基于点击化学反应的免疫荧光检测方法的建立和应用
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生 物偶联技 术是通 过小 分子化 合物对 生物 大分 子进 行修 饰 的一 种技术 ，已被广 泛用 于分 子生 物学
和化学生物学等领域 ， 如用于蛋 白质 、 核酸等的荧光团标记、 修饰 、 配体螯合及放射性 同位素标记等． 免疫 荧光抗 体技术 是使 用一个 特殊 的荧光标 记物共 价连 接到任 意一种抗 原 或抗体 上 ， 通过 荧光 并
６叠氮一 一 己酸琥珀酰亚胺 活性酯和 ４乙炔基 一 一，－ 一 乙基 １ ８萘酰亚胺 ， 并将 合成的 ６叠氮一 一 己酸琥珀 酰亚胺活性 酯与抗 ｈｒ ｅ２抗体 Ａ ｔＨ １ ｎｉ Ｐ ５的游离氨基偶联 获得叠氮化 ＩＧ； — ｇ 随后通过铜 离子催化 ４乙炔基一 一 一 Ⅳ 乙基一，－ １ ８萘
胺， 利用 点击化 学荧光 显色反 应 ， 开发 了一种 新 的免 疫分 析 方法 ， 细 胞水 平上 证 明 了该 方法 可与 传 在
统 的抗体 标记技术 和生 物素． 霉亲 和素 免疫荧 光检测 系统 同时使用 ，信号互不 干扰 ， 链 且具 有相 同的检
测灵 敏度 ．将该 方法成 功地用 于细胞 水平 的免疫 检 测 ， 理 如 图 １ 示 ．在 免疫 球 蛋 白 Ｉ 原 所 ｇ Ｇ上 引入 叠
水平上进行染色分析．结果表 明， 氮标记抗体可有效应用于免疫荧光染色分析．最后 ， 用激光共聚焦三 叠 采
通道复合荧光分 析法对不 同标记方法及其对应 的免疫荧光显 色方法进行 了研究 ， 确认采用 本文方法 标记的 抗体可与其它免疫荧光技术同时使用 ， 且结果互不干扰 ．本研究 通过开发一种新型的抗体标记技术 ， 建立 了
酰亚胺 中的炔基与标 记抗体 的叠氮基团进行点击 化学反应 ， 同时 以 Ｎ ＳＦＴ Ｈ —ＩＣ和 Ｎ ＳＲ ｏａ ｉ 标记 的抗体 Ｈ —ｈｄ ｍｎ ｅ
为 阳性 对 照 ， 定 了 该标 记 方 法 的灵 敏 度 ， 检 出 限可 达 ０ １Ｉ ， Ｃ。 果 与 阳 性 对 照 相 当 ．然 后 ， 细 胞 测 其 ． ｘ Ｅ 结 ｇ 在
体分析方法 ， 并在细胞水平上进行了应用和验证 ， 丰富了免疫学检测体系和荧光抗体检测手段 ， 在未
来 的免 疫研究 中具 备发展 潜力 和广泛 的应用 前景．
收稿 日期 ： ０００ －９ ２ １ －４０ ．
基金项 目： 国家 “ 九七三” 计划项 目（ 批准号 ： ０ ７ Ｂ １ ８３ 和国家 自然科学基金 （ ２０ Ｃ ９４ ０ ） 批准号 ： ０ ０２ ６ 资助． ３ ９０ ５ ） 联系人简介 ： 钢 ， ， 白 男 博士 ， 教授 ， 博士生导师 ， 主要从事分子 生物学及免疫学研究．Ｅｍ ｉ ｇ ｇａ ａｋｉ ｄ ．ｌ － ａ ： ａ ｂｉ ｎ ａ ｅ ｕ ｅ ｌ ｎ ＠ｎ ． ｌ
显 微镜进 行检测 的方法 ．目前 ，ＦＴ ＩＣ和罗 丹 明 等荧 光 标 记 物 已被 广 泛 用 于免 疫 荧 光 分析 技 术 中，此 外 ， 用生物 素． 和素 系统 的免 疫检测 系统 也被广 泛应用 ． ． 利 亲 ８ Ｊ 本研究 通过合 成两 种 化 合 物 ，即 ６叠 氮一 ． 己酸琥 珀 酰亚 胺 活性 酯 和 ４乙炔 基． 一 一 ／ 乙基 －，一 酰 亚 ｖ １８萘
十现 在南开大学学报编辑部工作．
高 等 学 校 化 学 学 报
Leabharlann Baidu
Ｎ—
一
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ＮＨ
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。
Ｃｕ Ｓ０４ａ ｉ ｓ ｏ ｂ ｔ／ ／ ｃ ｄ ａ ｃ ｒ ａ ｅＤＭ Ｓ Ｈ２ Ｏ／ Ｏ
Ｆｉ １ Ｐｒ ｎ ｉ ｌ ｆｃｉｋ ｈｅ ｉｔｙ ｉ ｉ ｍ ｕｎ ｌｕｏ ｅ ｃ ｎ ｅ ａｎ ｙ ｉ ｇ． ｉ ｃ ｐ ｅ ｏ ｌｃ ｃ ｍ ｓｒ ｎ ｍ ｏｆ ｒ ｓ ｅ ｃ ａｌｓｓ
Ｖ０ ． ２ １３ ２ １ 年 ２月 ０１
高 等 学 校 化 学 学 报
ＣＨＥＭＩ ＡＬ Ｊ Ｃ ＯＵＲＮＡＬ ＯＦ Ｃ ＮＥＳ ＨＩ Ｅ ＵＮＩ ＶＥＲＳＴ ＥＳ ＩＩ
ＮＯ ２ ．
２８ ｌ～２ ５ ８
基 于 点 击 化 学 反 应 的 免 疫 荧 光 检 测 方法 的建 立 和应 用
一
种新的免疫荧光抗体分析方法 ， 并在细胞水平上进行 了应用验证 ，丰富 了免疫荧光抗体检测手段 ， 该方法
点 击 化 学 ； 疫 荧 光 分 析 ； 物 偶 联 免 生 ０ ５ ６７ 文 献 标识 码 Ａ 文章编号 ０ ５ － ９ （０ ） ２ ２ １ ５ ２ １ ７０ ２１ ０－ ８－ ０ １ ０ ０
氮基 团 ， 利用 抗原 一 特异性 反应 ， 抗体 叠氮 化 的 ＩＧ与对 应 的抗 原特 异性结 合 ，随后 加入 ４乙炔 基一 乙 ｇ 一 Ⅳ一 基．，． 酰亚胺 和相应 的催 化剂 ， １８萘 经点击 化 学反 应 后 ， 过激 光 共 聚焦 显微 镜 在 ３ ５ｉ 通 ６ ｍ激 发 光下 观 ｌ 察， 可见 明显 的蓝色荧 光．本研究通 过开 发 的一种新 型 的抗体 标记 技 术 ， 立 了一 种新 的 免疫荧 光 抗 建
在未来 的免疫研究 中具备发展潜力 和广泛 的应用前景．
关键词 中图 分 类 号
点击化 学是通 过小单 元 的拼 接来快 速 、可靠 地完 成各 种分 子 的化学 合成 ．．它尤 其强 调 以碳． ２ ｊ 杂 原子键 （ — ｘ Ｃ 合成 为基础 的组合 化学新 方法 ， ｃ — ） 并借 助该 反 应来 简单 、高效 地获 得分 子多 样性 ．由 于点击化 学产 物无毒 ， 稳定性 好 ，已被 广泛 用 于药 物筛 选 、药物 开发 、聚合 及 其它 生物 体 外 和体 内 且 分析研究 ． 。
张 奇 王 ， 彬 黎 ， 霞 侯 洁 芳 ， ，白 ，孙 丹 ，白 钢 ，
（ ． 开大学药学 院， ．生命科学学院 ， １南 ２ 天津 ３ ０７ ） ０ ０ １
摘要
报道 了一种新 型免疫荧光标记方法及其在细胞荧 光检测 中的应 用．首先 ， 合成 了 ２个关 键的化合物
和化学生物学等领域 ， 如用于蛋 白质 、 核酸等的荧光团标记、 修饰 、 配体螯合及放射性 同位素标记等． 免疫 荧光抗 体技术 是使 用一个 特殊 的荧光标 记物共 价连 接到任 意一种抗 原 或抗体 上 ， 通过 荧光 并
６叠氮一 一 己酸琥珀酰亚胺 活性酯和 ４乙炔基 一 一，－ 一 乙基 １ ８萘酰亚胺 ， 并将 合成的 ６叠氮一 一 己酸琥珀 酰亚胺活性 酯与抗 ｈｒ ｅ２抗体 Ａ ｔＨ １ ｎｉ Ｐ ５的游离氨基偶联 获得叠氮化 ＩＧ； — ｇ 随后通过铜 离子催化 ４乙炔基一 一 一 Ⅳ 乙基一，－ １ ８萘
胺， 利用 点击化 学荧光 显色反 应 ， 开发 了一种 新 的免 疫分 析 方法 ， 细 胞水 平上 证 明 了该 方法 可与 传 在
统 的抗体 标记技术 和生 物素． 霉亲 和素 免疫荧 光检测 系统 同时使用 ，信号互不 干扰 ， 链 且具 有相 同的检
测灵 敏度 ．将该 方法成 功地用 于细胞 水平 的免疫 检 测 ， 理 如 图 １ 示 ．在 免疫 球 蛋 白 Ｉ 原 所 ｇ Ｇ上 引入 叠
水平上进行染色分析．结果表 明， 氮标记抗体可有效应用于免疫荧光染色分析．最后 ， 用激光共聚焦三 叠 采
通道复合荧光分 析法对不 同标记方法及其对应 的免疫荧光显 色方法进行 了研究 ， 确认采用 本文方法 标记的 抗体可与其它免疫荧光技术同时使用 ， 且结果互不干扰 ．本研究 通过开发一种新型的抗体标记技术 ， 建立 了
酰亚胺 中的炔基与标 记抗体 的叠氮基团进行点击 化学反应 ， 同时 以 Ｎ ＳＦＴ Ｈ —ＩＣ和 Ｎ ＳＲ ｏａ ｉ 标记 的抗体 Ｈ —ｈｄ ｍｎ ｅ
为 阳性 对 照 ， 定 了 该标 记 方 法 的灵 敏 度 ， 检 出 限可 达 ０ １Ｉ ， Ｃ。 果 与 阳 性 对 照 相 当 ．然 后 ， 细 胞 测 其 ． ｘ Ｅ 结 ｇ 在
体分析方法 ， 并在细胞水平上进行了应用和验证 ， 丰富了免疫学检测体系和荧光抗体检测手段 ， 在未
来 的免 疫研究 中具 备发展 潜力 和广泛 的应用 前景．
收稿 日期 ： ０００ －９ ２ １ －４０ ．
基金项 目： 国家 “ 九七三” 计划项 目（ 批准号 ： ０ ７ Ｂ １ ８３ 和国家 自然科学基金 （ ２０ Ｃ ９４ ０ ） 批准号 ： ０ ０２ ６ 资助． ３ ９０ ５ ） 联系人简介 ： 钢 ， ， 白 男 博士 ， 教授 ， 博士生导师 ， 主要从事分子 生物学及免疫学研究．Ｅｍ ｉ ｇ ｇａ ａｋｉ ｄ ．ｌ － ａ ： ａ ｂｉ ｎ ａ ｅ ｕ ｅ ｌ ｎ ＠ｎ ． ｌ
显 微镜进 行检测 的方法 ．目前 ，ＦＴ ＩＣ和罗 丹 明 等荧 光 标 记 物 已被 广 泛 用 于免 疫 荧 光 分析 技 术 中，此 外 ， 用生物 素． 和素 系统 的免 疫检测 系统 也被广 泛应用 ． ． 利 亲 ８ Ｊ 本研究 通过合 成两 种 化 合 物 ，即 ６叠 氮一 ． 己酸琥 珀 酰亚 胺 活性 酯 和 ４乙炔 基． 一 一 ／ 乙基 －，一 酰 亚 ｖ １８萘
十现 在南开大学学报编辑部工作．
高 等 学 校 化 学 学 报
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Ｖ０ ． ２ １３ ２ １ 年 ２月 ０１
高 等 学 校 化 学 学 报
ＣＨＥＭＩ ＡＬ Ｊ Ｃ ＯＵＲＮＡＬ ＯＦ Ｃ ＮＥＳ ＨＩ Ｅ ＵＮＩ ＶＥＲＳＴ ＥＳ ＩＩ
ＮＯ ２ ．
２８ ｌ～２ ５ ８
基 于 点 击 化 学 反 应 的 免 疫 荧 光 检 测 方法 的建 立 和应 用
一
种新的免疫荧光抗体分析方法 ， 并在细胞水平上进行 了应用验证 ，丰富 了免疫荧光抗体检测手段 ， 该方法
点 击 化 学 ； 疫 荧 光 分 析 ； 物 偶 联 免 生 ０ ５ ６７ 文 献 标识 码 Ａ 文章编号 ０ ５ － ９ （０ ） ２ ２ １ ５ ２ １ ７０ ２１ ０－ ８－ ０ １ ０ ０
氮基 团 ， 利用 抗原 一 特异性 反应 ， 抗体 叠氮 化 的 ＩＧ与对 应 的抗 原特 异性结 合 ，随后 加入 ４乙炔 基一 乙 ｇ 一 Ⅳ一 基．，． 酰亚胺 和相应 的催 化剂 ， １８萘 经点击 化 学反 应 后 ， 过激 光 共 聚焦 显微 镜 在 ３ ５ｉ 通 ６ ｍ激 发 光下 观 ｌ 察， 可见 明显 的蓝色荧 光．本研究通 过开 发 的一种新 型 的抗体 标记 技 术 ， 立 了一 种新 的 免疫荧 光 抗 建
在未来 的免疫研究 中具备发展潜力 和广泛 的应用前景．
关键词 中图 分 类 号
点击化 学是通 过小单 元 的拼 接来快 速 、可靠 地完 成各 种分 子 的化学 合成 ．．它尤 其强 调 以碳． ２ ｊ 杂 原子键 （ — ｘ Ｃ 合成 为基础 的组合 化学新 方法 ， ｃ — ） 并借 助该 反 应来 简单 、高效 地获 得分 子多 样性 ．由 于点击化 学产 物无毒 ， 稳定性 好 ，已被 广泛 用 于药 物筛 选 、药物 开发 、聚合 及 其它 生物 体 外 和体 内 且 分析研究 ． 。
张 奇 王 ， 彬 黎 ， 霞 侯 洁 芳 ， ，白 ，孙 丹 ，白 钢 ，
（ ． 开大学药学 院， ．生命科学学院 ， １南 ２ 天津 ３ ０７ ） ０ ０ １
摘要
报道 了一种新 型免疫荧光标记方法及其在细胞荧 光检测 中的应 用．首先 ， 合成 了 ２个关 键的化合物