食品安全国家标准 食品中烟酸和烟酰胺的测定

食品安全国家标准

食品中烟酸和烟酰胺的测定

1范围

本标准规定了食品中烟酸和烟酰胺的测定方法。

本标准第一法为微生物法，适用于各类食品包括以天然食品为基质的强化食品中烟酸和烟酰胺总量的测定；第二法为高效液相色谱法，适用于含量较高或强化食品中烟酸和烟酰胺的测定。

第一法微生物法

2原理

烟酸是植物乳杆菌Lactobacillμs plantarμm（A TCC 8014）生长所必需的营养素，在一定控制条件下，将植物乳杆菌液接种至添加试样液的培养液中，培养一段时间后测定透光率，根据烟酸含量与透光率的标准曲线计算出试样中烟酸的含量。

3试剂和材料

除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。培养基可购买符合测试要求的商品化培养基。

3.1试剂

3.1.1盐酸（HCl）。

3.1.2氢氧化钠（NaOH）。

3.1.3氯化钠（NaCl）。

3.1.4浓硫酸（H2SO4）。

3.1.5溴麝香草酚蓝（C27H28Br2O5S）：pH指示剂。

3.1.6乙醇（C2H5OH）。

3.2试剂配制

3.2.1盐酸溶液（1 mol/L）：用量筒量取吸取83 mL盐酸，于1000 mL烧杯中，加917mL 水，混匀。

3.2.2盐酸溶液（0.1 mol/L）：吸取3.2.1盐酸溶液10mL，加水溶解至100mL。

3.2.3氢氧化钠溶液（1 mol/L）：称取40 g氢氧化钠于1000 mL烧杯中，加水溶解并稀释至1000 mL，混匀。

3.2.4氢氧化钠溶液（0.1 mol/L）：吸取3.2.3氢氧化钠溶液10mL，加水溶解至100mL。

3.2.5生理盐水（0.9%）：称取9g氯化钠（NaCl），溶解于1000ml水中，分装10mL于试管中，121℃灭菌15min，备用。

3.2.6乙醇溶液（25%）：量取200 mL无水乙醇与800 mL水混匀。

3.2.7硫酸溶液（1 mol/L）：于2000mL烧杯中先注入700mL水，用量筒量取56mL硫酸沿烧杯壁缓慢倒入水中，用水稀释到1000mL。

3.3培养基

3.3.1乳酸杆菌琼脂培养基：称取光解胨15g，葡萄糖10g，磷酸氢二钾2g，聚山梨糖单油酸酯1g，琼脂10g于1000 mL烧杯中，加入番茄汁100mL，加900mL蒸馏水溶解，混匀，调pH6.8±0.2（25℃），分装10mL于试管中，121℃高压灭菌15min，备用。

3.3.2乳酸杆菌肉汤培养基：称取光解胨15g，葡萄糖10g，磷酸氢二钾2g，聚山梨糖单油酸酯1g，于1000 mL烧杯中，加入番茄汁100mL，加900mL蒸馏水溶解，混匀，调pH6.8±0.2（25℃），分装10mL于试管中，121℃高压灭菌15min，备用。

3.3.3烟酸测定用培养基：维生素测定用酪蛋白氨基酸12g，葡萄糖40g，乙酸钠20g，L-胱氨酸0.4g，DL-色氨酸0.2g，盐酸腺嘌呤20mg，盐酸鸟嘌呤20mg，尿嘧啶20mg，盐酸硫胺素200μg，泛酸钙200μg，盐酸吡哆醇400μg，核黄素400μg，p-氨基苯甲酸100μg，生物素0.8μg，磷酸氢二钾1g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.4g，氯化钠20mg，硫酸亚铁20mg，硫酸锰20mg。加蒸馏水至1000mL，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液（3.2.4）调pH至6.7±0.2（20℃~25℃）。注：自行配制烟酸测定培养基时，所有试剂不得含有烟酸。

3.4标准品

3.4.1（C19H19N7O6）：纯度≥99 .5%。

3.5标准溶液的配制

3.5.1烟酸标准储备液（0.1mg/mL）：精确称取50.0 mg烟酸标准品，用乙醇溶液（3.2.5）溶解并移至500 mL容量瓶中，定容，混匀于2℃～4℃冷藏。此溶液每mL相当于100μg烟酸。

3.5.2烟酸标准中间液（10μg/mL）：准确吸取10.0mL 烟酸标准储备液（3.5.1）置于100 mL 棕色容量瓶中，用乙醇溶液（3.2.5）稀释并定容至刻度，混匀于2℃～4℃冷藏。此溶液每mL相当于10μg烟酸。

3.5.3烟酸标准中间液（1μg/mL）：准确吸取1.0mL 烟酸标准储备液（3.5.1）置于100 mL 棕色容量瓶中，用乙醇溶液（3.2.5）稀释并定容至刻度，混匀于2℃～4℃冷藏。此溶液每mL相当于1μg烟酸。

3.5.4烟酸标准工作液（100ng/mL）：准确吸取5.00 mL烟酸标准中间液（3.2.2）置于50 mL 容量瓶中，用水稀释定容至刻度，混匀于2℃～4℃冷藏。此溶液每mL相当于100ng烟酸。

3.5.5烟酸标准工作液（40ng/mL）：准确吸取0.4mL 烟酸标准中间液（3.5.2）置于100 mL 棕色容量瓶中，用乙醇溶液（3.2.5）稀释并定容至刻度，混匀于2℃～4℃冷藏。此溶液每mL相当于40ng烟酸。

4仪器和设备

4.1天平：感量分别为0.1g和0.1 mg。

4.2均质设备：用于试样的均质化。

4.3恒温培养箱：36℃±1℃。

4.4漩涡振荡器。

4.5压力蒸汽消毒器：121℃(0.10 mPa～0.12 mPa)。

4.6离心机：转速≥2000 rpm。

4.7pH计：精度±0.01。

4.8分光光度计。

4.9超净工作台。

4.10超声波振荡器。

4.11微孔板酶标仪

5菌种的制备与保存

5.1菌种：植物乳杆菌Lactobacillμs plantarμm（ATCC 8014）。

5.2储备菌种的制备

将菌种植物乳杆菌Lactobacillμs plantarμm（ATCC 8014）转接至乳酸杆菌琼脂培养基中，在36℃±1℃恒温培养箱中培养20 h～24 h，取出后放入2℃～4℃冰箱中保存。每月至少传种一次，作为储备菌株保存。

实验前将储备菌株接种至乳酸杆菌琼脂培养基中，在36℃±1℃恒温培养箱中培养20 h～24 h以活化菌株，用于接种液的制备。保存数周以上的储备菌种，不能立即用作接种液制备，实验前宜连续传种2~3 代以保证菌株活力。

5.3接种液的制备

试验前一天，从乳酸杆菌琼脂培养基移取部分菌种于灭菌的10mL乳酸杆菌肉汤培养基（3.3.2）中，于36℃±1℃恒温培养箱中培养6 ~18h。在无菌条件下离心该培养液15min，倾去上清液。加入10mL已灭菌的生理盐水（3.1.3）重新分散细胞，于旋涡混合器上快速混合均匀，离心15min，倾去上清液。重复离心和清洗步骤三次。以第三次细胞分散液中吸取1mL加入10mL已灭菌的生理盐水（3.1.3），使其充分混合均匀制成混悬液，备用。用721分光光度计，在550nm波长下，以0.9％生理盐水为参比，读取该菌悬液的浊度值透光值（％T），用0.9％生理盐水或第三次细胞分散液调整透光值，使其范围在60~80％之间。立即使用。

6试管法

所有操作均需避光进行。

6.1试样制备