AKTA层析系统

其它要求
TSK-gel XX 5pw 7.5*75
0.5 kPsi /0.6M Pa
1mL/min
TSK-gel XX 5pw 21.5*150
0.5 kPsi /0.6M Pa
6mL/min
TSK-gel G5000PW XL 7.8*300
0.1 kPsi /0.3M Pa
0.5mL/min
TSK-gel G3000SW 0.1 kPsi /0.3M
AKTA层析系统标准操作规程
在使用AKTA前，请先阅读本规程，并了解 所需层析方法的原理。初次使用请在有经验
的人指导下进行。
1. 缓冲液和层析的样品的准备：
1. 溶液需用去离子水、超纯水或注射用水配制，除NaOH和乙 醇外，所有用于层析的缓冲液需经0.45μm孔径的滤膜过滤， 并盛装于用0.45μm孔径滤膜过滤的水至少荡洗4次的容器中。
⑶使用完仪器应在文件管理界面关闭UNICORN程序，系统将提 示是否锁定界面，选否，待UNICORN完全退出后方可关闭仪器电 源。使用完毕后需清理台面，并登记使用事项。
2．AKTA仪器的运行
⑴在打开流速之前，将AB管道插入缓冲液中，遵循A低盐，B高 盐或者A高pH, B低pH的原则，若只用一种缓冲液，请将AB管道都 插入缓冲液中，然后AB泵各走50%。在装上柱子之前应先用高流速 将管道中替换成自己相应缓冲液。
20mL/min
35*40 0.5M Pa 25mL/min
20mL/min
35*60 0.5M Pa 25mL/min
20mL/min
国产柱子，A*B表示内径为A（mm），高为B（cm）
4.
4. 常压介质：
介质
压力上 限
最大流速 （装柱）
最大流速 （运行）
其它要求
XXX Sepharose FF
压力控制要按照不同的介质、柱型号的使用方法严格严格执行（参 数见附表）。特别需要注意的是，在使用时要设定最高压力警报， 以避免操作不当造成柱子爆裂，甚至仪器损坏。AKTA使用过程中请 检查各部分的运行情况，如有问题及时联系管理员。
⑷同时，在使用时，请确保位于仪器一侧的，50mL管装的20%乙 醇正在循环流动（用于清洗压力泵），并且20%乙醇无浑浊或干涸现 象。若发生断流或液体浑浊，请及时更换并用注射器抽取，让液体 充满管道，避免对压力泵造成损害。
XL 7.8*300
Pa
0.5mL/min
不能用于pH>7.5的 缓冲液
TSK-gel G3000SW 0.6 kPsi /0.6M
XL 21.5*600
Pa
6mL/min
不能用于pH>7.5的 缓冲液
TOSOH产品：A*B表示内径为A（mm），高为B（mm）
原本1kPsi=145MPa，但AKTA系统（泵和管道）不适合耐受太高 压力。
NaOH
SPA (Protein A)Sepharose 4B
0.5M Pa
22mL/min
20mL/min
可用乙醇清洗， 不能用NaOH清洗
CHT II为BioRed产品，SPA (Protein A)-Sepharose 4B自产，其余为GE 产品。
2． 高压预装柱：
介质
压力上限
最大流速 （运行）
20mL/min
新介质，可高流 速
G25
0.5M Pa 25mL/min 20mL/min 干粉，需预溶胀
Superdex 200 0.5M Pa 2.5mL/min 2mL/min 分子筛介质
CHTII
0.5M Pa
12mL/min
10mL/min
干粉，200mM PB 预溶胀，装柱， 不耐高压，不耐
柱子类型
压力上 最大流速（运
限
行）
其它要求
HiTrap XXX Sepharose FF（1mL）
0.3M Pa
1mL/min
HiTrap XXX Sepharose HP（1mL）
0.1M Pa
1mL/min
HiTrap XXX Sepharose XL（1mL）
0.3M Pa
1mL/min
Hitrap Desalting（5mL） 0.3M Pa
⑸使用NaOH以及盐浓度较高的缓冲液清洗管道或柱子时尽量减 少漏液，如漏到仪器上时请及时擦拭干净，避免腐蚀AKTA。柱子使 用完后要及时拆卸，以便他人使用。注意柱子拆卸后要在相应接口 连接一条管道，避免污染杂质，染菌或检测探头由于缓冲液干涸盐 析造成损坏。
⑹当发现压力检测器或pH计不准时，及时通知管理员进行校正。
⑺运行结束后请及时保存实验结果，并归于各人自己目录下，便 于整理和存档。
三、层析柱和介质的使用：
1.装柱
⑴原先在溶液中的介质通常可以用水或乙醇（20%）装柱，干粉 介质（如G25）需在水中溶胀1h以上，方可装柱。CHTII需在200mM PB溶液中溶胀1h后，用200mM PB装柱。
⑵拆下柱子，清洗柱腔和管道，将位于下方的一端（较短的）接 上AKTA仪器，揭下防水膜，以5~10mL/min流速排出防水膜下的气 泡，盖上防水膜，装上柱腔，继续在柱腔底部注满2cm左右的溶液， 将计算好体积的介质贴壁缓慢倒入柱腔内，要防止气泡的产生。将
⑵开启AKTA总电源按钮(AKTA仪器一般分为2-3个模块，每个 模块有单独的电源开关，通常为开启状态，总电源开关一般用于开 关仪器)，稍后开启AKTA控制软件UNICORN，并等待仪器自检和 联机，每个模块自检成功后会发出“嘀---嘀嘀”的声音，相应在仪 器上显示自检通过的字样。软件开启后会同时打开4个界面，从左 到右依次是：文件管理界面、程序编辑界面，仪器控制界面，图线 分析界面。与仪器连接成功后，仪器控制界面下方仪器简图线路变 成绿色，仪器会从泵内走一段液体至废液。如未连接成功，操作界 面会弹出提示窗口，此时请检查仪器与电脑数据线插头是否松动， 而后关闭仪器和程序，重新开启，必要时可重新启动电脑。如经过 以上步骤还无法连接，请联系管理员。
⑷在实验结束后，非高压柱应用0.1M NaOH清洗，最后保存于 NaOH或20%乙醇中；CHT II介质用0.1M NaOH清洗不宜超过2倍柱 体积，最后应保存于水或20%乙醇中；高压预装柱除G3000SW外 用 0.1M NaOH清洗，保存于超纯水中；G3000 SW用超纯水清洗，保存 于超纯水中。柱子卸下时，2端柱头都应先充满液体，再接上堵头， 放4℃保存，经常使用的可放室温保存。
3mL/min
Hitrap Desalting（10mL） 0.3M Pa 10mL/min
Superdex 75/200
0.6M Pa 0.75mL/min
2. 常压柱子（进口）：
柱子型号
压力上 限
最大流速（装 柱）
最大流速（运 行）
其它要求
XK 16/20 0.5M Pa 25mL/min
20mL/min
4. 配制的缓冲液成分不宜浓度过高，如硫铵不得超过2M（约 50%饱和硫铵）；NaCl不得超过4M；PB不得超过500mM；以 免析出固体损坏层析介质与仪器。
5. 缓冲液要多次使用，需在120℃灭菌20min，此后置于4℃保 存，下回层析时平衡至室温使用，使用前应摇晃无可见异物 方可使用，否则，应重新过滤。
3. 常压柱子（国产）：
柱子型号
压力上 限
最大流速（装 柱）
最大流速（运 行）
其它要求
15*20 0.5M Pa 25mL/min
20mL/min
15*100 0.5M Pa 2.5mL/min
2mL/min
通常装分子筛 介质
25*20 0.5M Pa 25mL/min
20mL/min
25*40 0.5M Pa 25mL/min
⑸分子筛类介质应倒装层析柱。
2．层析柱和介质使用注意事项
⑴TSK的高压预装柱也可以在AKTA上使用，但要注意流速和压 力（详见附表）
⑵在装柱和卸柱时要将柱头上的液体充满，再连上连接头或堵 头。装柱时要先用1/2流速倒冲柱子，赶出气泡，再连上接头，以免 气泡进入介质内。
⑶实验过程中应保持柱子竖直，特别是分子筛。整个实验操作过 程中都要防止气泡进入介质内。常压层析柱使用较久后，柱压可能 会上升，应适当降低流速。若层析柱在实验过程中出现泵压急剧升 高，超过限度的情况，请联系管理员。
0.5M Pa
பைடு நூலகம்
25mL/min
20mL/min
快速介质，可高 流速
XXX Sepharose HP
0.3M Pa
12mL/min
10mL/min
高效介质，不耐 高压
XXX Sepharose XL
0.5M Pa
25mL/min
20mL/min
大载量介质，可 高流速
XXX Capto
0.5M Pa
25mL/min
6. 用于层析的样品通常要用12000rpm离心10min，上清用0.22μm 过滤后才可以用于层析。经过层析后收集的样品如无沉淀可 免去离心和过滤的步骤。
7. 用于离子，疏水层析的样品应经预实验不会在该层析条件下 样品在低盐和高盐条件下稳定不析出沉淀。
2. AKTA仪器的使用：
1.开关机
⑴开启电脑，检查电脑运行状态是否正常。
2. 实验过程中用到的20%乙醇应用新的无水乙醇和0.45μm孔径 滤膜过滤的水配制；0.1M NaOH用0.45μm孔径滤膜过滤的水 和固体NaOH配制。
3. 盛装缓冲液的应使用小口有盖圆底容器，最好可灭菌，如蓝 口瓶，无水乙醇瓶。烧杯（敞口，易污染长菌）、血清瓶 （多死角，易长菌）不适合用于盛装缓冲液。
管道从仪器上卸下，让溶液流出，介质随着沉降。当介质沉降完全 后，堵上下端出口。
⑶将位于上方的一端接上仪器如⑵排去气泡后，向柱腔内缓慢注 水至上柱面，将上端插入柱腔，锁在介质面上方约1cm处。