食品安全国家标准 食品中烟酸和烟酰胺的测定

食品安全国家标准
食品中烟酸和烟酰胺的测定
1范围
本标准规定了食品中烟酸和烟酰胺的测定方法。

本标准第一法为微生物法，适用于各类食品包括以天然食品为基质的强化食品中烟酸和烟酰胺总量的测定；第二法为高效液相色谱法，适用于含量较高或强化食品中烟酸和烟酰胺的测定。

第一法微生物法
2原理
烟酸是植物乳杆菌Lactobacillμs plantarμm（A TCC 8014）生长所必需的营养素，在一定控制条件下，将植物乳杆菌液接种至添加试样液的培养液中，培养一段时间后测定透光率，根据烟酸含量与透光率的标准曲线计算出试样中烟酸的含量。

3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。

培养基可购买符合测试要求的商品化培养基。

3.1试剂
3.1.1盐酸（HCl）。

3.1.2氢氧化钠（NaOH）。

3.1.3氯化钠（NaCl）。

3.1.4浓硫酸（H2SO4）。

3.1.5溴麝香草酚蓝（C27H28Br2O5S）：pH指示剂。

3.1.6乙醇（C2H5OH）。

3.2试剂配制
3.2.1盐酸溶液（1 mol/L）：用量筒量取吸取83 mL盐酸，于1000 mL烧杯中，加917mL 水，混匀。

3.2.2盐酸溶液（0.1 mol/L）：吸取3.2.1盐酸溶液10mL，加水溶解至100mL。

3.2.3氢氧化钠溶液（1 mol/L）：称取40 g氢氧化钠于1000 mL烧杯中，加水溶解并稀释至1000 mL，混匀。

3.2.4氢氧化钠溶液（0.1 mol/L）：吸取3.2.3氢氧化钠溶液10mL，加水溶解至100mL。

3.2.5生理盐水（0.9%）：称取9g氯化钠（NaCl），溶解于1000ml水中，分装10mL于试管中，121℃灭菌15min，备用。

3.2.6乙醇溶液（25%）：量取200 mL无水乙醇与800 mL水混匀。

3.2.7硫酸溶液（1 mol/L）：于2000mL烧杯中先注入700mL水，用量筒量取56mL硫酸沿烧杯壁缓慢倒入水中，用水稀释到1000mL。

3.3培养基
3.3.1乳酸杆菌琼脂培养基：称取光解胨15g，葡萄糖10g，磷酸氢二钾2g，聚山梨糖单油酸酯1g，琼脂10g于1000 mL烧杯中，加入番茄汁100mL，加900mL蒸馏水溶解，混匀，调pH6.8±0.2（25℃），分装10mL于试管中，121℃高压灭菌15min，备用。

3.3.2乳酸杆菌肉汤培养基：称取光解胨15g，葡萄糖10g，磷酸氢二钾2g，聚山梨糖单油酸酯1g，于1000 mL烧杯中，加入番茄汁100mL，加900mL蒸馏水溶解，混匀，调pH6.8±0.2（25℃），分装10mL于试管中，121℃高压灭菌15min，备用。

3.3.3烟酸测定用培养基：维生素测定用酪蛋白氨基酸12g，葡萄糖40g，乙酸钠20g，L-胱氨酸0.4g，DL-色氨酸0.2g，盐酸腺嘌呤20mg，盐酸鸟嘌呤20mg，尿嘧啶20mg，盐酸硫胺素200μg，泛酸钙200μg，盐酸吡哆醇400μg，核黄素400μg，p-氨基苯甲酸100μg，生物素0.8μg，磷酸氢二钾1g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.4g，氯化钠20mg，硫酸亚铁20mg，硫酸锰20mg。

加蒸馏水至1000mL，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液（3.2.4）调pH至6.7±0.2（20℃~25℃）。

注：自行配制烟酸测定培养基时，所有试剂不得含有烟酸。

3.4标准品
3.4.1（C19H19N7O6）：纯度≥99 .5%。

3.5标准溶液的配制
3.5.1烟酸标准储备液（0.1mg/mL）：精确称取50.0 mg烟酸标准品，用乙醇溶液（3.2.5）溶解并移至500 mL容量瓶中，定容，混匀于2℃～4℃冷藏。

此溶液每mL相当于100μg烟酸。

3.5.2烟酸标准中间液（10μg/mL）：准确吸取10.0mL 烟酸标准储备液（3.5.1）置于100 mL 棕色容量瓶中，用乙醇溶液（3.2.5）稀释并定容至刻度，混匀于2℃～4℃冷藏。

此溶液每mL相当于10μg烟酸。

3.5.3烟酸标准中间液（1μg/mL）：准确吸取1.0mL 烟酸标准储备液（3.5.1）置于100 mL 棕色容量瓶中，用乙醇溶液（3.2.5）稀释并定容至刻度，混匀于2℃～4℃冷藏。

此溶液每mL相当于1μg烟酸。

3.5.4烟酸标准工作液（100ng/mL）：准确吸取5.00 mL烟酸标准中间液（3.2.2）置于50 mL 容量瓶中，用水稀释定容至刻度，混匀于2℃～4℃冷藏。

此溶液每mL相当于100ng烟酸。

3.5.5烟酸标准工作液（40ng/mL）：准确吸取0.4mL 烟酸标准中间液（3.5.2）置于100 mL 棕色容量瓶中，用乙醇溶液（3.2.5）稀释并定容至刻度，混匀于2℃～4℃冷藏。

此溶液每mL相当于40ng烟酸。

4仪器和设备
4.1天平：感量分别为0.1g和0.1 mg。

4.2均质设备：用于试样的均质化。

4.3恒温培养箱：36℃±1℃。

4.4漩涡振荡器。

4.5压力蒸汽消毒器：121℃(0.10 mPa～0.12 mPa)。

4.6离心机：转速≥2000 rpm。

4.7pH计：精度±0.01。

4.8分光光度计。

4.9超净工作台。

4.10超声波振荡器。

4.11微孔板酶标仪
5菌种的制备与保存
5.1菌种：植物乳杆菌Lactobacillμs plantarμm（ATCC 8014）。

5.2储备菌种的制备
将菌种植物乳杆菌Lactobacillμs plantarμm（ATCC 8014）转接至乳酸杆菌琼脂培养基中，在36℃±1℃恒温培养箱中培养20 h～24 h，取出后放入2℃～4℃冰箱中保存。

每月至少传种一次，作为储备菌株保存。

实验前将储备菌株接种至乳酸杆菌琼脂培养基中，在36℃±1℃恒温培养箱中培养20 h～24 h以活化菌株，用于接种液的制备。

保存数周以上的储备菌种，不能立即用作接种液制备，实验前宜连续传种2~3 代以保证菌株活力。

5.3接种液的制备
试验前一天，从乳酸杆菌琼脂培养基移取部分菌种于灭菌的10mL乳酸杆菌肉汤培养基（3.3.2）中，于36℃±1℃恒温培养箱中培养6 ~18h。

在无菌条件下离心该培养液15min，倾去上清液。

加入10mL已灭菌的生理盐水（3.1.3）重新分散细胞，于旋涡混合器上快速混合均匀，离心15min，倾去上清液。

重复离心和清洗步骤三次。

以第三次细胞分散液中吸取1mL加入10mL已灭菌的生理盐水（3.1.3），使其充分混合均匀制成混悬液，备用。

用721分光光度计，在550nm波长下，以0.9％生理盐水为参比，读取该菌悬液的浊度值透光值（％T），用0.9％生理盐水或第三次细胞分散液调整透光值，使其范围在60~80％之间。

立即使用。

6试管法
所有操作均需避光进行。

6.1试样制备
谷薯类、豆类、坚果（去壳）等试样需粉碎、研磨、过筛（筛板孔径0.3 mm～0.5 mm)；乳粉、米粉等试样混均；肉、蛋、鱼、动物内脏等用打碎机制成食糜；果蔬、半固体食品等试样需匀浆混匀；液体试样用前振摇混合。

4℃冰箱保存，1周内测定。

6.2试样提取
准确称取约含烟酸0.1mg的试样，一般乳类、新鲜果蔬试样2 g～5 g（精确至0.0001g）；谷类、豆类、坚果类、内脏、生肉、干制试样0.2 g～1 g（精确至0.0001g），液态试样5g；乳粉、米粉等准确称取适量试样2 g（精确至0.0001g）；一般营养素补充剂、复合营养强化剂0.1 g~0.5 g；食品0.2 g~1 g；液体饮料或流质、半流质试样5 g~10 g于100 mL锥形瓶中，加入硫酸溶液（3.2.6），加入被检验物质干重10倍的硫酸溶液（3.2.6）。

在121℃下，水解30min后冷却至室温。

用0.1 mol/L氢氧化钠溶液（3.2.4）调pH至6.0~6.5，再用0.1 mol/L 盐酸调pH至4.5±0.1(3.2.2)，用水定容至100mL，用无灰滤纸过滤，滤液备用。

6.3稀释
根据试样中烟酸含量用水对试样提取液进行适当稀释(f)，使稀释后试样提取液中烟酸含量在50.0 ng ~500.0 ng 范围内。

6.4测定系列管制备
6.4.1标准系列管
取试管分别加入烟酸标准工作液0.00 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、4.0 mL和5.00mL，补水至5.0 mL，相当于标准系列管中烟酸含量为0. 0 ng、50 ng、100 ng、150ng、200ng、250ng、300ng、400 ng、500 ng。

加5.0 mL烟酸测定用培养基，见表1。

混匀。

每个标准点应制备3管。

表1标准曲线管的制作
*试管No.1－2中不添加标准溶液；2中滴加菌液；
No.3－10中添加标准品溶液的浓度依次增高。

3个重复。

6.4.2试样系列管
取4支试管，分别加入1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL试样提取液，补水至5.0 mL，加入5.0 mL 烟酸测定用培养液，见表2。

混匀，每个浓度做3个重复。

表2试样管的制作
6.4.3 灭菌：将所有的标准系列管和试样系列管测定管塞好棉塞，于121℃(0.10～0.12 mPa)高压灭菌5 min 。

灭菌完成后，迅速冷却，备用。

6.5 培养
6.5.1 接种：在无菌操作条件下，将接种液转入无菌针管，向每支测定管接种一滴。

6.5.2 培养：将加完菌液的试管置于36℃±1℃恒温培养箱中培养16h ～24h ，直至获得最大混浊度，即再培养2 h 透光率无明显变化。

另准备一支标准0管（含0.0 ng 烟酸）不接种作为0对照管。

6.6 透光率的测定
用厚度为1 cm 比色杯，在波长550 nm 条件下读取透光值，将培养好的测定管用漩涡混匀器混匀。

以未接种0对照管调节透光率为100%，然后依次测定标准系列管、试样系列管的透光率。

如果0对照管有明显的细菌增长；或与0对照管相比，标准管透光率在90%以下，、说明可能有杂菌或不明来源烟酸混入，需重做实验。

取出最高浓度标准曲线管振荡5s ，测定透光值，放回重新培养。

2h 后同等条件重新测该管的光密度，如果两次光密度的绝对差结果≤2%，则取出全部检验管测定标准溶液和试样的光密度。

6.7 标准曲线的绘制
以标准系列管烟酸含量为横坐标，透光率为纵坐标，绘制标准曲线，也可对各个标准点做拟合曲线。

各个标准点3管之间的透光率的相对标准偏差应小于10%，如果某一标准点3支试样管中有2支烟酸含量落在50 ng ～500 ng 范围内，且该两管之间折合为每mL 试样提取液中烟酸含量的偏差小于10%，则该结果可用，如果3支试样管中烟酸含量的相对标准偏差大于10%，则该点舍去，不参与标准曲线的绘制。

6.8 结果表述
试样结果计算：从标准曲线查得试样系列管中烟酸的相应含量（c ），按式（1）进行结果计算。

测定液浓度按式（1）计算： 1000
100
1⨯
⨯⨯=m f V c X ………………………………………………………（1） 式中：
X ——试样中烟酸含量，单位为毫克每百克（mg/100 g ）；
c ——试样系列管折合为试样提取液中烟酸浓度平均值，单位为纳克每毫升（ng/mL ）； V 1——试样提取液定容体积，单位为毫升（mL ）； f —— 试样提取液稀释倍数； m ——试样质量，单位为克（g ）；
1000
100
——折算成每百克试样中烟酸毫克数的换算系数。

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留两位有效数字。

注：所用试管使用前洗刷干净，用蒸馏水煮沸30 min ，沥干后放入盐酸水溶液（1：50）中浸泡2h ，经170℃烘3h 后使用。

7 精密度
普通食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%；强化食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%。

8 96孔微孔板法 8.1 原理
利用微生物法，定量检测食品中的烟酸总量，将稀释了的样品提取液和烟酸检测培养基与植物乳杆菌混匀后加入微孔中，该菌的生长状况取决于烟酸的含量并会一直生长直至烟酸被消耗殆尽，细菌生长时新陈代谢的强度和烟酸的含量形成关系并绘制标准曲线，最后通过微孔板酶标仪在630nm 读取结果。

8.2 样品前处理
试样制备同6.1。

8.3 试样提取
准确称取约含烟酸0.1mg 的固态试样1g （精确至0.0001g ）或液态试样5g （精确至0.0001g ）于50mL 三角烧瓶中，加入蒸馏水40mL 充分溶解，相当于对样品进行了40倍稀释，该稀释倍数包含在标准曲线内。

在115℃下处理10min 后冷却至室温。

吸取1mL 于1.5mL 离心管在8000rpm 离心10min ，根据样品种类的不同取上清液进行稀释，备用。

8.4 标准曲线的制作
制备标准曲线，将烟酸标准工作液（3.5.5）按表3添加标准品和水（需要将40倍稀释包含在标准曲线内），使各标准曲线中烟酸终含量0.16~2.0μg ，充分混匀后吸取150μL 到96微孔板（3个重复），同时加入150μL 培养基，样品稀释到适当浓度后，同样加入96微孔板培养44~48h ，于630nm 波长下测定透光率，以标准品烟酸含量为横坐标，透光率为纵坐标，绘制标准曲线。

如图1所示。

标准品（μg）标准品（μL）水（μL）
0 0 1000
0.16 100 900
0.32 200 800
0.64 400 600
0.96 600 400
1. 28 800 200
1.60 500 0
2.00 500 0
图1烟酸标准曲线
8.5结果表述
从标准曲线的公式查得对应试样烟酸的相应含量，对照该样品的稀释倍数和样品称重，可以求得试样的烟酸含量(mg/100g)。

按式（2）进行结果计算，
m f
X
⨯
=
c
(2)
式中：
X ——试样中烟酸含量，单位为毫克每百克（mg/100 g）；
c——试样提取液中烟酸的浓度，毫克每百克（mg/100 g）；
f ——试样提取液稀释倍数；
m ——试样质量，单位为克（g）或（mL）
9其他
本标准试管法线性范围50 ng ~100 ng；96微孔板法线性范围0.16~20.0μg，按样品种类将待测试样稀释到线性范围内再对样品进行测试和计算，96微孔板法的稀释倍数一般较试
管法低。

第二法高效液相色谱法
10原理
高蛋白样品经沉淀蛋白质，高淀粉样品经淀粉酶酶解，在弱酸性环境下超声波振荡提取，果蔬等天然食品经提取后净化浓缩，以C18色谱柱分离，在紫外检测器检测261 nm波长处检测，根据色谱峰的保留时间定性，外标法定量，计算试样中烟酸和烟酰胺含量。

11试剂和材料
注：除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。

11.1试剂
11.1.1盐酸（HCl）,优级纯。

11.1.2氢氧化钠（NaOH）,优级纯。

11.1.3高氯酸（HClO4）：体积分数为60%,优级纯。

11.1.4甲醇（CH3OH ）：色谱纯。

11.1.5异丙醇（C3H8O）：色谱纯。

11.1.6庚烷磺酸钠（C7H15NaO3S）：色谱纯。

11.1.7淀粉酶：酶活力≥1.5 μ/mg。

11.1.8氨水（NH3·H2O）：含量25%—28%,优级纯。

11.2试剂配制
11.2.1盐酸（5.0 mol/L）：用量筒量取吸取415mL盐酸（3.1.1），于1000 mL烧杯中，加585mL水，混匀。

11.2.2盐酸（0.1 mol/L）：用量筒量取吸取8.3 mL盐酸（3.1.1），于1000 mL烧杯中，加991.7mL水，混匀。

11.2.3氢氧化钠（5.0 mol/L）：称取200 g氢氧化钠（3.1.2）至1000 mL 容量瓶中，加水溶解并稀释至1000 mL，混匀。

11.2.4氢氧化钠（0.1 mol/L）：称取4.0 g氢氧化钠（3.1.2）至1000 mL 容量瓶中，加水稀释定容至刻度，混匀。

11.2.5氨水甲醇溶液（1%）：移取1mL氨水（3.1.8）至100 mL 容量瓶中，用甲醇（3.1.4）稀释定容至刻度，混匀。

11.2.6流动相：甲醇（3.1.4）70mL，异丙醇（3.1.5）20mL，庚烷磺酸钠（3.1.6）1g，用910mL水溶解并混匀后，用高氯酸（3.1.3）调pH值至2.1±0.1，经0.45μm膜过滤。

11.3烟酸和烟酰胺标准溶液
烟酸（C6H5NO2）和烟酰胺（C6H6N2O）：纯度＞99 %
11.3.1烟酸和烟酰胺标准储备液（1.000 mg/mL）：准确称取烟酸及烟酰胺标准品各0.05g （精确到0.1mg），分别置于100mL容量瓶中，用水溶解，定容至刻度，混匀（4℃冰箱中可保存1个月）。