蛋白质和氨基酸的呈色反应

蛋白质和氨基酸的呈色反应

实验1 蛋白质和氨基酸的呈色反应

目的要求

(1)学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法及其原理。

(2)学习几种鉴定特定氨基酸的特殊颐色反应及其原理。

(3)学会区分糖、脂类和蛋白质的简便方法，包括颜色反应、溶解度、燃烧后的气味及灰分等。

原理

一、蛋白质和氨基酸鉴定常用方法

蛋白质所含有的某些氨基酸及其特殊结构，可以与某些试剂反应、生成有色物质。1．双缩眠反应

当脲(即尿素)加热至l80℃时．两分子脲缩合，放出一分子氨而形成双缩脲(biuret)。

然后在碱性溶液中与铜离子(cu2+)结合生成复杂的紫红色化合物。这一呈色反应称为双缩脲反应。

紫红色铜双缩服复合物分子结构见下页图。

蛋白质或二肽以上的多肽分子中，含有多个与双缩脲结构相似的肽键，因此也有双缩脲反应。应当指出，含有—个CS—NH2、一CH2一NH2，一CRH—NH2，一CH2一NH2—CHNH2一CHOH-CH2NH2，-CHOH—CH2NH2等基团的物质，甚至过量的铵盐也干扰本实验。

2．Salkowski(1888)蛋白黄色反应

它是芳香族氨基酸，特别是有酪氨酸和色氨酸蛋白质所特有的呈色反应。苯丙氨酸和苯反应很困难。皮肤、指甲和毛发等遇浓硝酸变黄，原因在此。

硝基苯衍生物呈黄色，在碱性溶液中，它进一步形成深橙色的硝醌酸钠。参考反应是：

3．茚三酮反应

蛋白质、多肪和各种氨基酸具有茚三酮反应。除无α—氨基的脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色外。其他氨基酸生成紫红色．最终为蓝色化合物。

操作步骤

1.双缩脲反应

（1）取一支干燥的试管，加入少量尿素，用微火加热使尿素熔化，待融化的尿素重又开始硬化时停止加热，此时尿素已缩合成双缩脲并放出氨（可由其嗅味辨别）。试管冷却后，加入约1毫升10％氢氧化钠溶液，振荡使双缩脲溶解，再加入1滴1％硫酸铜溶液，混匀后观察出现的粉红色，此反应即为双缩脲反应。注意，避免加入过量的硫酸铜，否则生成蓝色的氢氧化铜能掩盖生成的粉红色。

（2）取两支试管，分别放入2滴蛋白质溶液及20滴黄豆抽提液，再加入5滴10％氢氧化钠溶液，摇匀，再加入一滴1％硫酸铜溶液，再摇动，观察颜色变化，出现紫红色

表示有蛋白质存在。

2. Salkowski(1888)蛋白黄色反应

（1）取一支试管，加蛋白质溶液4滴及浓硝酸2滴。由于强酸作用，出现蛋白质沉淀。用微火小心加热，不必热至沸腾，则沉淀变成黄色。冷却后，逐滴加入10％氢氧化钠溶液，当反应液呈碱性时，颜色由黄色转变成深橙黄色。

另取一支试管，用黄豆提取液20滴，按同样方法进行蛋白黄色反应。

（2）取一支试管，用0.05％苯酚溶液代替蛋白质溶液，重

复上述操作，注意黄色的生成及最后变成橙色。

（3）剪一些指甲和头发分别放入2支试管中，各加入数滴浓硝酸，观察颜色的变化。

3.茚三酮反应

（1）取一支试管，加入蛋白质溶液4滴，0.5％茚三酮－乙醇溶液2滴，混匀后于小火上煮沸1～2分钟，放置冷却。观察颜色由粉红色变成紫色，直到蓝色。

另取2支试管，用0.5％酪蛋白和0.5％甘氨酸溶液分别进行茚三酮反应。注意观察颜色变化。

（2）在一块滤纸片上滴加1滴0.5％甘氨酸溶液，风干后，加1滴0.1％的茚三酮－乙醇溶液显色，在小火上烘干。观察出现的紫红色斑点。

器材和试剂

1.器材：试管、酒精灯、滤纸

2.试剂：尿素、0.5％甘氨酸、0.5％脯氨酸、0.5％酪蛋白、浓硝酸、0.1％茚三酮乙醇溶液、10％氢氧化钠

实验报告

自己设计表格记录实验现象，以“十”和“一”表明阳性、阴性反应，标明颜色并以“＋”、“＋＋”和“＋＋＋”表明颜色深浅程度。

思考题

1 综合分析、对比蛋白质和各种氨基酸鉴定方法的特点和用途。

2．如果蛋白质水解作用一直进行到双缩脲反应呈阴性结果。能对此作何结论?

3．茚三酮反应的阳性结果是否经常是同一色调?若不是。为什么?

4．是否所有的氨基酸都呈现黄色反应的阳性结果，为什么?是否大部分蛋白质呈现阳性结果。为什么?