动物细胞大规模培养生产蛋白的工艺选择

搅拌 ,悬浮灌流培养 无报道
无血清 无报道
RituximabΠRituxan 淋巴瘤
Coagulation factor Ⅸ 重组凝集因子
IDEC PharmaceuticalΠ Genentech
Genetics Institute
11Π26Π97 2Π11Π97
嵌合抗体 重组糖蛋白
CHO
搅拌 ,悬浮培养
3Π29Π96
疫苗
肝过滤病毒疫苗 灭活狂犬病毒
FRhL22 无报道
Not revealed 无报道
灭活病毒
人二倍体 Adherent , NCF to Costar Cubes
纤维母细胞
连续流加培养
组织培养产品
无报道
含胎牛血清 无报道 含血清
自体同源培养 chondrocytesΠCarticel
软骨缺陷修复
动物细胞大规模培养已成为生物制药领域最 重要的关键技术之一 ,并以其研究的深入和进展推 动生物技术产业的迅速发展 。专家预言 :蛋白治疗 药物如糖蛋白 ,抗体和多肽药物仅仅只是开始进入 市场 ,预计在下一个 10 年或 20 年会有一个更为快 速的发展 。蛋白治疗药物的迅速增长和市场需求 已远远超过目前全世界的生产能力[1] 。
由于动物细胞表达产品需求的紧迫性和生产 工艺的复杂性 ,大大促进了该技术的深入研究与发 展 。80 年代初首先兴起了生物反应器研究 ,许多 形式的生物反应器被用于哺乳动物细胞培养工艺 的研究 ,如中置搅拌系统 ,固定单层培养和中空纤 维系统等 。近 10 年的研究在解决动物细胞大规模 培养的关键屏障技术 ,如限制性氧气的提供 ,消耗 产物的积累 ,成熟精确的过程控制 ,剪切力的敏感 性 ,和贴壁细胞培养规模化放大等问题都取得可喜 的进展[2] 。目前动物细胞工业化生产中主要致力 于提高单位细胞的生产力 ,确保产品质量和过程工 艺设计的一致性 ,减少工业化生产中的污染与自动 化控制等[3] 。以转基因动物和转基因植物为载体 的重组蛋白生产在生物制药领域仍具有重要的地 位 ,特别对于每年 100kg 的超大规模需求量生产 。
因此 ,目前用哺乳动物细胞大规模培养生产蛋 白的工业化过程 ,可以看作是以搅拌式生物反应器 悬浮培养作为通用技术平台 ,使用常用的 3 种细胞
(CHO 、SP2Π0 、NSO) 依托该平台工艺并使其生产能 力提高 。平台工艺的特点是采用无血清培养和成 熟的流加和灌流工艺 。
2 目前公开发表工艺的研究
悬浮培养适于许多细胞培养 ,如杂交瘤 、鼠骨 髓瘤 (SP2Π0 ,NSO) ,对适于贴壁培养的细胞 ( CHO , BHK) 可进行细胞生长形式的驯化 。目前已发表的 大量文献 ,就继续深入研究和进一步解释如何提高 单位细胞的生产力 ;如何优化培养环境获得最高的 产量 ,同时保持最好的产品质量 ;如何去除培养液 中动物来源的成分 ,使大规模生产中的污染最小 化 ;如何控制培养过程中的 CO2 的积累等进行了论 述。
目前被批准的生物技术产品以及公开发表的 工业化生产工艺 ,都建立在这个产品进入临床研究 之前 ,因此这些技术不代表当前动物细胞研究发展 的趋势 ,在工业化逐级放大生产过程中有些已体现 出一定的滞后问题[3] 。
第7期
米 力 等 :动物细胞大规模培养生产蛋白的工艺选择
3
当前哺乳动物细胞培养工艺中占有主流优势 的是悬浮搅拌式培养工艺 ,特别是在重组治疗性蛋 白和抗体的规模化生产 。在工业化生产中 ,悬浮培 养工艺参数的放大原理和过程控制比其它培养系 统较易理解和掌握 ,因此在规模化动物细胞培养生 产中多选择悬浮细胞培养工艺 (表 1) 。Moran 等[4] 和 Schenerman 等[5] 悬浮流加培养 CHO 、NSO 细胞 , 在 Ⅰ2 Ⅲ期临床研究单抗的生产放大中使用了 202 452100L 生物反应器 ,工业化生产放大到 500220002 10000L ,放大过程的工艺性能和产品特点都非常相 似 。Sauer 等用搅拌式生物反应器 ,无血清流加培 养 SP2Π0 、NSO 细胞生产人源化 IgG 抗体 ,工艺优化 过程从 3L215L2750L 直接放大 ,其细胞密度 ,特异性 抗体产生率和产品质量非常相似 。作者认为一个 好的细胞培养平台系统可适用于许多不同重组蛋 白或抗体的生产 ,选择适宜的平台系统可有意义地 减少工艺过程所需的时间[6] 。
含庆大酶素
CHO
搅拌 ,悬浮 ,反复批式培养
无血清
Interferon21aΠAvonex 治疗复杂性硬化
轮状病毒 狂犬病毒
甲肝疫苗
Biogen
Wyeth Laboratories Chiron Behring Merck & Co
5Π17Π96
重组糖蛋白
CHO
搅拌 ,悬浮培养
8Π31Π98 10Π20Π97
以下就目前动物细胞大规模培养成熟工艺与 当前研究的问题 、对策作一简述 。
1 目前美国 FDA 批准的产品与生产工艺
1996 年 1 月至 2002 年 12 月美国获得成功批 准的不同的治疗剂和诊断剂产品共 31 种 ,其中用 哺乳动物细胞培养生产的就有 21 种 (美国 FDA 网 页 http :ΠΠwww. fda. gov) 。蛋白治疗药物有单克隆抗 体治疗乳腺癌的 Herceptin ,免疫球蛋白肿瘤坏死因 子( TNF) 受 体 融 合 蛋 白 治 疗 类 风 湿 性 关 节 炎 的 Enbrel 和灭活的甲肝疫苗 Vaqta 等 。动物细胞培养 技术已经成为一个受到普遍信任的产业化生产技 术 ,并逐步形成商业化操作水平 。按技术应用专利 的分类 ,我们将这些产品分为重组治疗药物 、疫苗 、 组织培养产品和诊断试剂并连同他们的生产形式 列于表 1 。
9Π25Π98
嵌合抗体
CHO
无报道 连续灌流 搅拌生物反应器 ,悬浮
无报道 无血清 无血清
InfliximabΠRemicade Crohn’s disease
Centocor
8Π24Π98
嵌合抗体
NS0
搅拌 ,悬浮灌流培养
无血清
PalivizumabΠSynagis 预防呼吸道病毒
MedImmune
收稿日期 :2003204210 3 国家重大科技专项 (2002AA2Z3441) 3 3 通讯作者 ,电子信箱 :chcerc2 @fmmu. edu. cn
目前被美国 FDA 批准的生物技术产品和已公 开发表的生产工艺 ,都是较为成熟的工艺 ,并不代 表当前动物细胞研究发展的趋势 。因此动物细胞 大规模培养生产蛋白或抗体的工艺选择 ,应综合考 虑产品特点 、工艺难度与工艺研发时间 ,以加速其 产品产业化的进程 。
6Π19Π98
wenku.baidu.com
嵌合抗体
NS0
搅拌 ,悬浮流加培养
无血清
BasiliximabΠSimulect 预防急性器官排斥
DaclizumabΠZenapax 预防急性器官排斥
Novartis Pharmaceuticals
Hoffman2LaRoche
5Π12Π98 12Π10Π97
嵌合抗体 嵌合抗体
鼠骨髓瘤 SP2Π0
自体同源细胞 软骨细胞
诊断试剂产品 抗体
慢性感染人 T、B 淋巴细胞
鼠 IgG1
杂交瘤
鼠 IgG2b Fab 抗体 杂交瘤
组织培养饼
无报道 中空纤维反应器
无报道
含血清
无报道 无血清含牛血清 白蛋白 ,转铁蛋白
无血清
Imciromab pentetate 心肌诊断
Centocor
7Π3Π96 鼠 IgG2 Fab 抗体 杂交瘤
无报道
血清 ,含庆大酶素
a) 2000 年至今又有 7 个动物细胞表达的重组蛋白和抗体药物被 FDA BLA 批准 ,但因多数无有关工艺的报道 ,此表未显示
产量与质量 ,其生产形式至少 70 %是采用搅拌式 生物反应器悬浮培养形式 ,50 %以上采用无血清培 养 ;疫苗和组织替代品其产品来源许多不用的细胞 系 ,它需要特殊的生物反应器系统和培养液 ;虽然 用于诊断的产品主要是单克隆抗体 ,类似于重组治 疗 ,但需求量明显低 ,这就允许考虑多种特殊的生 产形式和生物反应器系统 。
人 T 淋巴细胞病毒 用于酶联 ELISA Capromab pendetide 肿瘤诊断
NofetumomabΠVerluma 肿瘤诊断
Genzyme Tissue Repair
Abbott Laboratories Cytogen
Dr Karl Thomae
8Π22Π97
8Π15Π97 10Π28Π96 8Π20Π96
总结表 1 的数据 ,在 21 种产品中有 11 种产品 是用 3 种主要的细胞系 CHO 、SP2Π0 、NSO 生产的重 组蛋白治疗药物 。首先重组治疗药物 ,主要是重组 蛋白或抗体 ,对产品应用最有代表性的需要是生产
2
中 国 生 物 工 程 杂 志
第 23 卷
表 1 BLA 哺乳动物细胞培养系统来源产品详细数据a) ( 1996～2000)
细胞培养过程的有效工艺参数控制 , Enda 等 在两组流加悬浮培养的不同工艺参数控制 (如 pH , 温度) ,结果温度控制为 34 ℃比较 37 ℃,平均生长 率降低而特异产物生产率提高 ;当细胞外 pH 维持 在 > 812 和 < 619 时 ,重组蛋白的糖基化将发生有 意义的改变[11] 。
悬浮贴壁细胞培养的传统方法是采用转瓶 、堆 积床和微载体悬浮培养 ,转瓶和堆积床培养的放大 生产受到很大的限制 ,悬浮微载体培养是目前疫苗 生产常采用的一种形式 。Wiktor 等用悬浮微载体 培养 Vero 细胞生产狂犬疫苗 ,初始工作种子在 1L 生物反应器培养 ,然后是放大至 5L225L2150L 生物 反应器 ,以后还可在放大到 1000L 或采用多个 150L 的生物反应器 ,最后有效地感染病毒[7] 。非传统的 贴壁细胞培养选用气升式生物反应器 、膜透析生物 反应器和填充床灌流培养等 。 211 悬浮细胞培养工艺
BLA 产品名
厂商
批准日期
产品形式 重组蛋白
细胞系
方法
培养液
TenecteplaseΠTNKase 急性心肌梗死
Genentech
6Π2Π00
重组糖蛋白
CHO
抗血友病因子
Genetics Institute
3Π6Π00
重组糖蛋白
CHO
TrastuzumabΠHerceptin 转移性乳腺癌
Genentech
第 23 卷第 7 期
中 国 生 物 工 程 杂 志
CHINA BIOTECHNOLOGY
2003 年 7 月
动物细胞大规模培养生产蛋白的工艺选择 3
米 力 陈志南 3 3
(第四军医大学细胞工程中心 国家 863 西安细胞工程基地 西安 710032)
摘要 目前全世界蛋白治疗药物的迅速增长和市场需求已远远超过了现有生产能力 。动物细胞 规模化生产重组蛋白和抗体的工艺选择可考虑使用当前较成熟的工业化支持技术平台 ,以缩短 产品工艺研发的时间 ,加快工业化进程 。当前被 FDA 批准的生物技术产品以及公开发表的生产 工艺占有主流优势的是搅拌式生物反应器悬浮培养 ,工艺设计是流加或灌流培养 。其大规模细 胞培养生产所面临的挑战是获得最大生产力的同时注重维持产品的质量 ;去除所有培养环境中 外源因子的污染 ,更为精确有效的工艺控制手段 ,规模化培养中氧气的限定与溶解 CO2 浓度累积 的控制等 。 关键词 动物细胞 大规模培养 生产蛋白
在大规模细胞培养中 ,细胞死亡是维持细胞高 活性和高密度的最大障碍 ,由于在悬浮培养工艺 中 ,细胞的死亡主要是因凋亡所致 。通过导入凋亡 抑制基因 (Bcl22) 来调节细胞抗凋亡的机制 ,延长细 胞生存时间 ,促细胞活力和增加抗体的产量[8] 。
悬浮培养工艺中影响细胞生产数量和质量的 因素 ,主要应考虑细胞培养环境 (营养条件 、产物积 累 、pH、温度和渗透压) ,终产物 (乳酸和氨) 毒性累 积和必需营养物的添加等 。设计适应细胞生长的 无血清培养基 ,控制营养物的添加 ,减少产物消耗 积累是解决问题的有效手段 。1996 年 Xie 等[9] 运 用化学计量法 ,根据动物细胞生长的需求 ,设计定 量添加浓缩的培养液 ,将葡萄糖 、谷氨酰氨的浓度 维持在一个低水平 ,以改变细胞代谢方式 。在杂交 瘤细胞流加培养周期超过 550h ,比较一般流加工艺 特异性乳酸生成率减少了 4 倍 ,特异性氨生成率减 少了 10 倍 ,细胞密度 5 ×107Πml ,峰值的活细胞密 度大于 115 ×107Πml ,抗体累积浓度为 214mgΠml[10] 。