中性甲醛固定液的配置

免疫组化技术的关键问题
1.组织处理
恰当的组织处理是做好免疫组化染色的先决条件，也是决定染色成败的内部因素，在组织细胞材料准备的过程中，不仅要求保持组织细胞形态完整，更要保持组织细胞的抗原性不受损或弥漫，防止组织自溶。如果出现自溶坏死的组织，抗原已经丢失，即使用很灵敏的检测抗体和高超的技术，也很难检出所需的抗原，反而往往由于组织的坏死或制片时的刀痕挤压，在上述区域易出现假阳性结果。
组织及时取材
组织标本及时的取材和固定是做好免疫组化染色的关键第一步，是有效防止组织自溶坏死，抗原丢失的开始，离体组织应尽快的进行取材，最好2h内，取材时所用的刀应锐利，要一刀下去切开组织，不可反复切拉组织，造成组织的挤压，组织块大小要适中，一般在2.5cm×2.5cm×0.2cm，切记取材时组织块宁可面积大，千万不能厚的原则，(也就是说组织块的面积可以大到3cm×5cm，但组织块的厚度千万不能超过0.2cm，否则将不利于组织的均匀固定)。固定液快速渗透到组织内部使组织蛋白能在一定时间内迅速凝固。从而完好的保存抗原和组织细胞形态。) x! R; ^" s)
2、固定　
固定是技术室工作的第一步，也是在整个制片过程中无法补救的一步。所谓“固定”，就是组织离体后，用各种办法使其细胞内的物质尽量接近其生活状态时的形态结构和位置的过程。固定的目的是为了防止组织细胞自溶与腐败，防止了细胞内的酶对蛋白质的分解作用，使细胞内的各种成分如蛋白质、脂肪、碳水化合物或酶类转变为不溶性物质，以保持原有的结构与生活时相仿。另外，组织固定后，均呈一定的硬化状态，增加组织韧性，而且不易变形，有利于以后的组织处理。所以组织一旦离体必需及时固定，固定液的量应为组织的4倍。固定的关键主要与固定的及时性、固定液的选择、固定液的浓度、固定的温度和时间有关。
对于固定液的选择，原则上讲，应根据抗原的耐受性来选择相应的固定液，但除非是专项科研项目，在病理常规工作很难做到这一点，因为病理的诊断和鉴别诊断都是在常规HE病理诊断的基础上决定是否进行免疫组化的染色，而HE染色的常规组织处理是采用10%的中性缓冲福尔马林或4%缓冲多聚甲醛4倍于组织体积进行组织固定，利用其渗透性强，对组织的作用均匀进行固定，但组织固定时间最好在l2h内，一般固定时间不应超过24小时。随着固定时间的延长对组织抗原的检出强度将逐渐降低。
1）4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）：该固定液适用于免疫组织化学方法。动物先用此液进行灌注固定，取材后，再

用该液浸泡固定2-24h。
固定液配方1：40g多聚甲醛，溶于1000ml，0.1mol/L的PB液，不容易溶解，放于密封瓶中，60℃温箱过夜即可溶解，也可以加温至60℃，搅拌溶解。
固定液配方2：多聚甲醛 40g，PBS0.1 mol/L PH 7.4 500 ml ，混合后加热至60℃，搅拌并滴加1N NaOH 至清亮为止，冷却后加PBS 至总量1000 ml。注固定时间24小时。
2）4%多聚甲醛-磷酸二钠/氢氧化钠液：该固定液适用于光镜和电镜免疫组织化学方法。用于免疫电镜标本时，应加入新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5-1%。此固定液性质温和，可长期保存组织。
固定液配方：甲液-多聚甲醛40g，蒸馏水400ml；乙液-NaH2PO4?2H2O 16.88g，蒸馏水300ml；丙液-NaOH3.86g，蒸馏水200ml。先将甲液中多聚甲完全溶解，乙液倒入丙液混合后倒入甲液，用1mol/LNaOH或1mol/L HCL将pH调至7.2-7.4。补充蒸馏水至1000ml，充分混合后，4℃保存。
3）中性缓冲甲醛液：对大多数抗原保存较好，是免疫组织化学最常用的固定液，组织穿透性好，组织收缩小。最常用的固定液，能满足常规HE及免疫组化、PCR等工作。一般无特殊要求的病理标本均适用。尤其值得注意的是，中性甲醛是以pH 7．2～7．4的磷酸缓冲液为溶剂配制的，其固定效果及对组织抗原性的保存均优于一般的4％甲醛固定液。此固定液配制后应密封并保存在阴凉处，保存时间固定时间以24h以内为宜，不要超过一个月。
固定液配方1：40%甲醛10ml，0.01mol/L pH7.4的PBS90ml。
固定液配方2：40%甲醛120ml，蒸馏水880ml，磷酸二氢钠（NaH2PO4?H2O）4g，磷酸氢二钠（Na2HPO4）13g。
固定液配方3：甲醛(40%) 100 ml，无水磷酸氢二钠 6.5 g，磷酸二氢钠 4.0g，蒸馏水 900 ml。
固定液配方3：10%中性福尔马林固定液1000ml，Na2HPO4?12H2O 16.3g，NaH2PO4?2H2O 4.5g，福尔马林100ml。
3、样品的：
组织标本固定于4%多聚甲醛中，4℃过夜后，移入PH7.4 ，0.O1MPBS,4 ℃过夜，换液1次，置低温冰箱-40℃冷藏保存待测。
4、样品的渗透和包埋：
注入30%蔗糖4℃渗透至组织沉底，用包埋剂包埋，切片。
5、切片的保存：可放在-20℃冷藏保存待测。
二、免疫组化：
（1）抗原修复6 p#
1)抗原热修复% ?& g! r5 N& D- T' b
在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
2)煮沸热修复 , b- v# B$ }# J* v
电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片

加热10~15分钟。
3)微波热修复 9 U2 x" K. i& y; O* J1 z2 E
在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。
4)酶消化方法
常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。
（2）免疫组织化学染色 3 Z. C/ S4 `. {! g9 I
SP法
1)水化；
2) PBS洗2～3次各5分钟；7 E4 G& Y9 K% a A! S+ \
3)3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟* l9 M( A; d' g- q3 @2 p7 W
4)PBS洗2～3次各5分钟； : i2 u) W+ ?6 U1 i8 Y2 g
5)抗原修复；; V3 j7 N5 l! F
6)PBS洗2～3次各5分钟；& `4 {' G/ Q2 a" C" N* [9 P
7)滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。
8)滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。
9)4℃过夜后需在37℃复温45分钟。0 I. C, V/ X6 y# [
10)PBS洗3次各5分钟；
11)滴加Ⅱ抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时；
12)抗中可加入0.05%的tween-20。3 }$ [$ P& f6 C/ u: c1 R
13)BS洗3次各5分钟；0 g# {7 u6 x8 E# W" P
14)DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度；
15)PBS或自来水冲洗10分钟；
16)苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；
17)自来水冲洗10～15分钟；& T ]4 I7 P' r( B$ X
18)脱水、透明、封片、镜检。
SABC法 * {1 x$ v- r+ A2 A! ~
1)脱蜡、水化。5 R8 K/ ]! S4 ~; h2 B3 S
2)PBS洗两次各5分钟。6 Y- C" `; E F( i+ E8 X
3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。+ s8 o, P8 k$ g2 t, w
4) 抗原修复。
5) PBS洗5分钟。* `: y2 Z6 D! K4 p( }
6) 滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。 l8 n; Z8 v) Z- Q
7) 滴加Ⅰ抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟）。9 T" n* |$ R% C1 P6 _! q
8) PBS洗三次每次2分钟。
9) 滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分钟。
10)PBC洗3次每次2分钟。# m% h; X/ M% g" a
11)滴加试剂SABC，20℃～37℃20分钟。" S3 I/ |6 u% i; k0 g
12)PBS洗4次每次5分钟。
13)DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。
14)蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。 $ R" g! @1 Q- u
15)脱水、透明、封片、镜检。
三、组织固定的注意事项
1．及时取材：由于甲醛对组织的平均穿透速度只有0.8 mm/h，因此手术切除的送检标本应及时切开进行取材，以便保证重

要的镜检部位能及时地得到固定。
2．及时固定：完成取材的组织块应立即投入固定液以便尽可能地保存组织细胞的形态结构和抗原性。
3．液量充分：一般情况下要求固定液的量应为组织体积的6～10倍。
4．适度固定：现代固定的要求是，在良好保存组织细胞形态结构的同时尽可能较好地保存组织细胞的抗原性。长时间的固定会导致某些组织抗原性的逐渐丧失，因此，适时固定可以在保存细胞结构和抗原性之间取得必要的平衡。对于较大的送检标本而言，在及时切开固定的基础上，应尽可能在24 h以内取材进入组织脱水程序。
5．适宜温度：低温可以降低固定的速度，反之可以加快固定进程。在自动组织脱水机上可以施加恒定的温度使得在有限的时间内可以完成固定过程。一般情况下应将固定温度控制在36-38℃。
6．适当搅拌：在自动组织脱水机上可以通过使用搅拌和试剂循环功能使固定过程在标本与试剂充分接触的条件下完成。










中性甲醛液（混合固定液）

甲醛（浓）120ml，加蒸馏水880ml,磷酸二氢钠（NaH2PO4?H2O）4g，磷酸氢二纳（Na2HPO4）13g。此液固定效果比单纯10％福尔马林要好。