Western blot实验步骤

聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）原理
• 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAGE ）是蛋白质 分析过程中最常用的技术。
• 蛋白质在电泳分离时，其迁移率主要取决于蛋白质本 身所带的电荷多少、分子量大小和形态。但如在 PAGE 中加入阴离子去污剂 SDS, SDS 将蛋白质的二硫键、氢 键及疏水键打开，使蛋白质变性， SDS 将包裹在变性 蛋白表面，使蛋白质成为刚性分子，同时，由于SDS带 有大量负电荷，使蛋白质本身带有的电荷可忽略。这 样，不同蛋白质分子的迁移率主要决定于蛋白带有的 SDS 量，而 SDS 与蛋白结合的量与蛋白的分子量成正比， 即迁移率决定于蛋白质分子量大小 。因此利用 SDSPAGE可测定蛋白质的分子量。
SDS-PAGE 蛋白电泳试剂
1. 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体溶液（Acr和Bis)：
丙烯酰胺30g ，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加水100ml ，滤 纸过滤后储存于棕色瓶中，4℃避光保存，pH不得超过 7.0。（光催化或碱催化其发生脱氨基反应）
• 2. 4x分离胶缓冲液 ：Tris 18.17g, 10% SDS 4ml, HCl调pH至8.8, 定容到100ml。
• 5. 10×电极缓冲液：称取Tris 30g、甘 氨酸144g，加入10％SDS 100ml，定容至 1000ml, pH8.8
• 6. 2X样品缓冲液:甘油2ml（或称取蔗糖2g ），加 入10％SDS 2ml，溴酚蓝0.25mg，浓缩胶缓冲液2.5ml、 ß －巯基乙醇0.5ml，加水定容至10ml。 • （加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子, 可以自由通过凝胶孔径, 所以它显示着电泳的前沿位 置,当指示剂到达凝胶底部时, 即可停止电泳）
• 蛋白质样品在上样电泳前均需变性。
• 蛋白质分子量标准marker在上样电泳前不用变性。
• 通常是将样品蛋白质溶液与等体积的2x上样缓冲液混合
后置于 eppendorf 管中，将混合物置于 100℃ 加热 3-10
分钟，立即置于冰上，但有些样品如植物、细菌需要离 心处理后取上清电泳。蛋白质样品应溶于低离子强度的 缓冲液中。蛋白质的终浓度最好为1mg/ml，每个泳道的 上样量取决于所使用染色方法的灵敏程度。考马斯亮蓝
12-50
4.3/6.45
1.9/ 3.61 112/ 168 5.0/7.5 10-40
浓缩胶制备的方法：将丙烯酰胺和甲
叉双丙烯酰胺单体储备液0.6ml，浓 缩胶缓冲液888µ m、水2ml、10％过 硫酸胺 56µ l、TEMED 10µ l混合均匀 后，立即灌胶。
SDS-PAGE 步骤 1. 制胶：根据所需要分离的蛋白质分子量选择分离 胶的浓度，制备不同浓度的凝胶所需要的储备液可参考 上表. ①按比例配制分离胶，轻缓地摇动溶液 ,使混合均匀，将 凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注 入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中 ( 因液体中含有 分子氧可抑制凝胶的聚合，故用时可在真空中抽气以排 除液体中的分子氧，灌完分离胶后加水以封闭分离胶与 外界氧气的结合) ，然后静置40-60min ②同前按比例配制浓缩胶，但摇动溶液时不要过于剧烈以 免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的 水分，以连续平稳的液流注入凝胶溶液，然后小心插入 梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静止 20min 以上以保 证完全聚合。
• 强阴离子去污剂使蛋白质变性、亚基解离：SDS打 开蛋白质中半胱氨酸残基之间的二硫键, 破坏蛋白 质的四级结构, 它可以断开分子内和分子间的氢键, 破坏蛋白质分子的二级及三级结构； • 带负电荷的SDS覆盖于蛋白质表面，把蛋白质本身 的电荷封闭，并使蛋白质表面带负电荷，从而使蛋 白质在电泳时向正极移动； • SDS与多肽结合的量与多肽的分子量成正比而与其 序列无关（平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分 子），因此SDS-多肽复合物在聚丙烯酰胺凝胶电泳 中的迁移率只与多肽分子量大小相关。
2.碱性磷酸酶，来源于动物牛小肠（目前 也有细菌表达的产物），用于植物性样 品的检测，（目的是消除样品中内源性 酶的干扰，降低背景）。
Western blot 的酶及其底物
酶 生色 底物 生成的颜色 灵敏度
辣根过氧化合酶 （HRP）
4-氯-1-萘酚/H2O2
不溶性紫色
1ng 250pg 100 pg 100 pg
• 3. 4×浓缩胶缓冲液：称趣Tris 6.06g，加入10％SDS 4ml，用12mol/l HCL调至pH至6.8，定容至100ml。
• 4. 10%过硫酸胺： 称取过硫酸胺0.5g, 加水至5ml。提供两种丙稀酰胺聚合所必 须的自由基。本存储液应现配现用。
• TEMED （N，N，N’N’四甲基乙二胺）原溶 液， TEMED催化过硫酸铵形成自由基而 加速两种丙稀酰胺的聚合。
用于免疫印迹的膜及其预处理
硝酸纤维素膜（NC 膜）的预处理：转移缓冲液 湿润膜； 硝酸纤维素膜：硝酸纤维素膜是蛋白印迹实验的 标准固相支持物。在低离子转移缓冲液的环境 下，带负电荷的蛋白质会与硝酸纤维素膜发生 疏水作用而高亲和力地结合在一起。
从膜的质地上来看，最重要的指标就是单位面积 上能够结合的蛋白的量。硝酸纤维素膜的结合 能力主要与膜的硝酸纤维素的纯度有关，最大 的蛋白结合量可达80-150μg/cm2。 硝酸纤维素膜很脆，易破。
Western blot实验原理： 蛋白质混合样品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE) 电泳使蛋白质按分子大小分离，将分离的各蛋白质条 带（其中含有能与特异性抗体相应的待检测的蛋白即 抗原蛋白）原位转移到固相载体膜上（蛋白条带转移 到NC、PVDF膜上此过程称为blotting ），用无关蛋 白质封闭液（如BSA）封闭膜的非特异性位点（膜上 没有蛋白转移上去的位点），加入特异性抗体（即一 抗，是抗目的蛋白的抗体）后印迹上的目的蛋白（抗 原）与一抗发生特异性的免疫结合反应，洗涤后再加 入能与一抗发生免疫结合反应的酶标记二抗 (二抗即 抗抗体，是以一抗为抗原免疫动物产生的抗体)，最 后通过二抗上标记酶的性质进行检测，即根据底物显 色的颜色有无及深浅（或发光有无及发光强弱）来探 测膜上印迹蛋白抗原的存在与否及含量多少。
染色一般有10－20µ g样品也已经足够了
• 考马斯亮蓝染色的灵敏度为0.3－1ug，但银染更灵敏
蛋白样品的提取方法：100毫克的组织（动植物、 细菌等微生物）液氮磨碎，加 100 微升的 2X 蛋 白 质 上 样 缓 冲 液 混 匀 ， 100℃ 煮 沸 10 分 钟 ， 5000rpm离心5分钟，取上清进行蛋白电泳。 当提取的样品中蛋白的含量太低时，可加2-3倍 体积的丙酮沉淀，10000rpm离心，去上清，沉 淀加2X蛋白质上样缓冲液， 100℃煮沸5分钟 后进行蛋白电泳。
• 带正电的尼龙膜(目前已不用)； • 蛋白结合于膜的作用力为非共价键的疏水力、 静电力 • 硝酸纤维素膜是通过疏水作用与蛋白质结合， 而PVDF膜主要通过它膜上的正电荷和负电荷的 蛋白结合，同时也有疏水作用，因而，PVDF膜 和蛋白接合较牢，不易脱落。
SDS-PAGE中SDS（十二烷基硫酸钠）的作用
Western blot（免疫印迹）
Western blot 是 20 世纪 70 年代末和 80 年代初，在蛋白质凝胶
电泳和固相免疫测定的基础上发展起来的一种广泛应用于
蛋白质检测的分子生物学技术。它是将蛋白质凝胶电泳、 印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质检测技术。与 Southern 、 Northern 杂交方法类似，但 Western Blot 被检 测物是蛋白质，“探针”是抗体，它具有直观、特异、灵 敏（pg)的优点，且可进行蛋白质的定性及半定量分析。
• 7.染色液：称取考马斯亮蓝R-250 2.5g，加入
甲醇450ml，冰乙酸100ml、水650ml。
• 8.脱色液 ：甲醇100ml，冰乙酸700ml，加水 830ml。 • 9.十二烷基硫酸钠（SDS）溶液:10%(w/v) 1g SDS，10ml去离子水配制，室温保存。
SDS-PAGE 电泳采用 Tris- 甘氨酸系统，即按分子克隆 中Sambrook等的方法（Sambrook, 1989）进行
二氨基联苯胺(DAB)/H2O2 不溶性棕褐色 3,3’5,5’-四甲基联苯胺 (TMB) 不溶性青蓝色
碱性磷酸酯酶（AP）氮蓝四唑/5-溴-4-氯吲哚 不溶性黑紫色 磷酸(NBT/BCIP) 沉淀 化学发光 辣根过氧化合酶 碱性磷酸酶 ECL（过氧化物+鲁米诺） 发蓝色光 AMPPD 发光
10 pg 1 pg
预电泳:将聚合好的凝胶安置于电泳 槽中，小心拔去梳子，加入上下槽 电泳缓冲液后低电压短时间的预电 泳，清除凝胶内的杂质，疏通凝胶 孔径以保证电泳过程中电泳的畅通。 现在一般不进行预电泳)
• 2. 样品制备
• 蛋白质的样品制备是Western Blot的关键步骤， 要求尽可能的获得所有蛋白质，防止蛋白质降 解，样品处理过程应在低温下进行，并在提取 缓冲液中加入合适的蛋白酶抑制剂（蛋白酶抑 制剂 cocktail 、 PMSF ），以避免细胞破碎释 放出的各种酶类的降解作用。 • 苯甲基黄酰氟 （ PMSF ）蛋白酶抑制剂：在溶 液中不稳定，应在临用前从储存液中现加于裂 解液中。一旦眼睛或皮肤接触了 PMSF，应立即 用大量的水冲洗。PMSF通常配成10mmol/L浓度 储液，保存于-20度
Western blot 实验步骤
• • • • • • • • • • 1.蛋白样品的制备 2. SDS-PAGE 蛋白电泳 3. 转膜 4. 封闭 5. 一抗反应 6. 洗膜 7. 二抗反应 8. 洗膜 9. 底物显色或发光 10. 终止反应,并照片记录结果
试验材料介绍：
标记二抗的酶
1.辣根过氧化合酶（HRP），来源于植物， 用于动物性样品的检测（目的是消除样 品中内源性酶的干扰，降低背景）。
• PVDF膜（ 聚偏二氟乙烯，polyvinylidene fluoride)的预处理 ： 在甲醇浸泡10秒湿润膜，转移缓冲液浸泡10－15 分钟，除去甲醇。PVDF是疏水性的，在转膜缓冲 液里很难浸透，甲醇处理后使更容易浸润，且甲 醇处理活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易 跟带负电的蛋白质结合； • PVDF膜是一种高强度、耐腐蚀的物质，PVDF膜 可以结合蛋白质，而且可以结合小片段的蛋白质， 最初是将它用于蛋白质的序列测定，虽然PDVF膜 结合蛋白的效率没有硝酸纤维素膜高，但由于它 的稳定、耐腐蚀使它成为蛋白测序理想的用品；
• 5X样品缓冲液：0.312mol/L Tris-HCl, pH6.8 , 10%SDS, 25% ß －巯基乙醇,0.05%溴酚蓝。 加入样品 后再添加10％甘油 • 5X样品缓冲液： 0.225mol/L Tris-HCl, pH6.8 ； 50%甘油；5 ％SDS ；0.05％溴酚蓝；0.25M DTT
3.0/4.5
1.9/ 3.61 112/ 168 5.0/7.5 15-100
1.9/ 4× 分 离 胶 缓 冲 液 3.61 （mL） 10% 过硫酸氨（ L ） 112/
168
TEMED（L） 分离范围（kDa）
5.0/7.5 36-150
3.7/5.5 5 1.9/ 3.61 112/ 168 5.0/7.5
制胶
表1 不同浓度变性聚丙烯酰氨凝胶（分离胶）的配方
成份 凝胶浓度
8.5％
3.25/ 5.25
10％
3.1/ 4.65
12.5％
2.5/ 3.75
15％
1.8/ 2.7
17.5％
1.2/ 1.8
H2O（mL）
30％Acr: Bis（mL）
2.0/3.0
2.4/3.6
1.9/ 3.61 112/ 168 5.0/7.5 20-120
• 根据被转移的蛋白分子量大小，要选择不同孔 径的硝酸纤维素膜。因为随着膜孔径的不断减 小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。但是 膜孔径如果小于0.1μm，2μm两种规 格的硝酸纤维素膜。大于20kD的蛋白就可以用 0.45μm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2μm 的膜了，如果用0.45μm的膜就会发生转移到 膜反面或穿过膜的现象。