病理学常用技术的原理及应用PPT课件

肌动蛋
雄激素受体
CD3-T细胞
雌激素受体（ER）
影响免疫组化染色质量的因素： 取材及固定 抗体质量 抗原封闭和修复 技术操作
3、免疫组化的应用 大量商品化的单克隆和多克隆抗体出现、 配套试剂盒的使用及方法学的不断完善，使 免疫组织化学染色已经成为医学基础研究和 病理外检中应用最为广泛的技术手段之一。 免疫组化技术可用于各种蛋白质或肽类物 质表达水平的检测、细胞属性的判定、淋巴 细胞的免疫表型分析、细胞增殖和凋亡的研 究，激素受体和耐药基因蛋白表达检测，以 及细胞周期和信号转导的研究等。 免疫组织化学染色技术也是非放射性原 位杂交、原位 PCR 和原位末端标记 DNA 片段 等技术的基础。
探针的选择和标记 用于原位杂交的探针有双链 cDNA 探针、 单链cDNA探针、单链cRNA探针和合成的寡 核苷酸探针等。 探针的长度以50-300个碱基为宜，用于染 色体原位杂交的探针可为 1.2 ～ 1.5kb。探针 标记物有放射性同位素如 3H、35S、32p 等， 这类探针的敏感性高；非放射性探针标记物 有荧光素、地高辛和生物素等，其敏感性不 如放射性标记探针，但有性能稳定、操作简 便、成本低和耗时短等优点。
原位PCR技术方法
原位 PCR 技术有直接法原位 PCR、间接法 原位 PCR、原位反转录 PCR 和原位再生式序列 复制反应等方法，其中应用相对较广泛的是间 接原位PCR方法。 主要程序有组织固定、预处理 ( 如蛋白酶 K 和 RNA 酶消化 ) 、原位扩增及扩增产物的原位 杂交和检测等。由于使用原位杂交技术对扩增 产物作检测，使该方法的特异性较直接法高。
第三节 电子显微镜技术
透射电子显微镜是最早、最广泛应 用于医学领域的一种电镜，以后又相继 诞生了扫描电镜、超高压电镜等。电镜 的使用大大地开阔了我们的视野，看清 了细胞膜和细胞浆内的各种细胞器和细 胞核的细微结构及其病理变化，并由此 产生了亚细胞结构病理学，又称超微结 构病理学。
电镜技术的应用
在生命科学领域可用于胚胎及组织发生学方 面的研究和观察；在临床上可用于多种疾病亚 细胞结构病变的观察和诊断，特别是肾小球疾 病及肌病的诊断，以及一些疑难肿瘤的组织来 源和细胞属性判定，如一些去分化、低分化或 多向分化肿瘤的诊断和鉴别诊断；最早关于细 胞凋亡的形态学描述也是源于电镜的观察。
病理学常用技术的原 理及应用
第一节 大体与组织病理学技术
大体观察—主要运用肉眼或辅以放大镜、 量尺和磅秤等工具，对大体标本及其病变性 状进行细致的观察和检测。
组织和细胞学观察— 将病变组织制成切片 染色，或脱落、穿刺细胞涂片染色，显微镜 观察。
第二节 组织化学与免疫组织化学
（一） 组织化学
一般称特殊染色，通过应用某些组织化 学成分特异性结合的显色试剂，显示病变组 织细胞的化学成分(如蛋白质、酶类、核酸、 糖类、脂类等），从而加深对形态结构和代 谢改变的认识，弄清形态改变与代谢改变的 关系。如过碘酸Schiff反应（PAS）或区别骨 Ewing肉瘤和淋巴瘤，前者胞浆内含有糖原呈 阳性，后者阴性，磷钨酸苏木精染色可显示 横纹肌肉瘤中瘤细胞胞浆中的横纹。
1、免疫组织化学染色方法 按标记物性质分：荧光法、酶法、 免疫金、银及铁标记技术等。 按染色步骤分：直接法、间接法。 按结合方式分：抗原-抗体结合法、 亲和连接法、标记的链亲和素-生物 素法等。
2、免疫组化染色的质量控制和结果 阳性表达方式： （1）胞浆阳性 （2）核周胞浆阳性 （3）胞浆局限性点状阳性 （4）细胞膜阳性 （5）细胞核阳性
第四节原位多聚酶链式反应技术
原位多聚酶链式反应技术是多聚酶链式反 应(polymerase chain reaction，PCR)技术的一 部分，是在体外经酶促反应将某一特定DNA序 列进行高效、快速扩增，它可将单一拷贝或低 拷贝的待测核酸以指数的形式扩增而达到常规 方法可检测的水平。原位PCR(in situ PCR)技术 是将PCR 的高效扩增与原位杂交的细胞及组织 学定位相结合，在冷冻或石蜡包埋组织切片、 细胞涂片或培养细胞爬片上来检测和定位核酸 的技术。
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（二）免疫组织化学
是利用抗原抗体的特异性结合反应 来检测和定位组织或细胞中的某种化学 物质的一种技术，有较高的敏感性和特 异性，能将形态学改变与功能、代谢变 化结合起来，直接在组织切片、细胞涂 片、培养细胞爬片上定位某些蛋白质或 多肽类物质，结合计算机图像分析技术 或激光扫描共聚显微术等，对被检物质 进行定量分析。
原位PCR技术的应用及存在的问题 应用：原位PCR技术能用于低拷贝的
内源性基因的检测和定位，可用于基因 突变、基因重排和染色体易位等的研究 和观察；还可用于外源性基因的检测和 定位，如对各种感染性疾病病原的基因 检测，如 EB 病毒、人乳头状瘤病毒、肝 炎病毒、巨细胞病毒和人免疫缺陷病毒 基因组及结核、麻风杆菌基因的检测等； 在临床上还可用于对接受了基因治疗患 者体内导人基因的检测等。
随着电镜技术的不断发展，以及与其 他方法的综合使用，还出现了免疫电镜、 电镜细胞化学技术、电镜图像分析技术 及全息显微术等。 电镜技术也有其局限性，如电镜设备 昂贵、样本制备较复杂、实验费用较高； 另外，由于样本取材少，观察范围有限， 有时还可能会遗漏信息；当用于辅助肿 瘤外检诊断时，只能判定组织或细胞的 来源，不能确定肿瘤的良恶性。
存在的问题： ①特异性不高，特别是假阳性的问题。产 生的原因有引物与模板的错配、在扩增中因 细胞内受损伤DNA的修复而形成的非特异性 序列和特异性扩增序列的弥散等。 ②技术操作复杂，影响因素太多。 ③需要特殊的设备，即原位 PCR 仪，价格 昂贵。
第五节核酸原位杂交
原位杂交是核酸分子杂交的一部分，是 将组织化学与分子生物学技术相结合来检测 和定位核酸的技术。用标记了的已知序列的 核苷酸片段作为探针，通过杂交直接在组织 切片、细胞涂片或培养细胞爬片上检测和定 位某一特定的靶DNA或RNA的存在。其生物 化学基础是DNA变性、复性和碱基互补配对 结合。根据所选用的探针和待检靶序列的不 同，有DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交和 RNA-RNA杂交。