它可以对蛋白质分子之间的转化关系进行分析并定量。
而绝对定量技术可以通过标准品的内标法，准确地确定样品中的蛋白质的数量。
除此之外，蛋白质的流式细胞术和蛋白质芯片等新技术的出现，也进一步推动了蛋白质定量方法的发展和应用。
这些新技术不但具有灵敏度高、准确性好的特点，而且也可以大大提高工作效率和自动化程度。
三、蛋白质的应用前景蛋白质作为生命体内的重要成分，不但可以对药物和疾病的治疗提供支持，而且也具有非常广泛的应用前景。
例如，蛋白质芯片已被广泛应用于基因组学、药物研发、生物学研究等领域。
另外，蛋白质生产技术在医药及食品工业中的应用也越来越普遍。
蛋白质定量测定的方法
蛋白质定量测定的方法蛋白质定量测定是生物学研究中十分重要的方法。
常用的蛋白质定量测定的方法主要有以下几种：一、比浊法比浊法是一种最常用的定量法，它是通过适当改变溶液的浓度，以产生一种特定的“荧光效应”强度来实现的，其原理是以产生的特定的荧光强度和溶液中已知的蛋白质含量来反映所测溶液中蛋白质定量。
比浊法步骤：1.将样本放置在一定量光源下，调节所需的条件，获得荧光发光比较；2.使用比浊仪计算不同浓度样本的荧光强度；3.按照事先确定的标准线，实现折线法法中的拟合，获得最终定量结果。
二、放射免疫分析法放射免疫分析法应用于蛋白质定量测定，即根据反映物质的放射吸收，通过放射免疫分析试验确定溶液中蛋白质的含量。
它是借助化学反应获得放射吸收信息，再结合生物学实验，显示溶液中简单分子及复杂分子的放射衰减，最后计算蛋白质的定量结果。
放射免疫分析法步骤：1.将样本放置在放射量计中，记录和统计其放射吸收情况；2.生成受体蛋白，和未知物质特定结合，生成结合能力；3.检测特异性信号，计算放射吸收率；4.根据已知信号和放射吸收率，计算蛋白质的定量结果。
三、衍生免疫定量衍生免疫定量是一种新的蛋白质定量测定方法，它采取基因表达系统来合成蛋白质的介质，从而获取定量结果。
基于衍生免疫定量，使用适当的催化剂可以产生出特定的化学衍生物，以测量活体细胞内的蛋白质含量。
衍生免疫定量步骤：1.研究者首先调查待测样本，以确定具体的衍生物；2.通过基因工程，合成衍生物和特定的反应媒介；3.添加衍生物到待测样本中，形成一种特定的反应媒介，并用特定的定量仪器测量；4.通过收集的数据，计算蛋白质的定量结果。
总结：1.比浊法：利用产生的特定荧光强度和溶液中已知的蛋白质含量来定量蛋白质；2.放射免疫分析法：借助化学反应获得放射吸收信息，检测特异性信号，计算放射吸收率；3.衍生免疫定量：借助基因表达系统合成蛋白质介质，调查待测样本，添加衍生物，通过定量仪器测量，实现衍生免疫定量。
PRM蛋白绝对定量：革新蛋白质组学的定量方法
PRM蛋白绝对定量：革新蛋白质组学的定量方法蛋白质组学是研究生物体内蛋白质组成和功能的重要手段。
在过去的几十年中，科学家们通过质谱技术的不断发展，取得了许多重要的突破。
其中，定量质谱技术在蛋白质组学研究中起到了至关重要的作用。
PRM（Parallel Reaction Monitoring）蛋白质绝对定量技术作为一种新兴的定量质谱方法，为蛋白质组学研究提供了更加准确、灵敏和高通量的定量手段。
一、PRM蛋白质绝对定量的原理PRM蛋白质绝对定量技术是基于质谱仪的高分辨率和高灵敏度的特点，结合了选择性反应监测和平行反应监测的优势。
其原理可以简单概括为以下几个步骤：样品制备：将待测样品进行蛋白质提取和消化，得到肽段混合物。
质谱仪设置：根据目标蛋白的肽段序列，设计合适的质谱方法，包括质谱仪的离子传输参数、碰撞能量等。
数据采集：通过质谱仪进行数据采集，记录下每个肽段的质谱图谱。
数据分析：利用专业的质谱数据分析软件对采集到的数据进行处理，计算出每个肽段的相对丰度。
标准曲线绘制：通过一系列已知浓度的标准样品，绘制出标准曲线，用于后续的定量计算。
绝对定量计算：根据标准曲线和待测样品的质谱峰面积，计算出目标蛋白的绝对丰度。
二、PRM蛋白质绝对定量的优势相比于传统的定量质谱方法，PRM蛋白质绝对定量技术具有以下几个显著的优势：高灵敏度：PRM技术利用了质谱仪的高分辨率和高灵敏度，能够检测到低丰度的蛋白质，提高了定量的准确性。
高选择性：通过选择性反应监测，PRM技术可以针对目标肽段进行定量，减少了其他干扰物质的影响。
高通量：PRM技术可以同时定量多个肽段，提高了定量的效率和通量。
准确性和重复性：PRM技术通过标准曲线的建立和质谱数据的精确计算，能够提供准确和可重复的定量结果。
三、PRM蛋白质绝对定量的应用PRM蛋白质绝对定量技术在生物医学研究中有着广泛的应用。
以下是一些典型的应用领域：肿瘤标志物的定量：PRM技术可以用于定量肿瘤标志物，帮助早期诊断和治疗监测。
蛋白组绝对定量
百泰派克生物科技
蛋白组绝对定量
蛋白组绝对定量指在组学水平上对不同蛋白质的绝对浓度进行确定。
百泰派克生物科技提供蛋白质组绝对定量的服务。
定量蛋白质组学
定量蛋白质组学是从整体水平对细胞或组织等样本中蛋白质的含量进行测定，可分为相对含量和绝对含量。
定量蛋白质组学中蛋白质鉴定的方法与一般的定性蛋白质组学中使用的方法相同，但是包括了定量作为附加维度。
定量蛋白质组学不仅提供样品中鉴定出的蛋白质列表，还提供有关两个生物样品之间生理差异的信息。
定量蛋白质组学主要通过二维凝胶电泳（2-DE）或质谱（MS）进行，2-DE常常需要在下游用MS进行蛋白质鉴定，而MS既可以鉴定又可以定量。
绝对定量蛋白组
基于质谱的蛋白质组绝对定量技术可以分为基于内标法的蛋白组绝对定量和非标记（label free）蛋白质组绝对定量。
其中，基于内标法的蛋白组绝对定量又包括同位素标签标记的肽段用于蛋白组的绝对定量、非同位素标记的肽段用于蛋白组的绝对定量，以及同位素标记的肽段作为内标的蛋白质组绝对定量。
例如常见的iTRAQ 和TMT就属于同位素标签标记的肽段用于蛋白组绝对定量，而同位素标记的肽段作为内标结合MRM和SWATH可以更灵敏、更准确的实现蛋白质组绝对定量。
蛋白组绝对定量。
蛋白质的定量和定性分析方法
蛋白质的定量和定性分析方法蛋白质是生物体内最重要的功能分子之一，对于研究生物体的结构和功能具有重要意义。
为了准确地了解蛋白质的含量和性质，在科学研究和实际应用中，我们需要使用定量和定性分析的方法来研究蛋白质。
一、定量分析方法1. 低里德伯法（Lowry method）低里德伯法是一种经典而广泛应用的蛋白质定量方法。
该方法利用蛋白质与碱式铜络合物在碱性条件下反应生成蓝色产物，通过比色法测定溶液的吸光度来计算蛋白质含量。
这是一种灵敏且相对简单的方法，适用于大多数蛋白质样品的定量分析。
2. 比色法（Colorimetric assay）比色法是一种常用的蛋白质定量方法，通过蛋白质与染料的结合来测定蛋白质浓度。
常用的染料有布拉德福蓝（Bradford）、库吉铃蓝（Coomassie Brilliant Blue）、BCA法（Bicinchoninic Acid assay）等。
这些染料与蛋白质结合后形成一种复色物，通过比色法测定溶液的吸光度可以定量分析蛋白质。
比色法具有操作简便、灵敏度高等特点，被广泛应用于蛋白质定量领域。
3. 分子标记法（Molecular tagging method）分子标记法是一种新兴的蛋白质定量方法，利用特定的分子标记物（如荧光染料、放射性示踪剂等）标记蛋白质，然后通过测定标记物的荧光强度或放射性信号来计算蛋白质浓度。
分子标记法具有高灵敏度、高特异性等优点，适用于微量蛋白质的定量测定。
二、定性分析方法1. SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）SDS-PAGE是一种常用的蛋白质定性分析方法，通过电泳将蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中分离出来。
在电泳过程中，蛋白质在SDS（十二烷基硫酸钠）的作用下具有相同的电荷密度，只受到大小的限制而移动。
蛋白质在凝胶中的分离程度取决于其分子量大小，可以通过对比标准品的迁移距离来估计样品中蛋白质的相对分子量。
蛋白质组学定量分析的方法
蛋白质组学定量分析的方法蛋白质组学定量分析是对细胞或组织中的蛋白质进行定量分析的一种方法。
它是研究蛋白质组学的重要手段之一，可以揭示蛋白质的表达差异、功能变化以及相关的生物学过程和疾病机制。
目前，蛋白质组学定量分析的方法主要包括质谱定量法和定量免疫学方法。
质谱定量法是蛋白质组学定量分析的主要方法之一。
它基于质谱技术和同位素标记原理，使用质谱仪对样品中的蛋白质进行定量分析。
目前常用的质谱定量方法包括多重反应监测（MRM）、定量蛋白质鉴定（iTRAQ）和标记蛋白质鉴定（TMT）等。
多重反应监测（MRM）是一种常用的质谱定量分析方法。
它利用质谱仪中的三重四极杆（triple quadrupole）进行分析。
首先，确定待测蛋白质的肽段序列，然后合成同位素标记的肽段标准品作为内标。
接下来，使用质谱仪对待测蛋白质和内标进行质谱分析，测量待测蛋白质和内标的特定肽段的质荷比和峰面积。
最后，通过内标的峰面积和待测蛋白质的峰面积进行定量计算，得到待测蛋白质的表达量。
定量蛋白质鉴定（iTRAQ）是一种基于同位素标记的质谱定量方法。
在iTRAQ 实验中，待测组织或细胞培养基中的蛋白质经过胰蛋白酶消化后，将消化产物用不同的同位素标记。
这些标记反应产物有不同的质量，通过质谱分析可以得到有关各组分的数量比。
通过比较标记反应产物的相对丰度，可以定量分析待测蛋白质的表达差异。
标记蛋白质鉴定（TMT）是一种与iTRAQ类似的同位素标记质谱定量方法。
TMT 实验中，多个待测样品用不同的同位素标记，然后将这些样品混合在一起通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行分析。
通过质谱分析可以得到不同样品中蛋白质的相对表达量和差异表达蛋白质的鉴定。
定量免疫学方法也是蛋白质组学定量分析的重要方法之一。
相比于质谱定量法，定量免疫学方法具有高灵敏度、高特异性和高通量等优点。
常用的定量免疫学方法包括酶联免疫吸附实验（ELISA）、西方印迹（Western blotting）和流式细胞术（flow cytometry）等。
质谱的蛋白质组绝对定量新方法和新技术-生物分子高效分离与表征
国家重大科学研究计划课题任务书项目名称：蛋白质定量新方法及相关技术研究课题编号：2012CB910603课题名称：基于色谱-质谱的蛋白质组绝对定量新方法和新技术中华人民共和国科学技术部制二○一一年九月一、研究内容针对绝对定量蛋白质组学中存在的规模化内标肽制备困难、标记反应效率低、规模化多反应监测难以实现和非标记方法重复性和准确度差等科学问题，本课题为了提高绝对定量方法的准确度、通量和精确度，拟开展以下三个方面的研究，其中前两年侧重于标准内标肽段的制备、表征和发展固定化酶18O酶促的蛋白质组标记以及色谱保留时间依赖的多反应监测质谱分析方法，并将其用于对蛋白质组进行绝对定量的方法，实现目标蛋白质组和关键蛋白质的动态监测和绝对定量分析，并使绝对定量方法的误差小于10%；后三年重点研究生物双重标记方法、元素标记方法以及非标记规模化定量方法，旨在发展高通量、实用性强和能高覆盖蛋白质组的绝对定量方法。
1. 内标肽的设计、合成和表征标准内标肽段的制备、表征和储存是蛋白质绝对定量的前提和基础，也是规模化蛋白质绝对定量的主要瓶颈。
为此，本研究将首先建立两种标准内标肽段制备和表征的技术路线：包括化学合成和生物合成标准肽段方法、色谱纯化和纯度表征方法以及基于标准氨基酸、稳定同位素标记的氨基酸同位素稀释法结合选择性反应检测质谱的含量测定方法，同时建立标准肽段储存方法，为目标蛋白质组绝对定量提供参考物质。
2. 蛋白质组绝对定量标记新方法（1）基于内标物质结合质谱绝对定量方法仍是复杂生物样品中蛋白质绝对定量的首选方法，其核心是内标物质的标记。
为此，将发展三种标记方法，从不同角度探索高效、稳定的标记并结合质谱用于蛋白质规模化绝对定量新方法，3. 非标记规模化蛋白质组绝对定量新方法发展非标记规模化蛋白质组绝对定量与多反应监测质谱校正相结合的定量方法，建立高准确度的非标记规模化蛋白质组绝对定量新方法。
二、预期目标总体目标：发展内标肽的设计、合成和表征方法、蛋白质/肽新型标记方法结合质谱绝对定量方法以及非标记规模化蛋白质组绝对定量新方法，并使标记结合质谱绝对定量方法的误差小于10%；经质谱鉴定的目标蛋白质的非标记规模化绝对定量覆盖率达到80%以上，为蛋白质功能研究、疾病标志物的发现和验证提供重要技术支撑。
蛋白质组学定量研究常见方法
蛋白质组学定量研究常见方法蛋白质组学定量研究是通过测定蛋白质样本中蛋白质的相对或绝对含量来了解生物系统中蛋白质表达的变化。
在蛋白质组学定量研究中，有很多常见的方法，包括质谱法、免疫学法、色谱法和光谱法等。
以下将对其中几种常见方法进行介绍。
1.质谱法质谱法是蛋白质组学定量研究中应用最广泛的方法之一、质谱法可以利用质量比较准确测定蛋白质的绝对或相对含量。
常见的质谱方法包括二维凝胶电泳质谱法（2D-DIGE）、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）和同位素标记质谱法（SILAC），通过这些方法，可以高效准确地测定蛋白质的绝对或相对表达水平。
2.免疫学法免疫学法是一种广泛使用的定量蛋白质组学方法，其基本原理是利用特异性抗体与目标蛋白质结合，并通过与荧光或酶标记结合进行测定。
常见的免疫学方法包括Western blot、ELISA、流式细胞术和蛋白质芯片技术等。
这些方法具有高灵敏度和高特异性，可以快速准确地测定蛋白质的表达水平。
3.色谱法色谱法是一种常见的蛋白质组学定量方法，通过色谱柱的分离和去除杂质，从而获得纯净的蛋白质。
色谱法可以分为离子交换色谱、逆向相色谱、尺寸排除色谱和亲和层析等。
通过这些技术，可以高效准确地测定蛋白质的含量和纯度。
4.光谱法光谱法是一种快速准确测定蛋白质含量的方法。
在紫外-可见吸收光谱法中，通过测定蛋白质在特定波长下的吸光度，可以间接测定其含量。
此外，还有荧光光谱法和圆二色光谱法等。
这些光谱法可以快速定量蛋白质的含量，并了解蛋白质的构型和结构。
除了上述方法外，还有一些辅助分析方法，如蛋白质互作法（如蛋白质关联网分析）、功能学法（如蛋白质酶活测定）和结构分析法（如X射线晶体学）等，可以进一步了解蛋白质的功能和结构。
总结起来，蛋白质组学定量研究常见方法包括质谱法、免疫学法、色谱法和光谱法等。
这些方法在蛋白质组学研究中发挥重要作用，可以用于研究蛋白质的表达变化、功能与结构。
随着技术的不断发展，蛋白质组学定量研究方法也在不断更新和完善。
绝对定量(aqua)蛋白质组学
绝对定量(aqua)蛋白质组学定量蛋白质组学是一种强大的方法，用于发现和靶向蛋白质组学分析，以了解细胞、组织或生物体中的全部蛋白质组学动态。
大多数定量蛋白质组分析需要实验组中蛋白质或肽的同位素标记，然后可以通过质谱法进行区分。
基于质谱的蛋白质定量方法可以分为相对定量和绝对定量两种。
相对定量方法（SILAC、ICAT、ICPL和等压标签）用于比较样品之间的蛋白质或肽丰度，而具有已知同位素标记合成肽浓度的未标记样品可以通过选定的反应监测（SRM）产生目标肽进行绝对定量，利用绝对定量策略进行蛋白质组含量研究就称为绝对定量蛋白质组学。
无标记策略也可用于相对和绝对定量。
虽然这些策略比单纯的蛋白质鉴定更复杂，但定量蛋白质组学对于我们理解全部蛋白质表达、生物过程和疾病状态的分子机制背后的修饰至关重要。
绝对定量是一种有针对性的定量蛋白质组学技术，具有强大的功效，并且越来越多地用于各种定量蛋白质组学研究，如用于蛋白质及其修饰状态的绝对定量（AQUA）。
蛋白质绝对定量策略的原理是以已知浓度的肽或掺入的稳定同位素合成作为理想的内部标准，以模仿由蛋白水解形成的天然肽，这些合成肽也可以用共价修饰（例如，磷酸化，甲基化和乙酰化等）制备，这些修饰在化学上与天然存在的翻译后修饰相同。
然后，使用这种AQUA内标肽，通过利用串联质谱仪中选定的反应监测分析，精确定量地测量蛋白水解后蛋白质和翻译后修饰蛋白质的绝对水平。
百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Q Exactive HF质谱平台结合Nano-LC纳升色谱，推出高效优质的蛋白质组学定量分析。
服务包裹，可对各种蛋白或多肽样品进行相对或绝对定量，多种高分辨定量技术供您选择，包括Lable Free、SILAC、TMT和iTRAQ等，还可根据项目需求免费提供定制化试验方案，欢迎垂询！相关服务：绝对定量分析（AQUA）。
基于标签的蛋白质定量技术-iTRAQ，TMT，SILAC。
蛋白质定量分析的研究进展
蛋白质定量分析的研究进展近年来，随着生物科技的发展，蛋白质定量分析作为重要的生物学研究方法，受到了越来越多科学家的重视。
蛋白质是细胞中最基本的组成部分之一，精确的定量分析可以帮助研究人员更好地理解生物活动的本质，有助于研究疾病的发生和治疗。
为了获得准确的蛋白质定量数据，研究人员现在使用的方法越来越多样化。
下面我们将介绍几种比较常见的蛋白质定量分析方法的原理和特点。
一、蛋白质质谱法蛋白质质谱法是目前应用最为广泛的蛋白质定量方法之一。
它的原理是通过分析蛋白质分子的离子荷质比，来计算出蛋白质质量的大小。
该方法通常需要将蛋白质样品进行光谱分析，然后对分析结果进行数据处理，最终得到所需的蛋白质定量结果。
蛋白质质谱法具有检测灵敏度高的优点，能够检测出微量数量的蛋白质。
同时，它还能够检测多肽序列、修饰等信息，从而为研究人员提供更多的生物学信息。
但是，该方法也存在一些缺点，如样品制备较为繁琐、质谱信号受到多种影响因素等。
二、蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术也是一种比较常见的蛋白质定量方法。
它的原理是将蛋白质样品通过生物芯片上的蛋白质结构域结合，然后用荧光探针标记，通过检测荧光来计量蛋白质的数量。
蛋白质芯片技术具有高通量、快捷、高精度等优点，可以同时检测数千到数万个蛋白质，且对样品需求量较少。
但是，它也存在一些局限性，如需要设计合适的芯片结构、标记荧光剂等，且准确性和灵敏度与芯片质量直接相关。
三、蛋白质生化分析法蛋白质生化分析法也是一种常用的蛋白质定量方法。
它的原理是通过测定蛋白质与特定酶的结合反应来计量蛋白质的数量。
例如，酶联免疫吸附试验（ELISA）就是一种常见的蛋白质生化分析法。
蛋白质生化分析法能够检测不同种蛋白质的数量，同时还能检测蛋白质与其他生物分子的相互作用等信息。
但是，该方法也存在一些缺陷，如需要合适的抗体和较长的反应时间。
总的来说，不同的蛋白质定量方法各有优缺点，研究人员应根据具体分析问题和实验目的选择适当的方法。
蛋白质组学定量分析的方法
蛋白质组学定量分析的方法
蛋白质组学定量分析的方法主要有两种：定性分析和定量分析。
1. 定性分析：常用的定性分析方法有蛋白质质谱技术，如蛋白质液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）。
这些方法能够对样品中的蛋白质进行分离、鉴定和定性分析，可以确定蛋白质的氨基酸序列和特定的修饰情况。
2. 定量分析：常用的定量分析方法有标记蛋白质定量和非标记蛋白质定量。
标记蛋白质定量方法包括同位素标记法和化学标记法。
同位素标记法主要包括稳定同位素标记法（如氘代谱标法）和放射性同位素标记法（如放射性同位素测量法）。
化学标记法主要包括功能分子标记法（如荧光标记法和生物素标记法）和反应性标记法（如对硝基苯甲酸标记法和丙煮醛标记法）。
非标记蛋白质定量方法常用的有相对定量法和绝对定量法。
相对定量法主要通过蛋白质相关的性质，在样品中不同蛋白质的含量所具有的差别来进行定量。
常用的相对定量方法有比较蛋白质的荧光标记法、差减荧光凝胶法和差异凝胶电泳法等。
绝对定量法主要使用内标法，通过加入已知浓度的内标蛋白质来计算目标蛋白质的浓度。
常用的绝对定量方法有多重反应监测法（MRM）和定量蛋白质标准曲线法等。
完整蛋白质绝对定量方法与量值溯源技术研究
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对蛋白质的定量研究不仅是生物学、医学领域的重要课题，也是药物研发、食品安全等领域的基础。
随着科学技术的不断发展，完整蛋白质的绝对定量方法及其量值溯源技术也在不断完善与创新。
本文将从蛋白质定量的意义、方法、量值溯源技术等方面展开探讨，并对当前研究现状进行分析，为相关领域的研究提供一定的参考。
蛋白组学可以得到蛋白质的绝对浓度吗
蛋白组学可以得到蛋白质的绝对浓度吗
蛋白质组学分析可以获得蛋白质的绝对浓度，要测定蛋白质的绝对浓度首先要利用绝对定量方法获得该蛋白的绝对含量。
目前，常用的蛋白质组学绝对定量方法包括基于内标法策略和基于质谱数据统计分析的非标记方法。
不同方法的基本原理见下表所示：
绝对定量方法
原理
内标法。
同位素标记氨基酸绝对定量。
将待测蛋白/肽段完全的水解为氨基酸混合物，再加入已知浓度的、同位素标记的氨基酸作为内标，通过质谱检测测定样品中的蛋白/肽段的绝对含量。
电感耦合等离子体质谱绝对定量。
首先对蛋白或肽段中所含的磷或硫元素进行精确测定，再根据这两种元素在蛋白/肽段中的含量计算该蛋白/肽段的绝对含量。
同位素标签标记肽段绝对定量。
用一对同位素标签分别标记待测的肽段和合成的、已知浓度的、氨基酸序列相同的肽段，经质谱检测即可测定样品中的蛋白或肽段的绝对含量。
非同位素标记肽段绝对定量。
选择与被定量肽段性质非常相近的非同位素标记的肽段作为内标，对相应肽段或蛋白进行绝对定量。
非标记（Label Free）蛋白质组绝对定量。
蛋白质浓度经过相应的数学变换后与质谱数据的某些参数如肽段数目、鉴定的概率得分、被鉴定肽段的离子数、色谱保留时间等成线性关系，据此，可间接的计算蛋白混合物中单一蛋白的绝对含量或浓度。
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蛋白质定量分析方法
蛋白质定量分析方法蛋白质定量是蛋白质研究中非常重要的一项工作，它用于确定样品中蛋白质的浓度。
在蛋白质研究中，常常需要确定样品中蛋白质的浓度，以便进行后续的实验和数据分析。
当前常用的方法包括光谱法、比色法、生物学活性测定法和质谱法等。
下面将对这些方法进行详细阐述。
光谱法是一种常用的蛋白质定量方法，它是通过测量蛋白质溶液在特定波长下的吸光度来确定蛋白质的浓度。
在这种方法中，常用的波长是280nm，因为大部分蛋白质在这个波长下有较高的吸光度。
通过测量蛋白质溶液的吸光度值，可以使用比色法或者标准曲线法来计算蛋白质的浓度。
光谱法的优点是操作简单，不需要复杂的设备和试剂，而且可以同时测定多种蛋白质。
但是，光谱法对于一些特殊蛋白质和杂质的检测有一定的局限性。
比色法是蛋白质定量中常用的一种方法，它是通过比较样品和标准溶液的颜色差异来确定蛋白质的浓度。
比色法的原理是，蛋白质与某些特定试剂反应后，可以形成有颜色的复合物。
一般来说，蛋白质和某种染料或金属离子反应会产生特定的吸光峰，通过测量这个吸光峰的强度，可以确定蛋白质的浓度。
比色法的优点是快速、准确，适用范围广，且可以同时测定多种样品。
然而，比色法也存在一些问题，比如可能受到样品中其他物质的干扰，以及对试剂的选择和操作有一定的要求。
生物活性测定法是一种基于蛋白质的生物学活性特性来确定蛋白质浓度的方法。
在这种方法中，通过测定蛋白质的生物学活性，如酶活性、生物修复能力等，来推断蛋白质的浓度。
生物活性测定法在一些特定情况下非常有用，比如检测蛋白质的功能状态或者酶的活性。
但是，生物活性测定法也存在一些问题，如操作复杂、结果受到其他因素的干扰等。
质谱法是一种高灵敏度的蛋白质定量方法，它是通过测定样品中蛋白质产生的质荷比来确定蛋白质的浓度。
质谱法可以使用质谱仪来进行分析，通过电离和分离蛋白质，然后测定质荷比，计算样品中蛋白质的浓度。
质谱法具有高灵敏度、高分辨率和高通量的优点，能够检测到非常低浓度的蛋白质。
蛋白质质谱定性定量
百泰派克生物科技
蛋白质质谱定性定量
对蛋白质进行定性定量鉴定即对目标蛋白的种类和含量进行鉴定是蛋白质组学研究中最基本的研究内容。
质谱技术是目前常用的蛋白质组学分析技术，它基于蛋白肽段离子的质荷比（m/z）和离子峰强度信息可实现蛋白质的定性和定量鉴定。
在质谱分析中，蛋白质先被酶解消化为小分子的肽段，小分子肽段在离子源中电离成肽段母离子，再利用质量分析器检测肽段母离子的质荷比和离子峰强度。
将肽段离子的质荷比数据与理论数据库进行比较、匹配可以确定其分子质量，进而获得该肽段的氨基酸组成，通过各肽段之间的拼接最后确定完整蛋白的分子量和氨基酸组成信息以实现定性鉴定。
肽段母离子的浓度与样品量成正相关，样品量越多，其产生的肽段离子就越多，相应的离子峰信号强度就越大，因此可以利用离子峰信号强度进行蛋白的含量测定。
若引入已知浓度的标准品（内标肽）还可以对蛋白进行精确的含量测定。
百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Q ExactiveHF质谱平台结合Nano-LC色谱，提供快速高效的蛋白质质谱定性定量鉴定服务技术包裹，您只需要将您的实验目的告诉我们并将您的细胞寄给我们，我们会负责项目后续所有事宜，包括细胞培养、细胞标记、蛋白提取、蛋白酶切、肽段分离、质谱分析、质谱原始数据分析、生物信息学分析，欢迎免费咨询。
蛋白质的定量分析方法
蛋白质的定量分析方法
检测蛋白质含量的方法有多种，常见的包括凯氏定氮法、生物素标记法、吸光光度法等。
1.凯氏定氮法（Kjeldahlmethod）：这是一种经典的蛋白质定量方法，主要通过测定样品中氮元素的含量来计算蛋白质含量。
凯氏定氮法包括消解、蒸馏和滴定三个步骤，其原理是将样品中的氮元素转化为氨氮，然后通过滴定测定氨氮的含量，进而计算蛋白质含量。
2.生物素标记法（Biotin-labelingmethod）：这是一种利用生物素（Biotin）与蛋白质特异性结合的方法来检测蛋白质含量。
首先将生物素标记到目标蛋白质上，然后利用亲和层析法（如生物素-亲和素系统）进行定量分析。
3.吸光光度法（Absorbancemethod）：这是一种基于蛋白质在紫外光区域的吸收特性进行定量分析的方法。
蛋白质中的芳香族氨基酸（如酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸）具有在紫外光区域（如
280nm）的吸收特性，通过测量样品在这一波长处的吸光值，可以计算蛋白质含量。
各种方法适用于不同的实验条件和要求，选择合适的方法需要根据实际情况来判断。
在实际操作过程中，还需注意遵循实验规程，确保实验结果的准确性。
用质谱对蛋白质复合物进行定量分析
用质谱对蛋白质复合物进行定量分析蛋白质复合物是由多个蛋白质相互结合形成的复杂结构，对于细胞的正常功能和生理过程起着重要作用。
了解蛋白质复合物的组成、数量以及其在疾病发展中的变化对于生物药物的研发和治疗至关重要。
然而，由于蛋白质复合物的复杂性，传统的定量方法往往无法满足需求。
幸运的是，质谱技术的发展为蛋白质复合物的定量分析提供了一种高效、准确的方法。
1.质谱技术的基本原理。
质谱技术是一种通过测量离子的质量和相对丰度来分析物质的方法。
它基于蛋白质复合物中的蛋白质分子在质谱仪中产生离子，并通过质量/电荷比对离子进行分离和测量。
常用的质谱技术包括质谱质量分析仪（MS）和质谱质量分析仪串联（MS/MS）。
质谱技术的关键步骤包括样品制备、离子化、质谱分析和数据处理。
2.质谱定量分析的方法。
2.1相对定量：相对定量方法用于比较不同样品中蛋白质复合物的相对丰度。
这些方法基于质谱图的峰强度或峰面积来评估蛋白质复合物的相对数量，常见的方法包括标记和非标记的定量策略。
2.2绝对定量：绝对定量方法旨在确定蛋白质复合物的精确数量。
这些方法结合了内标校准曲线和内部标准物质，通过测量待定物质和已知浓度标准之间的信号强度比例来计算目标蛋白质复合物的绝对浓度。
绝对定量方法可以提供更精确的定量结果，但通常需要更复杂的实验设计和分析方法。
3.质谱定量分析在生物药物研发中的应用。
3.1药物研发过程中的质控：质谱定量分析可用于药物研发过程中的质量控制，确保生产的生物药物批次的一致性和质量稳定性。
3.2药物代谢动力学研究：质谱定量分析可用于药物代谢动力学研究，确定药物在体内的消除速率和代谢途径，从而优化药物的剂量和给药方案。
3.3疾病标志物鉴定：质谱定量分析可用于鉴定和验证疾病标志物，帮助早期诊断、疾病监测和预后评估。
3.4药物治疗监测：质谱定量分析可用于监测药物在体内的浓度，确保药物治疗的安全性和有效性。
质谱技术作为一种强大的工具，为蛋白质复合物的定量分析提供了准确、高通量的方法。
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基于MRM 的蛋白质组学实验流程
复旦大学
MRM 实验的设计、优化
1.目标蛋白质组的选择: 依据先前的实验或者是文献,以及 网络资源寻找赶兴趣的蛋白
2.目的肽段的选择：
（a）选择目标蛋白特有的多肽来监测 （b）离子化和碎裂好的肽段更易被检测，灵敏度高，优先选择 （c）确保所选的肽段的 m/z值与所用仪器质量范围相匹配 (6-20个氨基酸） （d）如果可能，尽量不要选用含有易被化学修饰或发生重排的氨基酸 (例如：M,C等）
Analytical Chemistry, 2004
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2.基于电感耦合等离子体质谱测定元素的蛋白质绝对定量
磷酸化肽 段混合物 BNPP (内标） BNPP: bis(4-nitrophenyl) phosphate 与磷酸化肽段性质类似
混合物
HPLC–ICPMS
HPLC–ESIMS
I31P
tret/min MS/MS
不足： 用含磷的化合物BNPP作为内标， 在质谱上的响应与肽段的响应 还是会出现细微的差别，从而 给该方法的定量带来误差。
Angew. Chem. Int. Ed. 2007
复旦大学
3.非同位素标记的肽段用于蛋白质组的绝对定量
通过向样本中加入不同 浓度的标准人肌红蛋白 绘制标准曲线，曲线的 反向延长线与横坐标交 点的相应横坐标值即为 此方法测定的实际样本 中人肌红蛋白的绝对浓度
1053.6
1072.5764
1074.8
1089.5776
1096.0
100
1223.9
90
脱氨峰
80
70
% Intensity
60
50
40
30
1050.0223
20
1015.0656
1065.9966
10
1072.0402
0 976.0
复旦大学
1095.2 1125.0
1005.8
1035.6 Mass (m/z)
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二. 非标记(Label-free)蛋白质组绝对定量
在一级MS中被鉴定到的 所有肽段质谱峰强度的 平均值 数学变换
每个蛋白质所监测 到肽段数目
蛋白质浓度
......
线性关系
Proteomics, 2004;Molecular & Cellular Proteomics,2005
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绝对定量蛋白质组学
1065.4
3. 离子对的选择与验证
前期预实验 软件预测 Y离子可优先考虑 （四级杆CID碎片 离子中最稳定 的离子）
对每个前体离子选择 三个或更多的碎片离子
对每对离子对 进行验证
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4.CE值的优化
以MRMPilot（4000 QTRAP)为例
选择强度最强时的CE值作为 该transition的最终CE值
母子离子对 的选择
仪器参数的 优化
MRM实验
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基于MS/MS ALL 的MRM技术
以AB SCIEX的 TripleTOF™ 5600 System为例
1. MRMHR 2. SWATH
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1. MRMHR
Q1固定(即目的肽段母离子)，然后母离子在碎裂池中被打碎， 子离子全扫。
不需要预实验来选择合适的母子离子对
1050.5730
1083.5660
1032.6003
1039.5553
1044.6074
1057.6161
1053.5873
1061.5334
10
0 990.0
1011.2
1032.4 Mass (m/z) 4700 Reflector Spec #1[BP =1028.1, 1224]
1028.0369
二. 非标记(Label-free)蛋白质组绝对定量
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一. 基于内标法的蛋白质绝对定量
1.同位素标记的氨基酸作为内标的蛋白质组绝对定量
蛋白质 重标氨基酸
混合物 酸解 轻重氨基酸混合物 蛋白质的 氨基酸序列组成； 2)采用MALDI源时，基质会对某些 氨基酸的质谱峰产生干扰； 3)较难应用于复杂蛋白混合物中 蛋白质的绝对定量。
导入蛋白和肽段 选取母子离 子对 直接在复杂样品中做 验证，即在MRM后跟 EPI扫描，打msms
碰撞能量优化
加入时间参数，提 高通量
合成或标记同位素 肽段，往下做定量
基于 MRMpilot软件的MRM方法建立流程
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导入蛋白和肽段和选取离子对
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MSMS验证，碰撞能量优化
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2. Skyline
功能： 1.建立方法 2.结果数据分析
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导入fasta
设置选取肽段规则
选取肽段
可以用skyline自建 或者外部软件 如 TPP 构建谱图库
导入，设置谱图库
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选择子离子
导出列表或者方法
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输出给什么样的仪器用。
原始质谱图格式
公共谱图库格式
搜库结果格式：没有proteinpilot
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2. SWATH
m/z range=[400-1200] At 25 Da per SWATH At 100ms per SWATH
32 SWATHs required 3.2s cycle time
Complete sample content coverage
SWATH采集原理 Molecular &Cellular Proteomics, 2012
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同位素标记的肽段作为内标结合MRM技术的 蛋白质组绝对定量
MRM(SRM)技术
（1）灵敏度高：MRM 技术通过两级离子选择 （2）重现性好：MRM 技术质谱信号采集中，可以降低复杂生物样 本基体和共流出组分对待测分子离子化、质谱信号的抑制等影响。 （3）准确度高：利用MRM 技术特异性，对符合设定的多肽进行检 测，使分析过程中的定性结果假阳性率大大降低。
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5.MRM实验参数
1.每个离子对的停留时间(Dwell time) 2.一个循环的时间(离子对总数* Dwell time) 3. 峰宽
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Scheduled MRM
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色谱条件的优化
1. 色谱柱的选择：根据具体的实验目的选择合适的色谱柱， 并且要保证色谱峰的峰宽。
2.色谱梯度的优化：保证将被分析的肽段尽量分开。
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建立MRM实验方法可以使用的软件 1. MRMpilot 2. Skyline
https:///labkey/wiki/home/software/Skylin e/page.view?name=default
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1. MRMpilot
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基于质谱技术的绝对定量蛋白质组学
尹红锐 20130730
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定量蛋白质组学
相对定量蛋白质组学：也称比较蛋白质组学，是指对不同 生理病理状态下，细胞、组织或体液蛋白质表达量进行的 相对比较分析。 绝对定量蛋白质组学：测定蛋白质组中每种蛋白质的 绝对量或浓度。
Journal of Chinese Mass Spectrometry Society,2008
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绝对定量蛋白质组学
一. 基于内标法的蛋白质绝对定量
1.同位素标记的氨基酸作为内标的蛋白质组绝对定量 2.基于电感耦合等离子体质谱测定元素的蛋白质绝对定量 3.非同位素标记的肽段用于蛋白质组的绝对定量 4.基于同位素标签标记的肽段用于蛋白质组的绝对定量 5.同位素标记的肽段作为内标的蛋白质组绝对定量
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4700 Reflector Spec #1[BP =1045.6, 9208]
1045.6154
100
90
脱氨峰
QPGITFIAAK
9.2E+3
80
70
% Intensity
60
1028.5872
50
40
30
1066.5405 1067.5951
1027.5599
20
1014.5726 1001.6035 1010.5829
一. 基于内标法的蛋白质绝对定量
1.同位素标记的氨基酸作为内标的蛋白质组绝对定量 2.基于电感耦合等离子体质谱测定元素的蛋白质绝对定量 3.非同位素标记的肽段用于蛋白质组的绝对定量 4.基于同位素标签标记的肽段用于蛋白质组的绝对定量 5.同位素标记的肽段作为内标的蛋白质组绝对定量
二. 非标记(Label-free)蛋白质组绝对定量
Anal. Chem. 2004
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2. mTRAQ
与肽段的N-端以及赖氨酸上的伯胺基反应，引入质量标签。
Proteomics, 2013
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2.生物合成
QconCAT:
Nature protocols,2006
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小结
MRM实验设计：
目的蛋白的 选择
目的肽段的 选择
方法的开发比较费时
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同位素标记肽段的获得方法
1.化学合成 （使用最广泛） a)直接合成含有重标同位素的肽段
（专门的合成公司,成本较高）
b）先合成不含有重标同位素的肽段，再使用化学标记
的方法在肽段上引入重标同位素。
2.生物合成
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化学标记方法
1.18O 标记
在肽段的C-端引入两个18O原子，产生4 Da 的差异。
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SWATH工作流程
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谢谢大家！
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