02细胞生物学第二章 细胞生物学研究方法

（四）暗视野显微镜 dark field microscope
• 聚光镜中央有挡光片，照明光线不直 接进人物镜，只允许被标本反射和衍 射 的光线进入物镜，因而视野的背景 是黑 的，物体的边缘是亮的。
• 可观察 4~200nm的微粒子，分辨率 比普通显微镜高50倍。
（五）相差显微镜
• 相差显微镜在结构上进行了特别设计，尤其是光学系统有很 大的不同， 可用于观察未染色的活细胞 .由P.ZEMIKE于1932年 发明,并因此获1953年诺贝尔物理奖.
透射电镜
—、光学显微镜 （一）普通光学显微镜 •1. 构成： • ①照明系统 • ②光学放大系统 • ③机械装置 •2. 原理：经物镜形成倒 立实像，经目镜进一步 放大成像。
透镜的像差 •球面像差 •慧形像差 •像散 •像场弯曲 •畸变 •色差
球差：由主轴上某一物点向光学系统发出的单色圆锥形光束，经该光学系 列折射后，若原光束不同孔径角的各光线，不能交于 主轴上的同一位置， 以至在主轴上的理想像平面处，形成一弥散 光斑（俗称模糊圈），则此光 学系统的成像误差称为球差。
A Yeast Cell
冰冻断裂与 冰冻蚀刻技术
（二）扫描电子显微镜
•20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。
• 分辨力为6~10nm ，由于人眼的分辨力 （区别荧光屏上距离 最近两个光点的能力 ）为0.2mm，扫描电 镜的有效放大倍率为 0.2mm/10nm=2000 0X。
• 工作原理：是用一束极细的电子束扫描样 品，在样品表面激发出次级电子，次级电子 的多少与样品表面结构有关，次级电子由探 测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电 子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图 像。
• 紫外蓝光激发滤板：此滤板可使300～450nm范围内 的光通过。常用型号为ZB-2或ZB-3，外加BG-38。
• 紫蓝光激发滤板：它可使350～490nm的光通过。常 用型号为QB24（BG12）。
• 最大吸收峰在500nm以上者的荧光素（如罗达明色素 ）可用蓝绿滤板（如B-7）激发。
压制滤板（阻断滤板）
二、电子显微镜
（一）透射电子显微镜 transmission electron microscope, TEM
1. 原理
• 以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速电 压(通常50~120KV)的平方根成反比。 • 由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统 等5部分构成。 • 分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。 • 用于观察超微结构（ultrastructure），即小于0.2µm、光学 显 微 镜 下 无 法 看 清 的 结 构 ， 又 称 亚 显 微 结 构 (submicroscopic structures)。
场曲：垂 于主轴的平面物体经光学系统所成的清晰 影像，若不在一垂直于主轴的像平面内，而在 以主 轴为对称的弯曲表面上，即最佳像面为一曲面，则 此光学系统的成像误差称为场曲。
畸变：被摄 物平面内的 主轴外直线， 经光学系统 成像后变为 曲线，则此 光学系统的 成像误差称 为畸变。
色差：由白色物点 向光学系统发出一 束白光，经该光学 系列折射后，组成 该束白光的红、橙、 黄、绿、青、蓝、 紫等各色光，不能 会聚于同一点，即 白色物点不能结成 白色像点，而结成 一彩色像斑的成像 误差，称为色差。
• 为了使标本表面发射出次级电子，标本在 固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重 金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。
酵母
（三）扫描隧道显微镜
scanning tunneling microscope，STM
• 原理：根据隧道效应而设计，当原子尺度的针尖在不 到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外 加一电压（2mV~2V），针尖与样品之间形成隧道电流 。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描 过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的 凹凸形态。
（八）倒置显微镜 inverse microscope
• 物镜与照明系统 颠倒，前者在载物 台之下，后者在载 物台之上，用于观 察培养的活细胞， 通常具有相差物镜 ，有的还具有荧光 装置。
（九）当代显微镜 的发展趋势
• 采用组合方式，集 普通光镜加相差、 荧光、暗视野、 DIC、摄影装置于一 体。 • 自动化与电子化。
• 把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种 结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差 显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。
1. 环形光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间。
2. 相位板（annular phaseplate ）：物镜中加了涂有氟化镁的相 位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。
• 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。 • 能显示细胞样品的立体结构。 • 分辨力是普通光学显微镜的3倍。 • 用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成 立体图像。
laser confocal scanning microscope, LCSM
Confocal microscopy is primarily monochromatic, but by using two detection wavelengths we can image two fluorochromes in appropriate colours.
Indo-1 used to demonstrate calcium signalling in motile fiila 果蝇
red: Microtubules, Cy3 blue: DNA, DAPI
Courtesy of Dr. R. Hartig, MaxPlanckInstitute, Ladenburg, Germany
• 载物台是可以旋转。
（七）微分干涉差显微镜 Differential interference contrast microscope (DIC)
1952 年，Nomarski发 明，利 用两组平面偏振光的 干涉 ，加强影像的明暗效果 ，能显示结构的三维立体投 影 。标本可略厚一点 ，折射 率差别更 大 ， 故 影 像 的 立 体 感 更强。
3 紫外紫光压制滤板：能通过460nm以上波长的荧光（蓝到 红），可与BG-3组合，常用OG-11K470AK 490，
K510。
用于观察能 激发出荧光 的结构。用 途：免疫荧 光观察、基 因定位、疾 病诊断。
（三）激光共聚焦扫描显微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM
• 分辨率：横向为0.1~0.2nm，纵向可达0.001nm。
• 压制滤板的作用是完全阻挡激发光通过，提供相应滤长范 围的荧光。与激发滤板相对应，常用以下3种压制滤板：
1 紫外光压制滤板：可通过可见光、阻挡紫外光通过。能与 UG-1或UG-5组合。常用GG-3K430或GG-6K460。
2 紫蓝光压制滤板：能通过510nm以上滤长的荧光（绿到红 ），能与BG-12组合。通常用OG-4K510或OG-1K530。
2）负染技术
• 用重金属盐(如 磷钨酸)对铺展 在载网上的样品 染色；吸去染料 ，干燥后，样品 凹陷处铺了一层 重金属盐，而凸 出的地方没有染 料沉积，从而出 现负染效果，分 辨力可达1.5nm 左右。
烟草rattle 病毒的负 染色
3）冰冻蚀刻 freezeetching
• 亦称冰冻断裂。标 本置于干冰或液氮中 冰冻。然后断开，升 温后，冰升华，暴露 出了断面结构。向断 裂面上喷涂一层蒸汽 碳和铂。然后将组织 溶掉，把碳和铂的膜 剥下来，此膜即为复 膜（replica）。
表二、不同光线的波长
可见光
紫外光 X 射线
波长（nm） 390~760 13~390 0.05~13
α 射线 0.005~1
电子束 0.1Kv 10Kv 0.123 0.0122
2、制样技术
• 1）超薄切片 • 电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成 厚度仅50nm的超薄切片，用超薄切片机（ ultramicrotome）制作。 • 通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水， 环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片， 重金属（铀、铅）盐染色。
•
3. 分辨力：指分
辨物体最小间隔的能力。
• R=0.61λ/N．A．
- 其中λ为入射光线波 长；
- N．A．为镜口率(数 值孔径) ＝ｎsinα/2，
- n=介质折射率；α=镜 口角（样品对物镜镜口 的张角） 。
• 思考：如何提高显微镜的分辨能力？ -角孔径越大，进入物镜的光越多；介质的折射率越大，则数值孔径越大，这 些都可以使分辨率提高 - NA越大，分辨率越高，或者波长越短，分辨率越高 。
（二）荧光显微镜
• 工作原理：
-利用紫外线发生装置 (如汞)发出强烈的紫 外线光源，通过显微 固定的切片或活染的 细胞。
-•
特点：
光源为紫外线，波长 较短，显微镜有两个 特殊的滤光片；照明 方式通常为落射式。
激发滤板
• 紫外光激发滤板：此滤板可使400nm以下的紫外光 透过，阻挡400nm以上的可见光通过。常用型号为UG1或UG-5，外加一块BG-38，以除去红色尾波。
慧差：由位于主 轴外的某一轴外 物点，向光学系 统发出的单色圆 锥形光束，经该 光学系列折射后， 若在理想像平面 处不能结成清晰 点，而是结成拖 着明亮尾巴的慧 星形光斑，则此 光学系统的成像 误差称为慧差。
像散：由位于主 轴外的某一轴外 物点，向光学系 统发出的斜射单 色圆锥形光束， 经该光学系列折 射后，不能结成 一个清晰像点， 而只能结成一弥 散光斑，则此光 学系统的成像误 差称为像散。
Spirogyra crassa 水绵
Maximum projection green: Actin. Rhodamin, Label: Phalloidin. Actin red: Chloroplasts. Autofluorescenc e Image acquired with the Leica TCS SP2
用途：观察未经染色的玻片标本
（六）偏光显微镜 polarizing microscope
• 用于检测具有双折射 性 的 物质 ， 如 纤 维 丝 、 纺 锤 体 、淀粉、胶原、染 色体等。
• 光源前有偏振片 （起偏 器 ），使 进 入 显 微 镜 的 光 线 为 偏 振光，镜筒中有 检偏器 （与起偏器方向垂 直的偏振片）。
Drosophila Egg
The 3D series is a Drosophila stage 11 egg chamber stained with hu-li tai shao antibodies (green) and rhodamineconjugated phalloidin (red)
第二章 细胞生物学研究方法
本章内容提要
• 第一节 显微技术 • 一、光学显微镜 • 二、电子显微镜 • 三、显微操作技术 • 第二节 生物化学与分子生物学技术 • 第三节 细胞分离技术 • 第四节 细胞培养与细胞杂交
第一节 显微技术
• 光学显微镜： - 以可见光（或紫 外线）为光源。 • 电子显微镜： - 以电子束为光源。
表一、几种介质的折射率
介质
空气
水
折射率 1
1.33
香柏油 α 溴萘 1.515 1.66
• 显微镜的几个光学特点： • 制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的折射 率越接近玻璃 的越好。
• sin α /2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般为 0.05~0.95；油镜 头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。 • 分辨极限(limit resolution) • 放大率(magnification) - 总放大率 = 物镜放大率×目镜放大率 - 普通光线的波长为400~700nm，分辨力数值不会小于0.2μm，人 眼的分辨力为0.2mm,因此显微镜的最大设计倍数为1000X。