植物生理学综合实验

第九组 MJ与NO、H2O2的关系
第九组组要是两个实验，第一个是将茉莉酸甲酯和维生素C合用，维生素C是延 缓叶片衰老的，茉莉酸甲酯的促进叶片衰老的，两者的作用应该是相互抵消的。 第二个是将茉莉酸甲酯和过氧化氢在一起合用，两者都是促进细胞衰老的，当 一定合用是，衰老效果更加的明显，因为两者的作用相互叠加了。但是第一个 实验的实验现象在鉴定细胞活性的时候，结果却不是很明显，看了一下，叶片 时没什么问题的，导致这样的原因可能是染色环节上出错了，有可能是脱色时 间不够，也有也能是有光亮环境的时间过多，导致脱色效果不好等等。
第七小组
第八组
5×10-4mol/L MJ+300umol/L SNP
5×10-6 mol/L MJ+100umol/LHb
5×10-6mol/L MJ+1.0g/L ETH
5×10-4 mol/L MJ+75umol/L COCl2
第八小组
第九组
5×10-4mol/L MJ+1.0g/L Vc
植物生理综合实验 细胞死活与H2O2鉴定
学号 姓名
一 实验目的：
1.了解信号物质、激素对植物子叶的影响 2.掌握细胞死活与过氧化氢鉴定方法
二 实验原理：
植物受到一些物质处理时，会作出相应的反应。 产 生活性物质（信号物质）。一些细胞甚至会死亡。这些反 应可被检测。
三实验内容：
一、茉莉酸甲酯对黄瓜子叶的作用 二、一些物质对茉莉酸甲酯作用的影响
茉莉酸甲酯在植物生长和发育过程中是体现出类似 激素的作用，能够促进种子的萌发，植物的生长、开 花、还能促进叶片的衰老，块茎形成，果实成熟等。 从第一组的实验可以看出茉莉酸甲酯促进了叶片的衰 老，并且浓度越高，对细胞的衰老作用就越强。
第二组 硝普钠SNP
从第二组的实验现象可以看出，随着硝普钠的浓度越来 越高，子叶的衰老现象就越来越不明显，叶片的死细胞也 越来越少，染色现象也越来越浅。
3.氮蓝四唑 （NBT）进行O-组织化学定位
原理：NBT在O-的作用下还原成不溶于水的蓝色二甲替， 此法测定灵敏度高，常用于O-的组织化学定位。
取子叶放入含有0.1％NBT的10mM磷酸缓冲液中 （0.02mol/L，pH7.0）中，真空渗透5min，然后将 叶片置于饱和水氨醛（95％酒精）中，水浴煮沸 2min进行固定和脱色，待叶绿素完全褪去后进行观 察和拍照。透明后的叶片也可以保存在在50％的甘 油中，以备显微观察。
由于茉莉酸甲酯对叶片是起到一个促进衰老的作用，而NO 是起一个延缓叶片衰老的作用，所以第八组的第一个实验现 象可以看出，两种试剂的作用是相互抵消了的，第二个试验 中的牛血红蛋白是减缓叶片衰老的，所以当他和茉莉酸甲酯 一起使用是，也是呈一个作用相互抵消的效果的。
第八组的第三个实验是用茉莉酸甲酯和乙烯利一起运用， 由于茉莉酸甲酯和乙烯都是促进叶片衰老的，所以，此时， 两者的作用相互叠加了，第四个实验是将茉莉酸甲酯和氯化 钴一起合用，氯化钴是起减缓衰老的作用的，所以两者的作 用相互抵消了。
茉莉酸甲酯 （5×10^﹣5mol/L)
茉莉酸甲酯 （5×10^﹣6mol/L)
蒸馏水
茉莉酸甲酯 （5×10^﹣4 mol/L)
茉莉酸甲酯 （5×10^﹣5mol/L)
茉莉酸甲酯 （5×10^﹣6mol/L)
第二组
浓度为100umol/LSNP对黄瓜子叶的影响
200umol/L SNP处理下的黄瓜子叶
第七组CoCL2
CoCL2对叶片对起延缓衰老的作用。适宜范围浓度的钴对 植物种子萌发，幼苗生长具有一定的促进作用，钴有可能通 过调节活性酶和乙烯的代谢而发挥其生理作用。钴是乙烯合 成的一种重要的抑制剂，通过抑制该酶的活性显著抑制乙烯 的产生 。所以CoCL2对叶片的生长具有延缓衰老的作用。
第八组 MJ与NO、H2O2的关系
四实验结果分析
4.1 各小组的实验结果 第一组
蒸馏水
茉莉酸甲酯 （5×10^﹣5mol/L)
茉莉酸甲酯 （5×10^﹣4 mol/L)
茉莉酸甲酯 （5×10^﹣6mol/L)
蒸馏水
茉莉酸甲酯 （5×10^﹣5mol/L)
茉莉酸甲酯 （5×10^﹣4 mol/L)
茉莉酸甲酯 （5×10^﹣6mol/L)
0.6% H2O2 0.9% H2O2 10月24日 1.2% H2O2
0.6% H2O2 0.9% H2O2 10月26日 1.2% H2O2
0.6% H2O2 0.9% H2O2 11月12日 1.2% H2O2
第四小组
DAB染色 NBT染色
台盼蓝染色
H2O2处理 从左到右的顺序 浓度分别为
第三组 牛血红蛋白 Hb
牛血红蛋白，NO是具有生物活性和信号转导作用的易 扩散分子，是植物细胞生长发育以及生理活动的调节因 子。它不仅对植物的许多生命活动如种子萌发、叶片扩 展、根系生长、逆境生理以及细胞的程序性死亡等具有 直接的生理调节功能，而且作为防御反应中的关键信使。 NO对植物凋亡有调控作用，对植物叶片的衰老的诱导作 用与乙烯相似。可以通过调控NO的浓度水平来调节细胞 凋亡的进程。本实验通过添加牛血红蛋白，作为NO的清 除剂，具有降低植物细胞内NO浓度而起到对细胞生长衰 老的调节作用。
1. SNP/Hb 2.乙烯利/CoCl 2 3.H2O2供体/H2O2清除剂
SNP（硝普钠）是NO的供体，而NO是重要的植物信号物质。
ETH（乙烯利）是乙烯供体，乙烯是一种植物生长激素。
H2O2是信号物质，也是强氧化物。可以被检测。
观察和测定指标
1.观察茉莉酸甲酯处理黄瓜子叶的影响 2.细胞死活鉴定（Trypan blue） 3.活性氧的检测（DAB、NBT活性检测）
5×10-5mol/L MJ+1.0g/L Vc
5×10-5mol/L MJ+1.2g/L H2O2
5×10-6mol/L MJ+1.2g/L H2O2
4.2 实验结果分析
第一组 茉莉酸甲酯
由第一组的实验现象可以看出，随着茉莉酸甲酯的 浓度的增高，植物衰老的现象越来越明显，而且做细 胞活性实验后，也是随着茉莉酸甲酯的浓度越高，叶 片也从透明到逐渐染成深色，这是因为随着茉莉酸甲 酯的浓度越高，导致子叶片的死细胞也会越来越多， 所以叶片的染色也是越来越深。
H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸、蛋白质等生 物大分子，并使细胞膜脂质过氧化损伤，从而加速细胞 的衰老和解体，是信号物质，也是强氧化物。
第五组 Vc
从第五组的实验现象来看， 叶片并没有因为维生素C的在 培养基中的含量增多而促进叶肉细胞的衰老，反而是因为维 生素C含量的增多延缓了叶片的衰老。
那是由于维生素C是过氧化酶的清除剂，H2O2可以直接或 间接地氧化细胞内核酸、蛋白质等生物大分子，并使细胞膜 脂质过氧化损伤，从而加速细胞的衰老和解体，是信号物质， 也是强氧化物。而当加入维生素C时，则就抑制了过氧化物 的作用，从而，抑制植物叶片的衰老。
种子萌发
所用的黄瓜品种为粤秀3号，采用滤纸培养法萌发 种子。将种子均匀地拜访在铺有2层滤纸的保鲜盒 中，加适量的水，以倾斜保鲜盒时在角底处约有 1ml水为准，置28℃光照培养箱培养5-7d
子叶处理
摘取子叶整齐地摆放在铺有2层滤纸的培养皿中（9cm，取10 对子叶），叶面朝上，叶背面贴靠滤纸，加入不同溶液进行处 理（溶液不能太多，倾斜培养皿时，只能有约1ml液体）。置 光照培养箱中培养（28℃，光照12h），培养1d、3d、5d取出 培养皿观察和拍照，然后放回培养箱继续培养，培养7d观察和 拍照后进行下一步实验。
300umol/LSNP处理下的黄瓜子叶
SNP处理子叶染色后结果展示
第三组
25umol/LHb处理下的黄瓜子叶
50umol/LHb处理下的黄瓜子叶
100umol/LHb处理下的黄瓜子叶
Hb处理的黄瓜子叶经染色后的变化
第四组（过氧化氢）
0.6% H2O2 1.2% H2O2
0.8% H2O2 10月23日
蒸馏水
茉莉酸甲酯 （5×10^﹣5mol/L)
茉莉酸甲酯 （5×10^﹣4 mol/L)
茉莉酸甲酯 （5×10^﹣6mol/L)
蒸馏水
茉莉酸甲酯 （5×10^﹣5mol/L)
茉莉酸甲酯 （5×10^﹣4 mol/L)
茉莉酸甲酯 （5×10^﹣6mol/L)
Hale Waihona Puke 蒸馏水茉莉酸甲酯 （5×10^﹣4 mol/L)
第六组ETH ETH是乙烯利，是乙烯的供体，它既能促进营养器官的生长，
又能影响开花结果，并且在植物抗逆中发挥作用。
乙烯是一种气体，是能够促进衰老的植物激素。这样是符合 我们的实验结果的，随着ETH的浓度升高，在培养皿中释放的 乙烯浓度也越来越高，叶片的衰老现象也越来越明显，相对应 的叶片的染色也越来越深。
Trypan blue：台盼蓝 DAB ：二氨基联苯胺 NBT ： 氮蓝四唑
1.细胞死活的鉴定（Trypan blue）
原理：台盼蓝不能穿过活细胞质膜，只有死细
胞染成蓝色，活细胞不能被染色。
过程：取10片子叶到烧杯中，加入适量的台盼蓝染液，抽 真空5min，使得染液渗透进入细胞；水浴煮沸2min，然后用 2.5g/ml的水合氯醛（95％酒精）脱色至组织透明，观察和拍 照，死亡细胞被染成蓝色。透明后的叶片也可以保存在50％ 的甘油中，以备显微观察。
这是由于，硝普钠SNP是NO的供体，随着硝普钠SNP 的浓度越高，那么培养基中的NO的浓度就越高。NO是具 有生物活性和信号转导作用的易扩散分子，是植物细胞生 长发育以及生理活动的调节因子。它不仅对植物的许多生 命活动如种子萌发、叶片扩展、根系生长、逆境生理以及 细胞的程序性死亡等具有直接的生理调节功能，而且作为 防御反应中的关键信使。NO对植物凋亡有调控作用，对植 物叶片的衰老的诱导作用与乙烯相似。可以通过调控NO的 浓度水平来调节细胞凋亡的进程。NO对子叶的影响就是延 缓子叶的衰老。
2.过氧化氢活体组织的定位（DAB）
原理：H2O2在过氧化酶的催化下可与DAB迅速反应生 成棕色化合物，从而定位组织中的H2O2。植物叶片渗透 （DAB）以定位H2O2是一种应用比较普遍的组织染色方 法。
取处理后的黄瓜子叶浸入1mg/mlDAB的磷酸缓冲液 （0.02mol/L，pH7.0）中，抽真空5min，然后于黑暗中放 置8h。将叶片置于饱和水氨醛（95％酒精）中脱去叶绿素， 观察和拍照。透明后的叶片也可以保存在在50％的甘油中， 以备显微观察。
0.6%、0.8%、1.2%
第五组 Vc
0.6g/LVc处理下的黄瓜子叶
0.8g/LVc处理下的黄瓜子叶
1.0g/LVc处理下的黄瓜子叶
第六组 ETH
第六小组
ETH处理
第七组
25umol/L COCl2 处理下的黄瓜子叶
50umol/L COCl2处理下的黄瓜子叶
75umol/L COCl2 处理下的黄瓜子叶
第四组 H2O2过氧化氢
从实验结果可以看出， 过氧化氢的浓度越高，那么 叶片的衰老速度也就越快，在测细胞的活性时，所对应 的叶片的染色就越深，说明，高浓度的过氧化氢是促进 叶肉细胞衰老的，导致在高浓度的情况下叶片的死亡细 胞就越多。H2O2是信号物质，也是强氧化物。过氧化 氢对植物叶片的生长具有促进衰老的作用。