双向电泳技术和实验流程PPT课件
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《双向电泳技术》课件
高通量
该技术可以同时分离大量蛋白质，提高了实 验的通量。
高稳定性
该技术具有较高的稳定性，实验结果重复性 好。
缺点
实验周期长
双向电泳技术的实验周期较长 ，需要耗费较多的时间和人力
。
对样品要求高
该技术需要大量的起始样品， 并且对样品的纯度要求较高。
对实验条件要求严格
双向电泳技术的实验条件较为 苛刻，需要精确控制实验参数 。
在药物研发中的应用
总结词
双向电泳技术为药物研发提供了高通量和高效率的蛋白质分离手段，有助于发现潜在的药物靶点和筛 选候选药物。
详细描述
在药物研发过程中，双向电泳技术可用于分析药物对蛋白质表达谱的影响，从而发现药物作用的靶点 。此外，通过比较不同物种或组织的蛋白质表达谱，可以发现潜在的药物靶点，为新药研发提供思路 和候选药物。
应用领域的拓展
疾病诊断与治疗
利用双向电泳技术分析疾病相关蛋白质，为疾病诊断 和治疗提供依据。
药物研发
通过双向电泳技术筛选药物作用靶点，加速新药研发 进程。
生物工程与农业
在生物工程和农业领域中应用双向电泳技术，优化生 物过程和育种。
未来发展方向与挑战
标准化与规范化
建立双向电泳技术的标准化操作流程和质量控制体系，提高实验 结果的可靠性和可比性。
CHAPTER 02
双向电泳技术的实验流程
样本制备
01
02
03
样本选择与处理
选择适当的组织或细胞样 本，进行适当的处理以提 取蛋白质。
蛋白提取
使用适当的缓冲液和试剂 ，从样本中提取蛋白质。
蛋白定量
使用蛋白质定量方法，确 定蛋白质的浓度。
蛋白质提取
溶解蛋白质
蛋白质组双向电泳原理及实验步骤ppt课件.ppt
中国历史上吸烟的历史和现状、所采 取的措 施以及 由此带 来的痛 苦和灾 难，可 以进一 步了解 吸烟对 人民健 康的危 害，提 高师生 的控烟 意识
• 最高电压10,000 V • 10–25C 温度控制 • 7, 11, 17, 18, 和 24 cm的聚
焦盘，可以各放12根胶条 • 可以储存10个程序，每个程序有
中国历史上吸烟的历史和现状、所采 取的措 施以及 由此带 来的痛 苦和灾 难，可 以进一 步了解 吸烟对 人民健 康的危 害，提 高师生 的控烟 意识
实验操 作
Method
原理
Theory
应用
Application
中国历史上吸烟的历史和现状、所采 取的措 施以及 由此带 来的痛 苦和灾 难，可 以进一 步了解 吸烟对 人民健 康的危 害，提 高师生 的控烟 意识
中国历史上吸烟的历史和现状、所采 取的措 施以及 由此带 来的痛 苦和灾 难，可 以进一 步了解 吸烟对 人民健 康的危 害，提 高师生 的控烟 意识
二维SDS-PAGE
• 同普通SDS-PAGE类似。
• 但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶，因 为在IPG胶条中蛋白质区域已得到浓缩， 可以认为非限制性IEF胶（低浓度丙烯酰胺 胶）充当了浓缩胶。
l 设置等电聚焦时的温度。（17℃）
中国历史上吸烟的历史和现状、所采 取的措 施以及 由此带 来的痛 苦和灾 难，可 以进一 步了解 吸烟对 人民健 康的危 害，提 高师生 的控烟 意识
配制SDS-PAGE凝胶
配制12%的丙烯酰胺凝胶，直接用双向电 泳专用梳子；或在上部留0.5cm的空间， 用MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封胶。 聚合30分钟。
第
一
向
双向电泳原理及实验步骤
银染（Silver Stain Plus™ stain）
荧光染色（SYPRO® Ruby protein gel stain）
适用于质谱的染色方法
考马斯亮蓝染色
银染的检测灵敏度很高，可达到200pg，但其线性很差。普通的银染过程中因醛类的特异反应，而与下游质谱不兼容。
快速银染法，可与下游质谱兼容，但其检测灵敏度较低，并伴有很深的背景干扰。
聚焦时间的优化
IEF的基本条件
Stemp 1
Stemp 2
Stemp 3
total
voltage
Time
Volt-Hours
Ramp
250
20min
－－－
Linear
4000
4000
2hr
－－－
－－－
10,000V-hr
Linear
Rapid
5 hr
14,000V-hr
7 cm
Stemp 1
Stemp 2
双向电泳样品的溶解
是成功进行双向电泳的最关键因素之一 溶解的目标： 样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液； 必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除； 保证样品在电泳过程中保持溶解状态。
离液剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。典型代表是尿素和硫尿。
02
样品上样缓冲液
标准溶液：
Reagent
Amount
8M urea
47ml of 8.5 stock or 24g urea in 25ml H2O
50mM DTT or 2mM TBP
385mg or 500ul of 200mM TBP stock
双向电泳的
IPG IEF 中pH梯度的选择 pH梯度的选择
常用方法：先宽后窄，先线性后非线性， 先短后长，预试验确定。
胰酶对脱色后蛋白质的消化 质谱的多肽指纹图、 质谱的多肽指纹图、微测序分析 质谱结果的生物信息学分析和比对 新蛋白质的发现
蛋白信息的 初步获得
其它实验 的进一步 验证
蛋白质组研究的基本技术路线
蛋白质样品的制备 双向电泳 凝胶中的蛋白 混合肽 肽指纹图 肽序列质谱数据 蛋白质质量 数据搜索 新的或已知蛋白 蛋白转录后修饰的鉴定 N端测序 端测序 图像分析 溶液中的蛋白
双向电泳的 技术流程和样品制备
史须 北京大学人类疾病基因研究中心
基因组学与蛋白质组学
基因组学： 蛋白质组学：可视为分子生物学的大规模筛选 技术，目的在于归类细胞中的蛋白质的整体分 布，鉴定并分析感兴趣的个别蛋白，最终阐明 它们的关系与功能。 上述两种学科的研究内容在互补的水平上研究 了细胞的分子架构，又都在各自的水平上提供 了增强对方效应的信息，因此二者存在有很强 的且带有系统性相互关系。
增加样品溶解性的手段
变性剂： 变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸 展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能 量域。其典型代表是尿素和硫尿。 表面活性剂： 表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基 团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。 常用的表面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂 Triton X-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG 等。其中CHAPS和SB3-10最好。 还原剂： 还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还 原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。 常用含自由巯基的DTT或β-巯基乙醇，以及不带电荷 的三丁基膦（TBP）进行还原。
双向电泳--郭吉星PPT教学课件
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利用双向电泳可以分辩出5000—10000个蛋白质组 分
分离得到的蛋白质组分纯度达到90%以上，可以 稳定地保存在凝胶上
2020/12/09
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注意
双向电泳分离的结果使蛋白质点而不是条带。 根据
Cartesin坐标系统，从左到右是pI的增加，从下到上是分子
质量的增加。
PI增加
分 子 质 量 增 加
2020/12/09
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PPT精品课件
谢谢观看
Thank You For Watching
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蛋白质双向电泳技术
—— 基本原理
2020/12/09
姓 名：郭吉星 学 号：2010103024 任课老师：祝建波 教授
双向电泳 技术
双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE） 是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取 的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数 千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分 辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分 离方法所无与伦比的。双向电泳技术、计算机图 像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称 为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。
2020/12/09
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第二向SDS-PAGE
SDS-PAGE是利用SDS使蛋白质变性，多肽链 变成长棒状，不同长短肽链间短轴基本相等，长 轴长度与肽链长度成正比。SDS与蛋白质形成复 合物，并且按1.4gSDS与1g蛋白质等比例结合（相 当于两个氨基酸残基结合一分子的SDS）使之带 上大量负电荷
2020/12/09
2020/12/09
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双向电泳技术
第一向按蛋白质等电点的不同，每个蛋白质分子 沿pH梯度迁移至与其等电点相等的位置
《蛋白质双向电泳》课件
《蛋白质双向电泳》ppt课件
目录 Contents
• 蛋白质双向电泳概述 • 实验流程与技术 • 双向电泳的优缺点 • 双向电泳的应用实例 • 未来展望与研究方向
01
蛋白质双向电泳概述
定义与原理
定义
蛋白质双向电泳是一种分离和鉴定蛋白质混合物的技术，通过两次不同pH值 的电泳分离蛋白质。
原理
利用蛋白质的电荷和分子量差异，在电场中实现分离。在第一向电泳中，蛋白 质根据等电点不同被分离；在第二向电泳中，蛋白质根据分子量被分离。
蛋白质组学与其他技术的结合
与质谱技术联用
01
将蛋白质双向电泳技术与质谱技术联用，实现蛋白质
的精准鉴定和定量分析。
与基因组学、代谢组学等多学科交叉
02 将蛋白质双Hale Waihona Puke 电泳技术与基因组学、代谢组学等多学
科交叉，全面解析生命活动的调控机制。
与单细胞技术结合
03
将蛋白质双向电泳技术与单细胞技术结合，揭示单个
蛋白质定量
选择合适的蛋白质定量方法：如BCA 法、Lowry法等，确保准确性。
按照定量方法操作步骤进行定量，记 录数据并进行分析。
蛋白质溶解与分离
溶解蛋白质
将蛋白质样品溶解于适当的缓冲液中 ，以便进行电泳分离。
电泳分离
将溶解的蛋白质样品进行等电聚焦电 泳和SDS-PAGE电泳，实现蛋白质的 分离。
凝胶染色与图像分析
凝胶染色
采用银染、考马斯亮蓝染色等方法对凝胶上的蛋白质进行染 色。
图像分析
对染色后的凝胶进行拍照，并利用相关软件进行蛋白质点的 检测、匹配和比较分析。
03
双向电泳的优缺点
优点
高分辨率
双向电泳可以根据蛋白质的等电 点和分子量进行分离，具有较高 的分辨率，能够分离出更多的蛋 白质。
目录 Contents
• 蛋白质双向电泳概述 • 实验流程与技术 • 双向电泳的优缺点 • 双向电泳的应用实例 • 未来展望与研究方向
01
蛋白质双向电泳概述
定义与原理
定义
蛋白质双向电泳是一种分离和鉴定蛋白质混合物的技术，通过两次不同pH值 的电泳分离蛋白质。
原理
利用蛋白质的电荷和分子量差异，在电场中实现分离。在第一向电泳中，蛋白 质根据等电点不同被分离；在第二向电泳中，蛋白质根据分子量被分离。
蛋白质组学与其他技术的结合
与质谱技术联用
01
将蛋白质双向电泳技术与质谱技术联用，实现蛋白质
的精准鉴定和定量分析。
与基因组学、代谢组学等多学科交叉
02 将蛋白质双Hale Waihona Puke 电泳技术与基因组学、代谢组学等多学
科交叉，全面解析生命活动的调控机制。
与单细胞技术结合
03
将蛋白质双向电泳技术与单细胞技术结合，揭示单个
蛋白质定量
选择合适的蛋白质定量方法：如BCA 法、Lowry法等，确保准确性。
按照定量方法操作步骤进行定量，记 录数据并进行分析。
蛋白质溶解与分离
溶解蛋白质
将蛋白质样品溶解于适当的缓冲液中 ，以便进行电泳分离。
电泳分离
将溶解的蛋白质样品进行等电聚焦电 泳和SDS-PAGE电泳，实现蛋白质的 分离。
凝胶染色与图像分析
凝胶染色
采用银染、考马斯亮蓝染色等方法对凝胶上的蛋白质进行染 色。
图像分析
对染色后的凝胶进行拍照，并利用相关软件进行蛋白质点的 检测、匹配和比较分析。
03
双向电泳的优缺点
优点
高分辨率
双向电泳可以根据蛋白质的等电 点和分子量进行分离，具有较高 的分辨率，能够分离出更多的蛋 白质。
《双向凝胶电泳 》课件
它结合了等电聚焦和SDS-聚丙烯酰胺 凝胶电泳的原理，能够分离出成千上 万的蛋白质。
双向凝胶电泳的原理
等电聚焦
在第一向电泳中，蛋白质根据其等电点进行分离，聚焦在相应的pH区域。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
在第二向电泳中，已经分离的蛋白质加入SDS（十二烷基硫酸钠）后带负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中按分子量大 小进行分离。
生物标志物发现
通过双向凝胶电泳技术寻 找新的生物标志物，用于 疾病预警、监测和治疗。
药物研发
利用双向凝胶电泳技术分 析药物作用机制和靶点蛋 白质，为新药研发提供支 持。
研究展望
蛋白质组学研究
随着蛋白质组学研究的深入，双 向凝胶电泳技术有望在更广泛的 领域发挥重要作用。
跨学科合作
加强与其他学科领域的合作，共 同推动双向凝胶电泳技术的发展 和应用。
样品上样
将处理好的蛋白质样品上样到第一向 等电聚焦凝胶中。
等电聚焦
在第一向等电聚焦凝胶中进行等电聚 焦，分离蛋白质。
固相pH梯度第二向分离
将第一向分离后的蛋白质从凝胶中转 移到第二向SDS-PAGE凝胶中进行第 二向分离。
图像分析
染色与脱色
01
对第二向分离后的凝胶进行染色和脱色，以便观察和检测蛋白
研究疾病的发生和发展机制，为疾病的诊断和治疗提供依据。
03
生物标志物发现
利用双向凝胶电泳技术可以发现与疾病相关的生物标志物，如肿瘤标志
物、感染性疾病相关蛋白等，有助于疾病的早期诊断和预后评估。
在医学研究中的应用
1 2 3
药物作用机制研究
通过双向凝胶电泳技术分析药物作用前后蛋白质 表达谱的变化，有助于揭示药物的作用机制和靶 点。
数据共享和分析
双向凝胶电泳的原理
等电聚焦
在第一向电泳中，蛋白质根据其等电点进行分离，聚焦在相应的pH区域。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
在第二向电泳中，已经分离的蛋白质加入SDS（十二烷基硫酸钠）后带负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中按分子量大 小进行分离。
生物标志物发现
通过双向凝胶电泳技术寻 找新的生物标志物，用于 疾病预警、监测和治疗。
药物研发
利用双向凝胶电泳技术分 析药物作用机制和靶点蛋 白质，为新药研发提供支 持。
研究展望
蛋白质组学研究
随着蛋白质组学研究的深入，双 向凝胶电泳技术有望在更广泛的 领域发挥重要作用。
跨学科合作
加强与其他学科领域的合作，共 同推动双向凝胶电泳技术的发展 和应用。
样品上样
将处理好的蛋白质样品上样到第一向 等电聚焦凝胶中。
等电聚焦
在第一向等电聚焦凝胶中进行等电聚 焦，分离蛋白质。
固相pH梯度第二向分离
将第一向分离后的蛋白质从凝胶中转 移到第二向SDS-PAGE凝胶中进行第 二向分离。
图像分析
染色与脱色
01
对第二向分离后的凝胶进行染色和脱色，以便观察和检测蛋白
研究疾病的发生和发展机制，为疾病的诊断和治疗提供依据。
03
生物标志物发现
利用双向凝胶电泳技术可以发现与疾病相关的生物标志物，如肿瘤标志
物、感染性疾病相关蛋白等，有助于疾病的早期诊断和预后评估。
在医学研究中的应用
1 2 3
药物作用机制研究
通过双向凝胶电泳技术分析药物作用前后蛋白质 表达谱的变化，有助于揭示药物的作用机制和靶 点。
数据共享和分析
双向电泳操作双向电泳的技术流程和样品制备ppt课件
第二步：把未溶解的pellet用标准IEF样品液溶解提取 高疏水性蛋白；
第三步：用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后抽 提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白约占整个样品的 11%（W/W）。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
增加样品溶解性的手段
变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸 展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能 量域。其典型代表是尿素和硫尿。
双向电泳分析中的样品制备
制备原则：
应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括 多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。
防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰
（如酶性或化学性降解等）。 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证
Amount 4.1ml of 8.5 stock or 2.1g urea in 3ml H2O 760mg
50ul of 200mM TBP stock
200mg See table 10ul of 0.1% stock To 5ml
Multiple surfactant solution preparation 经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用
IPG pH Range 3-10 4-7
第三步：用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后抽 提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白约占整个样品的 11%（W/W）。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
增加样品溶解性的手段
变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸 展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能 量域。其典型代表是尿素和硫尿。
双向电泳分析中的样品制备
制备原则：
应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括 多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。
防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰
（如酶性或化学性降解等）。 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证
Amount 4.1ml of 8.5 stock or 2.1g urea in 3ml H2O 760mg
50ul of 200mM TBP stock
200mg See table 10ul of 0.1% stock To 5ml
Multiple surfactant solution preparation 经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用
IPG pH Range 3-10 4-7
双向电泳培训课程PPT课件
优化电泳条件
优化电泳参数，如电流、电压和 时间，以获得更好的分离效果。
提高检测灵敏度
采用荧光标记技术
利用荧光标记技术对蛋白质进行染色，提高检测 灵敏度和分辨率。
优化染色方法
改进染色步骤和条件，降低背景噪声，提高检测 灵敏度。
开发新型检测器
研发更灵敏的检测器，提高检测下限，降低检测 误差。
自动化与智能化发展
设置参数
根据实验需求设置电泳参 数，如电流、电压、时间 等。
开始电泳
接通电源，启动电泳程序， 开始电泳分离。
染色与检测
固定
电泳结束后，将凝胶固定在染色 架上，用脱色摇床进行固定。
染色
根据实验需求选择合适的染色方法， 如银染、考马斯亮蓝染色等。
检测
通过凝胶成像系统或数码相机对染 色后的凝胶进行拍照和记录，以便 后续分析。
03
比较不同物种间蛋白质的差异，揭示生物进化的奥秘。
临床应用前景
个体化医疗
通过对个体蛋白质组的分析，为个体化医疗提供依据。
精准诊断
利用蛋白质组学技术对疾病进行精准诊断，提高诊断的准确性和 可靠性。
药物疗效评估
通过监测药物治疗前后蛋白质组的变化，评估药物疗效和安全性。
THANKS FOR WATCHING
高分辨率和高灵敏度检测技术
提高蛋白质的检测灵敏度和分辨率，有助于发现 更多蛋白质。
3
生物信息学
对蛋白质组学数据进行深入分析，挖掘更多生物 学意义。
蛋白质组学研究
疾病标志物研究
01
寻找与疾病相关的蛋白质标志物，为疾病的诊断和治疗提供依
据。
药物靶点研究
02
发现潜在的药物靶点，为新药研发提供支持。
双向电泳技术和实验流程
献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。
*1948年Wieland和Fischer重新开展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对
氨基酸的别离进行过研究。
*从上世纪50年代起，特别是1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的
别离以后，开创了利用各种固体物质〔如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂
凝胶、淀粉凝胶等〕作为支持介质的区带电泳方法。
分辨率低，实验室中已很少使用。
④琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的别离分析。琼脂糖凝胶孔
径度较大，对大局部蛋白质只有很小的分子筛效应。
⑤聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的别离、纯化及
检测。其分辨率较高。
聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质。
另外根据支持介质形状不同，区带电泳可分为：
薄层电泳、板电泳、柱电泳。
光聚合作用通常需痕量氧原子存在才能发生，因为核黄素在TEMED及光照条件
下，复原成无色核黄素，后者被氧再氧化形成自由基，从而引发聚合作用。
丙烯酰胺会产生如下几个化学反响：
•高浓度酸和碱会促进其水解形成丙烯酸和
NH3。
•与一些羟基化合物如酚或酯族醇反响，生成
β-芳氧基或烷氧基丙酰胺。
•在20℃能NH3反响，生成β、β′、β″-氮川
*1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质，创立了
聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的
新时代。
*由80年代开展起来的新的毛细管电泳技术，是化学和生化分析鉴定技术的
重要新开展，己受到人们的充分重视。
*双向电泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地别离约1000个蛋白。
他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电
*1948年Wieland和Fischer重新开展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对
氨基酸的别离进行过研究。
*从上世纪50年代起，特别是1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的
别离以后，开创了利用各种固体物质〔如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂
凝胶、淀粉凝胶等〕作为支持介质的区带电泳方法。
分辨率低，实验室中已很少使用。
④琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的别离分析。琼脂糖凝胶孔
径度较大，对大局部蛋白质只有很小的分子筛效应。
⑤聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的别离、纯化及
检测。其分辨率较高。
聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质。
另外根据支持介质形状不同，区带电泳可分为：
薄层电泳、板电泳、柱电泳。
光聚合作用通常需痕量氧原子存在才能发生，因为核黄素在TEMED及光照条件
下，复原成无色核黄素，后者被氧再氧化形成自由基，从而引发聚合作用。
丙烯酰胺会产生如下几个化学反响：
•高浓度酸和碱会促进其水解形成丙烯酸和
NH3。
•与一些羟基化合物如酚或酯族醇反响，生成
β-芳氧基或烷氧基丙酰胺。
•在20℃能NH3反响，生成β、β′、β″-氮川
*1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质，创立了
聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的
新时代。
*由80年代开展起来的新的毛细管电泳技术，是化学和生化分析鉴定技术的
重要新开展，己受到人们的充分重视。
*双向电泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地别离约1000个蛋白。
他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电
蛋白质的双向电泳.ppt
生物学问题的解释
双向电泳(2DE/DIGE)
目前进行蛋白质组学分析的最常规实验技术
能实现多达10000种不同蛋白质进行分离分 析
双向电泳（2DE）示意图
等电聚焦，实现蛋白质按等电点进行分离
提取的总蛋 白溶液
大 分子量
SDS-PAGE 分离，使得 蛋白质按分 子量大小排 序
小
通过双向电泳使得不同等电点和分子量的 蛋白质根据其自身特性分布到凝胶的不同
蛋白质组学（proteomics）
概念：是从整体角度分析生物体蛋白质组动 态变化的一门科学
研究内容：蛋白质的识别、定量；蛋白质的 定位、修饰；蛋白质之间的相互作用并根据 这些研究最终确定它们的功能
技术流程
提出 生物学问题
实验组和对照组 样品制备
双向电泳(2DE/DIGE)
凝胶图像分析
差异蛋白点选取 蛋白酶解及质谱分析 差异蛋白点的成功鉴定
位置从而实现蛋白质的双向分离
2DE图谱
硝酸银染色图谱
考马斯亮蓝染色图谱
双向电泳（DIGE）示意图
样品1： Cy3标记
将标记的 样品混合
双向电泳分离
样品2： Cy5标记
荧光扫描仪扫描
图像重叠分析
DIGE图谱
ห้องสมุดไป่ตู้
样品制备
双向电泳的最关键步骤之一
制备原则：尽可能多地提取出总蛋白质， 尽可能简单的操作步骤，注意防止样品 提取过程中的各种化学修饰，去除样品 中核酸、盐离子等干扰物质。
胶条平衡
等电聚焦结束后进行SDS-PAGE电泳 之前需进行胶条平衡，以便于被分离 的蛋白质与SDS充分结合，保证SDSPAGE电泳的顺利进行
步骤：一般采用两步平衡法，用含 SDS、DTT、尿素和甘油等的缓冲液 先平衡一次，再用碘乙酰胺取代DTT 后再平衡一次